一种丝状真菌发酵专用淀粉衍生物的制备及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种丝状真菌发酵专用淀粉衍生物的制备及应用。具体而言，本发明涉及DE值为0.1-3，粘度为1-100cp的淀粉衍生物、其制备方法，以及使用这些淀粉衍生物来发酵丝状真菌、控制丝状真菌发酵时的形态，以及含有所述淀粉的丝状真菌发酵用培养基。本发明的淀粉衍生物粘度低，即使高温灭菌后粘度也不会明显增加，在与发酵培养基混合灭菌后，形成细微的颗粒，有利于形成游离的菌丝体。
【专利说明】一种丝状真菌发酵专用淀粉衍生物的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及丝状真菌发酵专用淀粉衍生物的制备及应用。
【背景技术】
[0002]丝状真菌在液体深层发酵过程中，通常会形成三种形态，即:致密菌丝球，疏松菌丝团及游离菌丝体，其中菌丝球及游离菌丝对目的产物的影响研究比较多，适宜的菌丝形态可大幅提高其目的产物量(Kaup et al., 2007 ；Petzoldt, 1971 ；Zhang et al., 2007 ；Znidarsic和Pavko, 2001)。例如，致密菌丝球有利于衣康酸(Metz, 1976)、梓檬酸发酵(Gomez et al.，1988),而游离菌丝体适宜于外源蛋白表达及分泌(Papagianni和Mattey, 2006)，如a_淀粉酶、植酸酶和β _呋喃果糖苷酶(Teng et al.，2009)，以及青霉素的发酵(Vecht-Lifshitz et al.，1990)。因此,发酵过程中控制菌丝的形态对目的产物的发酵非常关键。
[0003]目前，控制发酵过程中菌丝形态的方法主要有调节接种量，搅拌速率或将pH降为 2-3 (Booking et al., 1999 ；Mcintyre et al., 2001 ；Niel sen, 1996 ；Papagianni andMattey, 2006);或者加分散剂如滑石粉，氧化铝等(Kaup et al.，2007);诱变育种改变菌丝形态(DeNicolas-Santiago et al., 2006 ；ffang et al.，2005)等方法。但实际上很多方法并不十分有效，比如，在极端pH(2-3)条件下，很多酶不稳定，甚至失活，并且有的丝状真菌本身在此PH条件下就生长很差，甚至无法生长，因此也无法表达蛋白；过高的搅拌转数不仅增加能耗，且易打 断菌丝，过多菌丝片段不仅影响产酶，且易造成发酵液粘度过高，造成溶氧不足。此外，添加滑石粉等方法也只适合个别丝状真菌，至于诱变育种获得游离菌丝体的方法更是工作量巨大，几率极低。
[0004]其次，在以淀粉为碳源的微生物发酵过程中，因淀粉糊化后粘度较大，不论在初始培养基中的添加量还是在流加过程中，淀粉的添加浓度都很低(浓度2%普通淀粉糊化后粘度已较高)，粘度较高会造成流加体积很大或碳源过低，从而不利于发酵，目前通常的解决方法都是添加淀粉酶或先将淀粉液化，不仅增加工艺步骤，而且增加成本。
[0005]本发明基于制备可溶性淀粉的过程中，获得一种粘度动力学曲线变化甚微的淀粉衍生物，将其用于丝状真菌发酵产脂肪酶，发现以该淀粉衍生物配置的培养基(淀粉衍生物浓度为6-40%)流动性很好，发酵液粘度相对比较低，且发酵过程中菌体形态始终保持游离状的菌丝体。
【发明内容】
[0006]本发明人经过深入地研究，首次发现具有一定DE值、粒径中间值和粘度的淀粉衍生物特别适合用于丝状真菌发酵。具体而言，本发明人首次发现，DE值为0.1-3和粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物(更优选地，粒径中间值为1-30 μ m)，在高温灭菌后不会因淀粉糊化而形成很高的粘度，即使该淀粉衍生物浓度高达400g/L的溶液中，高温灭菌冷却后，也不会形成很强的凝胶，流动性很好。这类淀粉衍生物不仅利于提高初始培养基中淀粉含量，且也可采用较高淀粉浓度流加发酵。将其与发酵培养基混合灭菌时，由于培养基中各种离子的存在，该混合物灭菌后，会形成细小的微粒，该微粒在丝状真菌孢子萌发时起到分散作用，使丝状真菌在发酵过程中始终以游离分散的菌丝体存在，有利于提高外源蛋白的表达量，由此而完成本发明。
