具转染力的分子的制作方法

专利名称：：具转染力的分子的制作方法基因转移技术已成为令人十分感兴趣的一个领域。从基因调控和重组蛋白质的生产到基因治疗，把一外源基因引入细胞中(即转染)可带来许多重要的科学及医学上的应用。病毒已进化而能越过基因转移的不同细胞屏障并已的确成为转染所选择的载体。目前，许多病毒，包括反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒，已经遗传工程处理而携带治疗基因，用于人的临床基因治疗尝试。然而，仍然存在着感染及免疫反应的危险，而大规模的病毒生产则耗时费力。由于这许多原因，人们已开发出了非病毒性系统来把DNA携带入细胞中，例如基于阳离子脂质，商业名称为LipofectinTM的二油酰氧基丙基三甲基铵的转染技术(Felgner等人，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA，84，7413-7417，1987)。由于发现了这种转染技术，已经合成出了更多的阳离子脂质，其中一些作为实验室使用的转染试剂是商业上可得到的DOGS(TransfectamTM)、DOSPA(LipofectamineTM)、DOTAP(DOTAPTM)。不过，显然在非病毒性基因传递系统的研制方面取得了重要进展，但仍然存在着对更为有效技术的需求。因为合成系统的转染效率通常低于病毒载体的效率。另外，在体内还存在着许多问题，而非病毒性系统在生物液中的稳定性差，不能使体内有较高的转染再现水平。用寡核苷酸如DNA转染细胞可用于，例如在宿主细胞或生物体中表达通常不被该细胞或生物体表达的蛋白质。比如，可把称为质粒的自主复制DNA分子引入通常并不含该质粒的细胞中，以期在该细胞中表达标记基因产物，或者表达所感兴趣的蛋白质，如随后从该细胞中收获的重组蛋白质(见Sambrook等人，分子克隆实验手册，第2版(冷泉港，1989)，第1章)。把寡核苷酸转染入细胞中也可以用于治疗方面。例如，通过Watson-Crick碱基配对可把曾存在于细胞或细胞核中的反义寡核苷酸结合到靶单股核酸分子上，或者可通过Hoogsteen碱基配对将其结合在双股核酸上，这样做可通过下列机制之一破坏靶的功能通过阻止正常转录、剪接或翻译所需因子的结合；通过激发由RNA酶H所引起的mRNA的酶解，或者是通过由直接与反义寡核苷酸连接的反应性基团而引起的靶的破坏。(见Zamecnic等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75280-284)。基因治疗或基于DNA的接种为其它治疗应用。把蛋白质及其它阴离子大分子转移入细胞中用于治疗及筛选用途。例如，通过把致免疫蛋白质引入细胞中可提高免疫作用，这样其就可以更为有效地加工并呈现在细胞表面，从而促进致免疫反应。使在细胞内部发挥作用的负电荷阴离子大分子通过疏水细胞膜转移至其发挥效应的细胞质中。提高或阻碍DNA转录的那些因子可用于筛选试验中，以证实所感兴趣的基因的转录。对于在筛选化合物以确定其对特定的大分子如细胞受体的效应方面，这些转录测定是人们极为熟悉的。根据本发明我们发现，把脂质结合到碱性、膜扰乱性肽上可产生新的化合物，该化合物可结合多核苷酸和阴离子大分子并可用于细胞的转染。于是，一方面，本发明涉及新的化合物，该化合物为脂质与碱性、膜扰乱性肽的轭合物，也是具转染力的分子。术语“轭合物”意指由与肽化学结合的脂质所组成的化合物，比如，通过出现或连接于脂质上的硫原子与出现或连接于肽上的硫原子二者之间形成的二硫键；或者是通过出现或连接于脂质上的羧基与肽的氨基之间形成的酰胺键。此处使用的术语“脂质”包括直链、支链、饱和或不饱和脂族羧酸及磷脂。脂族羧酸的实例为月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸以及(CH3(CH2)n)2CHCOOH，其中n为从3-19的整数。磷脂的实例有磷脂酰乙醇胺，如二油酰磷脂酰乙醇胺。术语“碱性肽”意指至少含一个碱性氨基酸的肽。该碱性氨基酸的实例是天然及非天然的二氨基单羧酸，如α，β-二氨基丙酸、α，γ-二氨基丁酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和对-氨基苯丙氨酸。术语“膜扰乱性肽”意指干扰膜屏障功能的胞溶性或抗菌肽(G.Saberwal和R.NagarajBBA1197109-131，1994)。碱性、胞溶肽的实例是蜂毒素、溶血素、mastoparan、bombolitin、crabrolin、及其衍生物。