专利名称：3－羟甲基头孢菌素的溶剂萃取的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从含水发酵液体培养基获得3-羟甲基头孢菌素浓水溶液的改进工艺。更具体地说，它涉及含水发酵液体培养基中某些3-羟甲基头孢菌素中间体的环已酮萃取，随后反萃到水溶液中，提供所希望的3-羟甲基头孢菌素中间体的浓水溶液。
背景技术：
7-氨基头孢菌素酸(7-ACA)及其各种衍生物是头孢菌素类抗生素生产中的已知重要中间体。7-ACA及其有各种3-位取代基的衍生物可以用已知工艺从发酵衍生的头孢菌素C得到。例如，头孢菌素C向7-ACA的转化可以用已知的化学工艺和酶促工艺进行。
美国专利申请4,533,632描述了一种从含水发酵液体培养基中获得脱乙酰头孢菌素C的工艺，并报告这种产物在头孢菌素衍生物的生产中有优于头孢菌素C的显著优点。
美国专利5,424,196等其它参考文献公开了使含水发酵液体培养基中产生的脱乙酰头孢菌素C转化成含有一个3-羟甲基取代基的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的酶促工艺。
美国专利4,908,444中的Takeda，美国专利5,221,739中的Lilly，和J.Antibiotics 47(1):64-71,1994，公开了一种用乙酸酐使水溶液中的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA乙酰化以产生7-戊二酸单酰ACA的工艺，然后，可以用酶促法使后者高产率地水解成7-ACA。
尽管在会利用从含水发酵液体培养基生产的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的酶促7-ACA工艺方向上已经取得了进展，但这样一种工艺仍然不是商业上可行的。一个严重的问题是，脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA是以低浓度(～1-3％)从发酵液体培养基中得到的，而且在这些浓度上不能用先有技术方法经济地进行乙酰化。例如，据以上提到的Lilly专利和J.Antibiotics文章报告，乙酰化反应在高浓度、较好10％以上的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA时工作得最好。迄今为止，还不可能从脱乙酰头孢菌素C发酵液体培养基中得到足以使含水乙酰化步骤能商业上可行的浓(≥10％重量/体积)脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA水溶液。
美国专利3,573,296和3,830,809中公开了一种有如下化学式的相关头孢菌素C衍生物，即N-carbisobutoxy头孢菌素C，
及其双二环己胺盐，作为7-ACA化学合成的有用衍生物。N-carbisobutoxy头孢菌素C这种中间体在本文中和权利要求书中称为“头孢菌素D”。为了利用高效价脱乙酰头孢菌素C发酵方面改进(见诸如美国专利4,533,632)的优势而用头孢菌素D来生产7-ACA，有必要首先使该液体培养基中产生的脱乙酰头孢菌素C按照美国专利3,573,296的通用程序用氯甲酸异丁酯酰化而转化成下式的脱乙酰头孢菌素D
然后，这样产生的脱乙酰头孢菌素D还需要按照美国专利4,908,444和5,221,739的通用程序用乙酸酐进行乙酰化，以给出头孢菌素D。这种产物可以像美国专利3,830,809中公开的那样方便以双二环己胺盐形式分离。
然而，如同在以上讨论的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的乙酰化的情况下一样，乙酰化步骤需要高浓度(≥10％重量/体积)的脱乙酰头孢菌素D才是成本有效的。而且，如同在脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的情况下一样，也还没有任何实用方法能以如此高浓度从发酵液体培养基中得到脱乙酰头孢菌素D。
已经有多种多样的有机溶剂用于从含水发酵液体培养基中萃取头孢菌素产物，例如，乙酸正丁酯、二氯甲烷、甲基·异丁基酮、氯仿和乙酸乙酯。美国专利3,835,129提到，环己酮曾被认为是一种良好的N-酰基头孢菌素C萃取溶剂，但它当用于大规模作业时产生乳液问题。美国专利4,168,375在头孢菌素C的磺酰胺衍生物的一份可能萃取溶剂清单中公开了环己酮，但没有提到3-羟甲基头孢菌素的萃取。在美国专利3,986,644中用环己酮萃取某些头孢菌素C亚磷酰胺衍生物，但也没有提到3-羟甲基头孢菌素。
本发明者等人已经发现，脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA和脱乙酰头孢菌素D等3-羟甲基头孢菌素，难以或不可能用N-封端头孢菌素C等其它头孢菌素化合物常用的有机溶剂萃取，但按照本发明的工艺用环己酮作为萃取溶剂使得能从发酵液体培养基中得到足够的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D水溶液，从而能经济地实施以上所述乙酰化步骤，得到7-戊二酸单酰ACA和头孢菌素D，然后用已知程序把它们转化成7-ACA。