[0007]因此，本发明提供一种使用丝状真菌进行发酵的方法，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培养基进行发酵，其中，所述淀粉衍生物DE值为0.1-3，粘度为1-lOOcp。
[0008]本发明还提供一种控制丝状真菌发酵时的形态的方法，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培养基进行发酵，从而控制丝状真菌在发酵时以游离菌丝体形态存在，其中，所述淀粉衍生物DE值为0.1-3，粘度为1-1OOcp。
[0009]本发明还提供DE值为0.1-3和粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物在丝状真菌发酵中的应用。
[0010]本发明还提供DE值为0.1-3和粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物在制备丝状真菌发
酵用的培养基中的应用。
[0011 ] 在上述方法和应用的实施例中，所述淀粉衍生物的粒径中间值为1-30 μ m。
[0012]在上述方法和应用的实施例中，所述丝状真菌选自:黑曲霉、米曲霉、米黑根毛霉、李氏木霉、雪白根霉、华根霉、少根根霉和唐德链霉菌。 [0013]在上述方法和应用的实施例中，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆类淀粉的淀粉衍生物，或是这些淀粉衍生物的混合物。
[0014]在上述方法和应用的实施例中，所述培养基含有2~40wt %的所述淀粉衍生物。
[0015]在上述方法和应用的实施例中，所述培养基含有5~25wt %的所述淀粉衍生物。
[0016]在上述方法和应用的实施例中，所述培养基含有葡萄糖、磷酸二氢钠、硫酸铵、柠檬酸钠、NaNO3、MgSO4.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和/或酵母提取物。
[0017]本发明还一种制备丝状真菌发酵用淀粉衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括:采用酸化法或酶解法处理选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉、豆类淀粉或其任意混合物的普通淀粉直至获得DE值为0.1-3、粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物，从而获得所述丝状真菌发酵用淀粉衍生物。
[0018]在一具体实施例中，所述酸化法包括:
[0019]( I)配制普通淀粉与水的重量比为1:0.8 — 1:3的混合液；
[0020](2)加入占该所述水的体积0.5%- 10%的稀酸；和
[0021](3)将步骤(2)所得混合液在110-130°C、0.05MPa-0.12MPa处理2 — 20分钟后终止反应，将PH调节至中性，洗涤，干燥，从而获得所述淀粉衍生物。
[0022]在一具体实施例中，所述酸化法包括:
[0023](I)配制普通淀粉与水的重量比为3:1.5 — 3:0.8的混合液；
[0024](2)加入其体积与水的体积比为1:3到1:1的稀酸；
[0025](3)在40_50°C、常压下反应25_30小时后，终止反应，将pH调节至中性，洗涤，干燥，从而获得所述淀粉衍生物。
[0026]在一具体实施例中，酸化法中使用到的稀酸浓度通常为3.0-4.0%。[0027]在另一实施例中，酸化法中使用到的是稀盐酸，其浓度为3.4-3.6%。
[0028]在一具体实施例中，采用上述酸化法或酶解法制备得到的淀粉衍生物，若其粒径中间值不在1-30 μ m的范围内，可采用本领域常规的技术手段，例如研磨或粉碎，对其进行处理，以获得粒径中间值在1-30 μ m范围内的淀粉衍生物。
[0029]本发明也包括采用本文所述的制备丝状真菌发酵用淀粉衍生物的方法制备得到的淀粉衍生物。