碱性抗菌肽的实例有杀菌肽、爪蟾抗菌肽、短杆菌肽S和短杆菌酪肽及其衍生物或类似物。术语“类似物”指其中有一个或多个氨基酸残基缺失或者已被另一个氨基酸残基置换并基本上未改变所述原始肽的生物活性的肽。术语“衍生物”指肽类，其中末端羧基已被酯化，尤其是形成了低级烷基的酯，如甲基及乙基酯；或者转化为酰胺、低级烷基酰胺或二-低级烷基酰胺或肼。术语“低级”意指含1-6个碳原子的基团。因此，一方面，本发明的新化合物为具下式的化合物(R-CONH)n-R3I其中，R为直链或支链、饱和或不饱和脂族羧酸的烃基部分，或为具自由价键的磷脂部分；R3为在一个或两个碳原子处具自由价键的碱性膜扰乱性肽；n为1或2。n优选为1。特别优选的化合物为具下式的化合物其中，X为C2-10亚烷基，R1及R2分别为C12-20脂族羧酸的酰基部分，而R3定义如上。术语“C12-20”指一些从12-20的碳原子。酰基部分R1及R2可以是直链或支链、饱和或不饱和部分。这种基团的实例为月桂酰、棕榈酰、硬脂酰和油酰。在优选方面，R1及R2为油酰。X优选为亚乙基、亚丙基或亚癸基(decamethylene)。在另一个优选方面，本发明涉及具下式的新化合物(R-S-S)n-R3II其中，R、R3及n具上述含义。在式II的化合物中，n优选为1。更优选的是下式的化合物其中，R1、R2、R3及X定义如上。最优选的R3为残基-(CH2)-CH(NH2)-CO-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-A1a-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2。另一方面，这项发明涉及制备如上定义的新化合物，即脂质与碱性、膜扰乱性肽的轭合物的方法，以及组合物，该组合物含有至少一种这样的化合物、多核苷酸或其它任何阴离子大分子、以及，可选择地，含有辅助脂质和/或短链磷脂、和/或阳离子脂质或本发明轭合物(即式I或II的化合物)之外的另一种已知的具转染力的分子。另一方面，本发明还涉及含下列成分的组合物脂质与碱性、膜扰乱性肽的轭合物，及辅助脂质和/或短链磷脂、和/或阳离子脂质或除本发明轭合物，如式I或II的化合物之外的另一种已知的具转染力的分子。本发明进一步涉及利用该新化合物作为载体以多核苷酸或其它任何阴离子大分子来转染细胞。由本发明提供的化合物的制备方法如下使分子式为R3NH2的肽与分子式为R-COOH的脂质反应；或者使分子式为R3SH的肽与分子式为R-SY的脂质反应，其中Y为离去基团如2-吡啶硫。这些反应可用原本已知的方式进行。这样，在缩合剂如二环己基碳化二亚胺的存在下，用类似于产生肽键的方法，通过在适宜的溶剂中使化合物进行反应来实现式R3NH2的肽与式R-COOH的脂质之间的偶联。式R3SH的肽与式R-SY的化合物之间的反应可在适宜的溶解这两种反应物的溶剂或溶剂混合物中进行。可把式R-SY的化合物溶于有机溶剂如氯仿中。把肽R3SH恰当地溶于含水缓冲液如磷酸盐缓冲液中，其含有适量的水溶性有机溶剂如乙腈以完成单相反应系统的形成。式为R-COOH及R-SY的化合物是已知的或可通过已知方法制备，如Biochim.Biophys.Acta862，435-439(1986)中所述。例如，下式的化合物其中，R1及R2为油酰，X为亚乙基、亚丙基或亚癸基；以及下式的化合物其中，R1及R2为油酰、X为亚乙基、Y为2-吡啶硫，商业来源为来自美国阿拉巴马州Alabaster的AvantiPolarLipids的N-琥珀酰-PE、N-戊二酰-PE、N-十二烷基-PE和N-PDP-PE。利用式I或式II的化合物可把任何阴离子大分子转染入细胞中。阴离子大分子是每个分子至少含一个负电荷的大分子。可依据本发明进行转染的阴离子大分子之实例包括多核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)，以及蛋白质，如核糖核酸蛋白及用于免疫的蛋白质，例如病毒蛋白质。用于本发明的DNA之实例为质粒和基因，特别是那些可实施基因治疗方案的质粒及其因，例如囊性纤维变性跨膜调节物(CFTR)、腺苷脱氨酶(ADA)、胸苷激酶(tk)和HLAB7；以及报道基因，如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素转移酶和α-1抗胰蛋白酶。DNA的其它实例为寡脱氧核苷酸及其用作反义、aptamer或“三股螺旋”试剂的类似物。