发明概要本发明提供一种从以较低浓度含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D的水溶液、较好的是含水发酵液体培养基、最好的是加工的发酵液体培养基制备脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D的浓(≥10％重量/体积)水溶液的工艺，该工艺包括下列步骤(a)提供一种含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D的水溶液、较好的是发酵液体培养基、最好的是加工的发酵液体培养基；(b)使该溶液在约1.5～约3的pH与环己酮接触，从而把脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D萃取到环己酮溶剂相中；(c)使环己酮溶剂相与水相分离；(d)使环己酮相在约5～约7.5的pH与水相接触；和(e)分离含有所希望的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D浓水溶液的水相。
发明详细说明如以上所指出的，进行商业规模上从脱乙酰头孢菌素C制备7-ACA的酶促工艺要求关键乙酰化步骤，即脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的乙酸酐水乙酰化而成为7-戊二酸单酰ACA的步骤的经济产率。这个步骤的经济产率取决于使用脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA起始原料的浓(≥10％重量/体积)水溶液。然而，当从发酵液体培养基得到这种原料时，它以低得多的浓度存在于液体培养基中，其量为～1-3％(重量/体积)，因此，有必要从发酵液体培养基中萃取脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA并将其浓缩，以使乙酰化步骤变得实用和能与制备7-ACA的化学合成方法竞争。
类似地，在用已知中间体头孢菌素D通过传统化学合成路线得到7-ACA时，高度理想的是利用最近在高效价脱乙酰头孢菌素C发酵方面的改进，即把发酵期间产生的脱乙酰头孢菌素C转化成脱乙酰头孢菌素D，然后从含水液体培养基中以高浓度(≥10％重量/体积)萃取这种材料，从而导致与乙酸酐的水乙基化反应步骤，以高产率给出头孢菌素D产物。
在一个较好的实施方案中，本发明工艺用一种含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D的加工发酵液体培养基作为起始原料。这里使用的“加工发酵液体培养基”这一术语，系指已经用诸如美国专利5,424,196中公开的那样的酶促工艺转化成含脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA，或者已经进行了化学转化，例如用氯甲酸异丁酯酰化而成为含脱乙酰头孢菌素D的液体培养基的脱乙酰头孢菌素C发酵液体培养基。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D必须以可回收量存在于加工的液体培养基中，而且一般以约1～3％(重量/体积)的相当低浓度存在。加工的液体培养基可以直接使用，或在遭遇了pH调整和过滤等纯化步骤之后使用。这种加工的液体培养基也可以用一根或多根树脂柱进行处理以进一步使之纯化；这后一种含水介质有时称为“树脂洗脱液”。
让该水溶液，较好的是一种加工的发酵液体培养基，与作为萃取溶剂的环己酮接触，并搅拌或以其它方式与该液体培养基激烈混合，以给出两个溶剂相。在用环己酮萃取之前或期间，用一种无机酸如硫酸、硝酸或盐酸把该溶液或混合物调整到约1.5～约3、较好约2的pH。环己酮萃取步骤的温度不是决定性的，但较好的是在约0℃～约室温的范围内、最好在约5～10℃的范围内的某一温度做萃取。萃取之后，水相可以再次用环己酮萃取，以获得额外量的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D，将环己酮层合并。环己酮萃取导致从液体培养基中萃取出高百分率、通常90％以上的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D。
由于产生7-戊二酸单酰ACA或头孢菌素D的乙酰化步骤是在含水条件下进行的，因而有必要用水反萃含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D的环己酮层，给出所希望的浓水溶液。使环己酮相与水相分离，并在约5～约7.5范围内的pH与水接触，再次给出两个溶剂相，此时水相含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D。把这两个溶剂相分离，给出所希望的水溶液。此步骤中pH调整用的碱不是决定性的，但较好的是使用一种乙酸盐缓冲剂例如乙酸钠或钾。这个萃取步骤的温度可以与环己酮萃取步骤使用的温度相同。用水反萃给出回收于水相中的、再次超过90％的高产率脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D。