[0030]本发明的淀粉衍生物的DE值为0.1-3，粘度为1-1OOcp。
[0031]在一优选实施例中，本发明的淀粉衍生物的粒径中间值为1-30 μ m。
[0032]在一优选实施例中，本发明的淀粉衍生物的粘度为l_50cp。
[0033]在一优选实施例中，本发明的淀粉衍生物的粘度为5_30cp。
[0034]在一具体实施例中，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆类淀粉的淀粉衍生物，或是这些淀粉衍生物的混合物。
[0035]本发明还提供一种丝状真菌发酵用培养基，所述培养基含有本发明的淀粉衍生物。
[0036]在一具体实施 例中，所述培养基含有占培养基总重2~40被％的所述淀粉衍生物。
[0037]在一具体实施例中，所述培养基含有占培养基总重5~25被％的所述淀粉衍生物。
[0038]在一具体实施例中，所述培养基还含有葡萄糖、磷酸二氢钠、硫酸铵、柠檬酸钠、NaN03、MgSO4.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和酵母提取物等。
[0039]在一具体实施例中，含有本发明所述淀粉衍生物的培养基在灭菌后，形成细小的、肉眼可见的微粒。通常，微粒直径在例如0.3cm以下。
[0040]本发明的淀粉衍生物具有以下优点:
[0041]1.该淀粉衍生物粘度低，即使高温灭菌后粘度也不会明显增加，因此，有利于提高初始碳源浓度及过程中淀粉的流加浓度，提高发酵产量及减少成本；
[0042]2.该淀粉衍生物与发酵培养基混合灭菌后，形成细微的颗粒，有利于形成游离的菌丝体，有利于外源蛋白分泌，从而提供目的产物量。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1显示市售6%普通玉米淀粉水溶温度及动力粘度曲线。
[0044]图2显示市售6%普通马铃薯淀粉水溶温度及动力粘度曲线。
[0045]图3显示实施例1制备的淀粉衍生物(6%)水溶液的温度及动力粘度曲线。
[0046]图4显示实施例1制备的淀粉衍生物(20%)水溶液的温度及动力粘度曲线。
[0047]图5显示实施例1制备的淀粉衍生物(40%)水溶液的温度及动力粘度曲线。
[0048]图6显示实施例4制备的淀粉衍生物(20%)水溶液的温度及动力粘度曲线。
[0049]图7显示实施例5制备的淀粉衍生物(20%)水溶液的温度及动力粘度曲线。
[0050]图8显示实施例6制备的淀粉衍生物(20%)水溶液的温度及动力粘度曲线。
[0051]图9显示市售20%可溶性淀粉水溶液温度及动力粘度曲线。
[0052]图10显示市售玉米淀粉粒径曲线图。[0053]图11显示实施例2制备的DE值为0.92的玉米淀粉衍生物粒径曲线图。
[0054]图12显示实施例6制备的DE值为1.99的马铃薯淀粉衍生物粒径曲线图。
[0055]图13显示市售马铃薯淀粉粒径曲线图。
[0056]图14显示实施例5制备的DE值为0.23的马铃薯淀粉衍生物粒径曲线图。
[0057]图15显示发酵培养基中形成细微颗粒。
[0058]图16显示发酵过程中游离菌丝形态。
[0059]图17显示发酵过程中形成的菌丝球【具体实施方式】。
[0060]图18显示使用对照淀粉衍生物配制的培养基中存在大结块。
【具体实施方式】
[0061]可采用酸化法和酶解法来制备本发明的淀粉衍生物。制备方法可基本上与本领域常规的酸化法和酶解法相同，但需要例如通过改变相应的反应条件(例如反应时间)，以获得具有本发明所限定DE值 的本发明淀粉衍生物。
[0062]本文所述酸化法，指用稀酸处理普通淀粉以制备本发明淀粉衍生物的方法。
[0063]例如，可参照段春红等(“干法制备黄糊精工艺的研究”，《食品与发酵工业》，2005年第31卷第9期(总第213期)，第39-41页)，称取一定量的普通淀粉加到蒸馏水中，加入稀的酸搅拌，然后高压灭菌一段时间，直至所产生的淀粉衍生物的DE值满足本发明的要求，然后用碱中和至中性后洗涤，烘干即可获得用于本发明的淀粉衍生物。