RNA的实例为核糖酶或寡核苷酸反义分子。进行转染的细胞的性质并非极为严格。该细胞可以是原核或真核细胞，哺乳动物或植物细胞。在利用本发明轭合物如式I或II的化合物转染细胞的过程中，在存在适量该化合物的条件下，将细胞与阴离子大分子接触。对于一定量的阴离子大分子来说，轭合物(如式I或II的化合物)的适当量要依前者各自的电荷量而定。轭合物与要进行转染的分子之间的+/-电荷比通常为0.1-10不等，优选为0.5-5。用基团R3中氨基酸上正电荷基团数除以要进行转染的分子之负电荷数，来计算“+/-电荷比”之值。比如，当要进行转染的分子为多核苷酸时，负电荷数则意味着主链中带负电荷的磷酸根的数量。这些范围之中的最佳比率因所要进行转染的细胞而定，可很容易地由本发明所属领域的技术人员来确定。对于一定量的细胞，阴离子大分子的数量为用于转染104细胞的阴离子大分子之数量为0.1ng-10μg，优选为0.2μg-2μg。当阴离子大分子为DNA时，体外转染104细胞的DNA的优选量为0.1μg-10μg。当进行细胞体内转染时，DNA的优选量为0.1μg-1g。在本发明的优选方面，可在辅助脂质和/或短链磷脂、和/或阳离子脂质或除本发明共轭物之外的任何其它已知的具转染力的分子存在的条件下进行转染反应。可以使用任何常用的辅助脂质。辅助脂质是磷脂，当与已知的具转染力分子共同使用时，认为其可以增加大分子向细胞的传递。辅助脂质的实例为磷脂、如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺或其混合物。优选的辅助磷脂为磷脂酰乙醇胺，如二油酰磷脂酰乙醇胺。可以使用任何常用的短链磷脂。短链磷脂为含有脂肪酸残基的磷脂，该脂肪酸残基在其主链中含6-12个碳原子。短链磷脂的实例为携带有两个C6-12脂肪酸残基的磷脂酰胆碱。优选的短链膦脂为二辛基及二辛酰基磷脂酰胆碱。具转染力的分子之实例包括阳离子脂质，如J.B.Behr在生物轭合物化学5382-389(1994)及X.Gao和L.Huang在基因治疗2710-722(1995)中所述；聚阳离子，如A.V.Kabanov及V.A.Kabanov在生物轭合物化学67-20(1995)中所述；肽及多聚体和其它非病毒性传递系统，如F.D.Ledley在人类基因治疗61129-1144(1995)中所述。辅助脂质和/或短链磷脂和/或阳离子脂质或除本发明共轭物之外的另一种已知具转染力的分子，它们的适宜形式为脂质体、胶束、有机或水溶性分散液，或有机或水溶液。式I化合物与辅助脂质之间的最佳摩尔比为0.1-50，优选为1-10。辅助脂质与短链磷脂之间的最佳摩尔比为2-20。式I或II化合物与添加的具转染力之分子之间的最佳摩尔比为0.1-10。对于转染反应来说，把适宜量的本发明轭合物，如式I或II的化合物加入到要转染的分子(例如质粒DNA)中，以加入水溶液中为宜。可选择地，随后加入辅助脂质和，如需要的话，短链磷脂和/或阳离子脂质或除本发明轭合物之外的另一种已知的具转染力的分子，其形式既可以是脂质体、混合性胶束，也可以是有机溶液或水溶性分散液。另外，可把要转染的分子加入含有依据本发明的化合物，辅助脂质及，如需要的话，短链膦脂和/或阳离子脂质或除本发明轭合物之外的另一种已知的具转染力的分子的组合物之中。该组合物可以是固体、液体、半固体或气溶胶形式，适宜的形式有脂质体、混和性胶束，或有机溶液或水溶性分散液。对于患病动物和人中的转染细胞来说，该组合物可以下列途径给药口服、肠胃外用(静注、肌注、皮下、皮内、腹膜内)、脑内、肺内、鼻部、直肠、眼部、心室、血管(导管)及肿瘤内途径。另外，该组合物可经高速嵌塞法施用于皮肤表面。对于转染过程可以本领域技术人员熟知的适宜测试方案加以测定。肽Cys-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2是新颖的，也是本发明的一部分。它可以通过本领域已知的方法进行制备，例如通过下述的固相肽合成法。下列非限制性实施例将进一步说明本发明。实施例1a)肽R3SH的制备在Milligen9050合成仪器上进行续流固相合成，自TentalGelSRAM树脂(0.22毫摩尔/克〔RappPolymereGmbH，Tubingen，德国〕开始，依据如Atherton和Sheppard所述方法，固相肽合成实用方法(牛津IRL出版社，1989)。把碱不稳定性Fmoc基团用于α-氨基的保护。