本发明工艺提供≥10％浓度的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D水溶液。10～20％(重量/体积)范围内的浓度是可达到的，且15％浓度是容易达到的，且较好用于随后的乙酰化步骤。组合在一起的萃取和随后的反萃工艺使得能脱除发酵盐类以及浓缩脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D。
如以上提到的，已发现环己酮是脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA和脱乙酰头孢菌素D等3-羟甲基头孢菌素的一种独特萃取溶剂。常用来从发酵液体培养基中萃取N-封端头孢菌素C等其它头孢菌素中间体的有机溶剂不适用于3-羟甲基头孢菌素。为了说明这一点，以下各表显示了用各种各样工业溶剂萃取的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA和脱乙酰头孢菌素D的百分率。
(加工的发酵液体培养基中)脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的萃取溶剂 萃取％甲基·异丁基酮 5乙酸正丁酯 1乙酸正丁酯/正丁醇(20％)17正丁醇 52.5乙酸乙酯 8.4环己酮 72.5(3次萃取后98％)
(加工的发酵液体培养基中)脱乙酰头孢菌素D的萃取溶剂 萃取％甲基·异丁基酮45.6乙酸正丁酯13.4乙酸正丁酯/正丁醇(6％)67乙酸乙酯 75.8环己酮88.4环己酮显然是最好的萃取溶剂，尽管在脱乙酰头孢菌素D的情况下乙酸乙酯和乙酸正丁酯加丁醇萃取得很好。然而，预料乙酸乙酯的溶剂回收效果不好，因为乙酸乙酯容易水解成乙醇和乙酸。反萃液中丁醇等醇的存在会干扰随后的乙酰化步骤。也已发现，用环己酮作为萃取溶剂显著减少了脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的内酯化。本发明的总萃取/反萃工艺给出10倍以上浓度的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA或脱乙酰头孢菌素D，而且所得到的浓水溶液可与水乙酰化反应工艺兼容而无需进一步加工。
以下实例用来说明本发明。
实例12.7％脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA水溶液(1180ml)和环己酮(1180ml)搅拌，添加6N HCl，把混合物调至pH2.0。把该混合物转移到分液漏斗中萃取。分层，保留环己酮层。水层再用新鲜环己酮(2×1000ml)萃取。合并的环己酮层(3220ml)进行评估，得到一种0.928％溶液。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的萃取效率为92％。含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA(0.928％)的环己酮萃取物(3215ml)用4.0M乙酸钠(NaOAc)(90.0ml)反萃。该混合物的初始pH从pH2.4上升到pH5.87。分层，使得能以18.1％浓度提供水层(151.5ml)。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的反萃以92％效率完成。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA萃取的总效率是84％。
实例22.48％脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA水溶液(910ml)和环己酮(910ml)搅拌，添加6N HCl把该混合物从pH7.2调到pH2.0。把该混合物转移到一个分液漏斗中萃取。分层，保留环己酮层。水层再用新鲜环己酮(2×910ml)萃取。合并的环己酮层(2825ml)进行评估，得到一种0.77％溶液。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的萃取效率为96％。含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA(0.77％)的环己酮萃取物(2822ml)再用4.8M乙酸钾(KOAc)(60.0ml)反萃。该混合物的初始pH从pH2.5上升到pH6.45。分层，使得能以14.1％浓度提供水层(122.5ml)(79％)。用1.0M KOAc(2×7.0ml)反萃给出合并水层(18.2ml)(7.6％)。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的反萃是以87.6％效率完成的。脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA萃取的总效率是84％。