[0064]具体而言，本发明酸化法的一个方案是，配制普通淀粉与水的重量比为1:0.8-1:3的混合液，搅拌均匀后加入占所述水体积0.5% -10% (例如0.5-5%)的稀酸(例如浓度为3.0-4.0 %的稀酸，例如可以是浓度为3.4-3.6%的稀盐酸)，搅拌后在110_130°C、
0.05MPa-0.12MPa (例如0.105MPa)的压力下处理2_20分钟，测得溶液中还原糖含量为
0.1-3 %之后，终止反应，将pH调节至中性(例如，可使饱和的碱溶液，如饱和的NaOH溶液)，洗涤(可用适量的无水乙醇洗涤)后烘干即可获得本发明的淀粉衍生物。通常，反应体系中的水含量占整个反应体系的50-70wt%。
[0065]在一个具体实施例中，以每40g左右的普通淀粉为例，称取40g左右的普通淀粉缓慢加入装有49ml蒸馏水的敞口烧杯中，轻轻搅拌，同时加入0.5ml-2ml,3.4-3.6%的稀盐酸溶液，搅拌4-6min。放入高压灭菌锅内，在121°C 0.105MPa处理2_20min。测得采用菲林试剂法检测溶液中还原糖含量为1_3%。反应结束后用饱和NaOH溶液中和至中性。用50-100mL无水乙醇洗涤，混合后放入培养皿平铺，60°C烘干过夜，粉碎，获得本发明的丝状真菌发酵专用淀粉衍生物。
[0066]或者，可参照谢丽娟等(“木薯淀粉酸水解制可溶性淀粉”，《广西化工》，第24卷1995年第3期，第38-41页)，称取一定量的普通淀粉加入蒸馏水中，加入稀的酸后在约40~50°C之间搅拌，直至所产生的淀粉衍生物的DE值满足本发明的要求，然后用碱中和至中性后洗涤，烘干即可获得用于本发明的淀粉衍生物。
[0067]具体而言，配制普通淀粉与水的重量比为3:1.5-3:0.8的混合液，加入其体积与水的体积比为1:3到1:1的稀酸(例如浓度为3.0-4.0%的稀酸，例如可以是浓度为
3.4-3.6%的稀盐酸)，在40-50°C、常压下反应25-30小时后(中途可不断补充水，以维持溶液总体积基本不变)，终止反应，将PH调节至中性(例如，可使饱和的碱溶液，如饱和的NaOH溶液)，洗涤(可用适量的无水乙醇洗涤)后烘干即可获得本发明的淀粉衍生物。通常，反应体系中的水含量占整个反应体系的60-80wt%。
[0068]在一具体实施例中，以每125g左右的普通淀粉为例，称取125g左右的普通淀粉缓慢加入装有49ml蒸馏水的敞口烧杯中，轻轻搅拌，同时加入20-50ml，3.4-3.6%的稀盐酸溶液，加水补足500ml，45°C搅拌25_30h，中途不断补充水，保持总体积为500mL，反应结束后用饱和NaOH溶液中和至中性。采用菲林试剂法检测溶液中还原糖含量为1-3%。用50-100mL无水乙醇洗涤，混合后放入培养皿平铺，60°C烘干过夜，粉碎，获得本发明的丝状真菌发酵专用淀粉衍生物。
[0069]本文所述酶解法，指用相应的酶来处理普通淀粉，直至所产生的淀粉衍生物具有本发明所述的DE值。
[0070]例如，酶解法制备淀粉衍生物的方法可包括称取一定量的淀粉，加入到蒸馏水中，然后加入适量相应的酶进行酶解，直至所产生的淀粉衍生物具有本发明所述的DE值。反应结束后加入碱中和至中性，洗涤后烘干，可获得本发明丝状真菌发酵专用淀粉衍生物。
[0071]可根据不同的淀粉使用不同酶，这在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。作为例子，适用于本发明的酶包括但不限于α-淀粉酶，淀粉酶，淀粉葡萄糖苷酶，解枝酶，环状麦芽糊精葡萄糖基转移酶等。
[0072]适用于本发明的淀粉衍生物可由各种普通淀粉经由前述酸化法或酶解法获得，这些普通淀粉包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉、豆类淀粉等。
[0073]适用于本发明的 淀粉衍生物优选DE值(还原糖％)在大于O到小于等于3的范围之内。优选在0.1-3的范围之内，更优选在0.1-2.5、0.2-2.0、0.5-2.0不等的范围之内。可采用本领域常规的方法测试淀粉衍生物的DE值。
[0074]作为一示例性例子，可采用如下所述的还原糖测定方法来测定DE值，所述方法包括:依次往250ml三角瓶中加入Iml样品+A液10ml+B液10ml+29ml蒸馏水；煮沸，沸腾2min后取出冷却；加入C液10ml+D液10ml，摇匀；用E液滴定，至溶液呈淡黄色，加入1-2滴可溶性淀粉(F液)；继续用E液滴定，至蓝黑色消失，记录E液消耗体积Vs。