用下列保护基团来保护侧链Arg(Pmc)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Lys(Boc)、Ser(But)及Trp(Boc)。用等量的TPTU(Knorr等人，TetrahedronLett、1989，30，1927-1930)和DIPEA来活化Fmoc-氨基酸(2.5当量)。用DMF中的20％哌啶来完成Fmoc的去保护。用86％TFE、10％EDT、4％H2O的混合物(20ml)来处理Cys(Trt)-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr(But)-Thr(But)-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser(But)-Trp(Boc)-Ile-Lys(Boc)Arg(Pmc)-Lys(Boc)-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-酰胺TentalGelS-树脂(1.1g)，时间为3小时。浓缩反应混合物、倾至乙醚中，过滤收集沉淀物，并自水中冷冻干燥。经制备性HPLC来纯化粗肽。得到纯化的Lys-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2·5TFA。b)式II化合物的制备将由以上段落a)得到的纯肽(34.6mg，10微摩尔)溶于1ml100mM磷酸盐缓冲液、pH6.5与1ml乙腈组成的混合液中。在该溶液中加入溶于2.8ml氯仿的10.6mg1，2-二油酰-Sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-〔3-(2-吡啶硫)丙酸酯〕中。将混合物在室温下搁置1小时，蒸发除去有机溶剂。将剩余溶液用水稀释至2.5ml，过PharmaciaBioteehPD-10柱。用3.5ml水洗脱产物并冷冻干燥。由此得到28.9mg的式IIA化合物，其中R1及R2为油酰，R3为残基-(CH2)-CH(NH2)-CO-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2。ISP-MSM＝3722。实施例2a)将得自实施例1b)中的化合物1.1mg溶于三氟乙醇中，并与溶于氯仿中的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)1.1mg混合。真空干燥混合物，用1ml的30mMTrisCl缓冲液(pH8.5)对剩余的薄膜进行再水化。b)将质粒DNA(10μg)稀释于400μl的30mM、pH8.5TrisCl缓冲液中。而后加入由段落a)中得到的产物20μl，轻轻混合，然后把混合物加入细胞中。表1显示出依据实施例2配制而在实施例lb中得到的混合物的转染效率，以及相同转染条件下两种市售转染载体DOTAP和Lipofectamine在各种细胞系中的转染效率。利用依据实施例2配制而在实施例1b中得到的混合物，DNA剂量对各种细胞系的转染效率的作用如表2所示。数据表明，高剂量的DNA和得自实施例1b的化合物可以用于细胞上而没有任何显著的毒性。表1用实施例1b的化合物与DOPE或阳离子脂质的混合物转染各种细胞系。用编码如该实施例前面所述配制的质粒的β-半乳糖苷酶对细胞进行转染。转染48小时后对β-半乳糖苷酶活性进行测定。结果以每孔μ单位表示。2)可依据生产商的说明书来制备DOTAP和Lipofectamine转染复合体。表2利用增加DNA剂量，以实施例1b的化合物与DOPE的混合物来进行各种细胞系的转染。用编码如本实施例前面所述配制的质粒的β-半乳糖苷酶对细胞进行转染。转染48小时后对β-半乳糖苷酶活性进行测定。结果以每孔μ单位表示。</tables>实施例3a)将由实施例1b)中得到的化合物1.0mg溶于三氟乙醇中并真空干燥。然后用1mlpH6的10mMTris马来酸缓冲液对薄膜进行再水化。b)用190μl的纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。加入由段落a)中得到的产物100μl并轻轻混合。将混合液而后加入至细胞中。表3显示出如上所述配制的实施例1b化合物的转染效率，以及相同转染条件下两种市售阳离子脂质转染试剂DOTAP及DOSPER在各种细胞系中的转染效率。数据表明，与DOSPER和DOTAP相比，实施例1b的化合物介导的荧光素酶活性分别提高了3-40及25-500倍。