实例3实验室规模利用含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA溶液的氧化超滤器(UF)渗透液使用一台Delaval分离器，过滤的含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA(2.41％)的发酵液体培养基(10.19L)在pH2.0用环己酮(10.19L)萃取。每次萃取均以1.9L规模进行。新鲜渗透液用来自前一次萃取的富环己酮萃取，以模拟连续萃取。来自最终溶液(1.18％)的一部分富环己酮(3830ml)用4.0M NaOAc(150ml)反萃，给出一种脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA水溶液(250ml)(16.3％)。反萃是以90％效率完成的。
实例4A．分液漏斗萃取脱乙酰头孢菌素D溶液(17.88g,37.76mmol,1.9L)与环己酮(945ml)一起搅拌(5℃)。该溶液用盐酸(6N,86.0ml)从pH7.18调整到pH2.27。该两相混合物搅拌5分钟，观察到pH2.18。混合物转移到分液漏斗中，分层。过滤除去少量白色乳液。环己酮层(750ml)和水层(2195ml)各采样供HPLC分析。以77.5％产率得到脱乙酰头孢菌素D环己酮溶液(18.5g/L)。水溶液含有其余脱乙酰头孢菌素D(0.76g/L,9.4％)。物料平衡是86.9％。
B.用Delaval分离器萃取为便于操作，把脱乙酰头孢菌素D溶液(4.025L)分成两份。一份脱乙酰头孢菌素D溶液(17.36g,36.66mmol,2.0L)与环己酮(1.0L)一起搅拌(5℃)。此溶液用盐酸(6N,78.0ml)从pH7.7调整到pH2.5。此两相混合物搅拌5分钟。另一份脱乙酰头孢菌素D溶液(17.58g.37.13mmol,2.025 L)与环己酮(1.0L)一起搅拌(5℃)。此溶液用盐酸(6N,90.0ml)从pH7.86调整到pH2.57。此两相混合物搅拌5分钟。两种混合物都转移到一台Delaval分离器上，使有机相与水相分离。有少量白色固体存在于环己酮层中。环己酮层(1710ml)和水层(4020ml)各采样供HPLC分析。以87.7％产率得到脱乙酰头孢菌素D环己酮溶液(17.92g/L)。水溶液含有其余脱乙酰头孢菌素D(0.86g/L,9.9％)。物料平衡是97.6％。
C．反萃到水中脱乙酰头孢菌素D环己酮溶液(13.86g,29.27mmol,750ml)与乙酸钠(2.0M,124ml)一起搅拌(10℃)。此溶液搅拌时pH从pH2.13上升到pH5.77(35分钟)。此溶液转移到分液漏斗中分离。水层(170ml)和环己酮层(690ml)各采样供HPLC分析。以92.5％产率得到脱乙酰头孢菌素D在缓冲剂水溶液中的溶液(75.4g/L)。环己酮溶液含有残留脱乙酰头孢菌素D(0.46g/L,2.3％)。物料平衡是94.8％。
权利要求
1．一种从含有较低浓度脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的水溶液制备脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的浓(≥10％重量/体积)水溶液的工艺，该工艺包括下列步骤(a)提供一种含有脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA的水溶液；(b)使该溶液在pH为约1.5～约3与环己酮接触，从而使脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA萃取到环己酮溶剂相中；(c)使环己酮溶剂相与水相分离；(d)使环己酮相与水在pH为约5～约7.5接触；和(e)使含有所希望的脱乙酰-7-戊二酸单酰ACA浓溶液的水相分离。
2．权利要求1的工艺，其中，步骤(a)的水溶液是一种加工的发酵液体培养基。
3．权利要求1或权利要求2的工艺，其中，步骤(d)包括使用一种乙酸盐缓冲剂。
4．一种从含有较低浓度脱乙酰头孢菌素D的水溶液制备脱乙酰头孢菌素D的浓(≥10％重量/体积)水溶液的工艺，该工艺包括下列步骤(a)提供一种含有脱乙酰头孢菌素D的水溶液；(b)使该溶液在pH为约1.5～约3与环己酮接触，从而使脱乙酰头孢菌素D萃取到环己酮溶剂相中；(c)使环己酮溶剂相与水相分离；(d)使环己酮相与水在pH为约5～约7.5接触；和(e)使含有所希望的脱乙酰头孢菌素D浓溶液的水相分离。
5．权利要求4的工艺，其中，步骤(a)的水溶液是一种加工的发酵液体培养基。
6．权利要求4或权利要求5的工艺，其中，步骤(d)包括使用一种乙酸盐缓冲剂。
全文摘要
头孢菌素中间体,即脱乙酰－7－戊二酸单酰ACA和脱乙酰头孢菌素D,是从以不太浓形式含有所述中间体的水溶液中通过利用环己酮的溶剂萃取然后反萃到水中而以浓水溶液形式得到的。中间体浓水溶液呈一种可以用于利用已知程序生产7－ACA的形式。
文档编号C07D501/28GK1226250SQ97196848
公开日1999年8月18日 申请日期1997年7月18日 优先权日1996年7月29日
发明者G·M·F·利姆, J·M·劳比, V·H·奥迪尔 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司