[0075]计算方法:还原糖％ (DE) =(Vo-Vs)/ (Vo-Vfe) X 2%
[0076]Vo:空白样消耗滴定液体积；Vs:样品消耗滴定液体积
[0077]Vfe:2%葡萄糖标准溶液消耗滴定液体积
[0078]该方法所用的各种试剂组成及配制方法分别如下所示:
[0079]A 液，CuSO4.5H20692g — IOL
[0080]B 液，KNaC4H4O6.4H203460g+Na0H1032g — IOL
[0081]C液，KI3000g— IOL
[0082]D 液，H2SO41420ml — IOL
[0083]E 液，0.1M Na2S2O3.5H20252g+Na2C0310g — IOL
[0084]F液，2%淀粉液(指示剂)
[0085]适用于本发明的淀粉衍生物优选具有1_30μπι的粒径中间值。可采用常规的方法来测定粒径中间值，所述方法包括但不限于激光粒度法(参考文献见李芬芬、张本山，淀粉颗粒粒径不同测定方法的比较，食品与发酵工业，2010年第36卷4期(总第268期)，171 -17 4 )。优选的粒径中间值范围包括IO - 3 O μ m，更优选的粒径中间值范围包括15-25 μ m。应理解，若采取上述方法制备得到的淀粉衍生物的粒径中间值不在上述数值范围内，可采用本领域常规的技术手段，例如研磨或粉碎，处理所述淀粉衍生物，使其粒径中间值落在上述范围之内。
[0086]普通淀粉的粘度通常在lOOOcp以上。例如，本申请实施例所测的6%的普通玉米淀粉粘度糊化后最高粘度为1708cp，而6%的普通马铃薯淀粉糊化后最高粘度高达6959cp。这类淀粉在用来配制丝状真菌发酵用培养基后常常导致培养基粘度过高或结块而无法用于发酵。
[0087]而适用于本发明的淀粉衍生物优选具有1-1OOcp的粘度，优选的粘度为l-80cp，例如可以是l-60cp、l-50cp、l-40cp、5-40cp、10-30cp不等。可采用本申请“测定方法”中“淀粉衍生物动力粘度测定”所述的方法测定所述粘度。具体而言，采用快速粘度分析仪检测法(Rapid Visco Analyser,RVA)按制造商所述方法测定本发明淀粉衍生物的粘度,测得6-40wt%的本发明淀粉衍生物的水溶液经如下测定程序处理后在50°C的粘度在I 一 IOOcp的范围之内:搅拌转数160rpm，3’ 42”内由50°C升温至95°C，95°C保持2’ 30”后3’ 48”内冷却至50°C，再在50°C保温2min。
[0088]优选地，适用于本发明的淀粉衍生物的粘度随温度升高而变化极小。
[0089]本发明的淀粉衍生物通常为白色或类白色粉末，无臭无味，不溶于冷水，能溶于热水，pH(20g/L, 25 °C )为 2-3。
[0090]在一些实施例中，本发明的淀粉衍生物包括酸化淀粉、酶解淀粉、氧化淀粉、白糊精、黄糊精和英国胶等。以此淀粉衍生物水溶液(6-40%淀粉溶液)高温灭菌(121°C，20min)后，不形成强凝胶，无颗粒，粘度低，流动性好；以该淀粉衍生物为初始碳源的培养基高温灭菌后，该淀粉衍生物能与培养基中各种离子作用，形成部分微小颗粒，该颗粒在丝状真菌孢子萌发初期可起到分散作用，致使真菌在发酵过程中始终处于游离菌丝状态，该淀粉衍生物在整个发酵过程中，不仅提供菌丝生产及产酶所需的碳源，而且在丝状真菌孢子萌发初期可起分散作用，使菌丝体一直处于游离分散状态，有利于产量提高。
[0091]本发明的淀粉衍生物适用于丝状真菌的培养和/或发酵。适用于使用本发明淀粉衍生物进行培养和/或发酵的丝状真菌包括但不限于黑曲霉、米曲霉、米黑根毛霉、李氏木霉、雪白根霉、华根霉、少根根霉、唐德链霉菌等。最常用的丝状真菌主要为黑曲霉和米曲霉。本发明适于使用本发明的淀粉衍生物来发酵各种丝状真菌，用于生产各种生物学活性分子，包括但不限于脂肪酶、Y-亚麻酸(GLA)等。