另外，只有实施例1b中的化合物能够转染悬浮细胞系WEHI231.7，虽然其尚处于低水平。表3用实施例1b的化合物或阳离子脂质转染各种细胞系。用编码如本实施例前述配制的质粒(每孔2μgDNA)的荧光素酶对生长在6孔平板上的细胞进行转染。48小时后对荧光素酶活性进行测定。结果以每g细胞蛋白质的光单位来表示。从每一次测量值中减去本底值。</tables>*)依据厂商说明来制备DOTAP(AvantiPolarLipid公司)或DOSPER(Boehringer-Mannheim)转染复合体。并按5/1重量/重量的阳离子脂质/DNA比率加以使用。实施例4a)把由实施例1b中得到的化合物1.0mg溶于三氟乙醇并真空干燥。而后用1ml的10mM，pH6Tris马来酸缓冲液对薄膜进行再水化。b)用200μl纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。加入段落a)中得到的产物39μl和聚乙烯亚胺水溶液(0.45mg/ml)14μl。用水把混合液调至300μl，轻轻混合，而后加入至292EBNA细胞中。c)用200μl纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。加入由段落a)中得到的产物52μl，用水调至300μl，轻轻混合该混合物，而后加至292EBNA细胞中。d)用200μl纯无菌水稀释10μl的质粒DNA溶液(1mg/ml)。加入56μl的聚乙烯亚胺水溶液(0.45mg/ml)，用水调至300μl，轻轻混合该混合液，而后加入至292EBNA细胞中。表4显示实施例1b化合物、聚乙烯亚胺及其按本实施例前述所配制的混合物的转染效率。数据表明，与实施例1b化合物及聚乙烯亚胺相比，该混合物介导的荧光素酶活性分别提高了250和25倍。表4用实施例1b的化合物、聚乙烯亚胺及其混合物转染292EBNA细胞。用编码按本实施例前述配制的质粒(每孔1μgDNA)的荧光素酶转染生长于6cm平皿中的细胞。48小时后对荧光素酶活性进行测定。结果以每平皿相对光单位来表示。权利要求1.脂质与碱性、膜扰乱性肽的轭合物。2.如权利要求1的轭合物，其为下式的化合物(R-CONH)n-R3I其中，R为直链或支链、饱和或不饱和脂族羧酸的烃基部分，或者为具自由价键的磷脂部分；R3为在一个或两个碳原子处具自由价键的碱性膜扰乱性肽，n为1或2。3.如权利要求2的轭合物，具下式其中，X为C2-10亚烷基，R1及R3分别为C12-20脂族羧酸的酰基部分，R3如权利要求2中的定义。4.如权利要求1的轭合物，具下式(R-S-S)n-R3II其中R、R3及n具有权利要求2中给出的含义。5.如权利要求4的轭合物，具下式其中，R1、R2、R3及X如权利要求2或3中所定义。6.权利要求5的化合物，其中R1及R2为油酰，而R3为残基-(CH2)-CH(NH2)-CO-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2。7.肽，Lys-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2及其衍生物，其中氨基基团受到保护。8.一组合物，其含有至少一种如权利要求1-6任意一项定义的化合物，多核苷酸或任何其它阴离子大分子，及，可选择性地，含有辅助脂质和/或短链磷脂及/或阳离子脂质或除本发明之轭合物之外的另一种已知具转染力的分子。9.一组合物，其含有至少一种如权利要求1-6定义的任意一项中的化合物，以及可选择地，含有辅助脂质和/或短链磷脂和/或阳离子脂质或除本发明之轭合物之外的另一种已知具转染力的分子。10.如权利要求8或9的组合物，其中组分的形式为水溶液或有机溶液，水或有机分散液，或脂质体或胶束。11.如权利要求8或9的组合物，其中组合物形式为固体、液体、半固体或气溶胶。12.使用如权利要求1-6任意一项所定义的化合物，并且可选择地，使用辅助脂质和/或短链磷脂和/或阳离子脂质或除本发明之轭合物之外的另一种已知具转染力的分子，以作为用多核苷酸或任何其它阴离子大分子转染细胞的载体。全文摘要本发明涉及脂质与碱性、膜扰乱性肽的轭合物，特别是具下式的化合物(R-CONH)文档编号C07F9/00GK1163896SQ9710225公开日1997年11月5日申请日期1997年1月16日优先权日1996年1月17日发明者J-Y·里格德勒,A·苏伯萨佐,A·茨斯艾克申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司