[0092]可采用常规的方法来培养和/或发酵丝状真菌，不同之处在于在培养基中使用本发明的淀粉衍生物。不同丝状真菌的培养、发酵培养基、发酵工艺不尽相同，但这都在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。例如，一般而言，培养或发酵过程包括获得丝状真菌的孢子或其悬浮液，然后将所述孢子或其悬浮液接种到培养基中，在适当发酵条件下进行发酵。同样地，不同丝状真菌的发酵条件(例如搅拌转数、通风、温度、pH值、罐压等)不尽相同，但可由技术人员根据实际发酵情况做适当调整。
[0093]通常，培养或发酵培养基中含有2%~40%的本发明淀粉衍生物，优选5%~35%，更优选5%~30%，更优选5%~25%，更优选10%~20%。
[0094]培养基中还可含有其它适于丝状真菌培养或发酵的成分，包括但不限于葡萄糖、磷酸二氢钠、硫酸铵、柠檬酸钠、NaNO3、MgS04.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和/或酵母提取物等。
[0095]例如，在一具体实施例中，本发明的发酵培养基含有:淀粉衍生物200g/L，葡萄H 20g/L, TSB80g/L,磷酸二氢钠0.2g/L，硫酸铵15g/L，柠檬酸钠70g/L，硫酸镁Ig/L, Tween800.7ml，微量元素 Iml，铁盐 IOml，其中，微量元素为 ΚΙ0.83g/L，Η3Β036.2g/L，MnSO4.4Η2022.3g/L, ZnSO4.7Η208.6g/L, Na2MoO4.2Η200.25g/L, CuSO4.5Η200.025g/L,CoCl2.6Η200.025g/L ;铁盐为 FeSO4.7Η202.78g/L, Na2.EDTA3.73g/L。所述培养基可用于黑曲霉发酵产脂肪酶。
[0096]在另一实施例中，本发明的发酵培养基含有NaN033g/L，KH2P047g/L,Na2HPO4.12H201.2g/L，MgSO4.7Η200.5g/L，CaCl20.3g/L，胰蛋白胨 3g/L，酵母提取物 lg/L，本发明淀粉衍生物100g/L，橄榄油15g/L，pH4.5。该培养基可用于野生米黑根毛霉发酵产脂肪酶。[0097]在又一实施例中，本发明的发酵培养基含有本发明的淀粉衍生物180g/L，磷酸二氢钾7.0g/L,硫酸镁0.lg/L,氯化钠0.6g/L，酵母膏0.9g/L，蛋白胨0.7g/L，微量元素3ml，PH5.0。该培养基可用于野生深黄被孢霉发酵产Y-亚麻酸(GLA)。
[0098]因此，应理解，可根据不同的丝状真菌以及发酵产物等因素选择适当的培养基成分及其含量，这些都在本领域技术人员所掌握的知识范围之内。
[0099]本发明也包括含有本发明所述淀粉衍生物的丝状真菌发酵用培养基。在一具体实施例中，所述培养基中所含的淀粉衍生物采用本文所述的制备方法制备得到。在另一实施例中，所述淀粉衍生物的DE值为0.1-3，粘度为Ι-lOOcp。在一优选实施例中，本发明的淀粉衍生物的粒径中间值为1_30μπι。在一优选实施例中，本发明的淀粉衍生物的粘度为l-50cp。在一优选实施例中，本发明的淀粉衍生物的粘度为5-30cp。在一具体实施例中，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆类淀粉的淀粉衍生物，或是这些淀粉衍生物的混合物。应理解，本发明的丝状真菌发酵用培养基除淀粉衍生物外的其它成分及含量与现有已知的丝状真菌发酵用培养基相同或类似。技术人员可根据实际情况，例如所培养的真菌等，对发酵培养基中的成分及其含量做出适当选择。
[0100]下文将以具体实施例的方式描述本发明。实施例中所用的试剂、反应条件等，除非另有说明，否则均为本领域常规的试剂和反应条件。
[0101]此外，为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另外指出，所有表达成分数量、材料的百分比或比例、反应条件的数字以及在说明书和权利要求书中使用的其它数值，都应当被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指示，在本说明书和所附权利要求书中列举的数值参数是近似值，其可以取决于本发明要求获得的期望性质而变。丝毫且并非试图使等价原则的应用限于权利要求书的范围，每个数值参数至少应当根据所报告的有效数字的数目并且通过应用常规舍去技术进行解释。
[0102]在本发明中，发明人首先使用玉米淀粉制备获得了玉米淀粉衍生物，使用这些淀粉衍生物培养丝状真菌时，发现使用其中部分玉米淀粉衍生物时，能获得良好的效果；经检测发现，这些玉米淀粉衍生物的DE值为0.1-3，粘度为Ι-lOOcp，特别地，当粒径中间值为1-30 μ m时，其效果更优。随后，发明人又使用马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉制备相应的淀粉衍生物，当控制获得的淀粉衍生物的DE值为0.1-3，粘度为1-1OOcp时，使用该淀粉衍生物培养丝状真菌，也具有良好的效果，当淀粉的粒径中间值为1-30 μ m时，其效果更好。
[0103]实施例
[0104]测试方法:
[0105]1.淀粉衍生物动力粘度测定
[0106]采用快速粘度分析仪检测法(Rapid Visco Analyser, RVA ;快速粘度分析仪购自波通瑞华科学仪器(北京)有限公司):称取一定量淀粉及淀粉衍生物，加水配置成6-40%的溶液于铝盒中。用搅拌桨混合均匀，放入样品池中，开始测定。测定程序为:搅拌转数为160rpm，3’ 42” 内由 50°C升温至 95°C，95°C保持 2’ 30” 后 3，48” 内冷却至 50°C，再在 50°C保温2min。记录整个过程中粘度变化，根据不同时间点对应的粘度，即可制得相应的粘度变化曲线。
[0107]2.脂肪酶酶活测定方法
[0108](I)样品瓶及空白瓶各加4.0Oml底物溶液、3ml蒸馏水、2mlTris-HCl缓冲液；
[0109](2)放入400C恒温水浴摇床振荡预热5分钟；
[0110](3)样品瓶加入发酵上清液1ml，样品瓶和空白瓶继续40°C水浴振荡15分钟；
[0111](4)向样品瓶和空白瓶各加入95%乙醇10ml，终止反应；
[0112](5)瓶加入Iml发酵上清液摇匀；
[0113](6)品瓶和空白瓶各加入2滴酚酞指示剂；
[0114](7)0.1M氢氧化钠溶液滴定至酹酞变微红为终点,记录消耗氢氧化钠溶液体积。
【权利要求】
1.一种使用丝状真菌进行发酵的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培养基进行发酵，其中，所述淀粉衍生物DE值为0.1-3，粘度为1-lOOcp。
2.一种控制丝状真菌发酵时的形态的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有淀粉衍生物的培养基进行发酵，从而控制丝状真菌在发酵时以游离菌丝体形态存在，其中，所述淀粉衍生物DE值为0.1-3，粘度为1-1OOcp。
3.DE值为0.1-3和粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物在丝状真菌发酵中的应用。
4.DE值为0.1-3和粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物在制备丝状真菌发酵用的培养基中的应用。
5.如权利要求1或2所述的方法或权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述淀粉衍生物粒径中间值为1-30 μ m。
6.如权利要求1或2所述的方法或权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌选自:黑曲霉、米曲霉、米黑根毛霉、李氏木霉、雪白根霉、华根霉、少根根霉和唐德链霉菌。
7.如权利要求1或2所述的方法或权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆类淀粉的淀粉衍生物，或是这些淀粉衍生物的混合物。
8.如权利要求1或2所述的方法或权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述培养基含有2%~40%的所述淀粉衍生物。
9.如权利要求8所述的方法或应用，其特征在于，所述培养基含有5%~25 %的所述淀粉衍生物。
10.如权利要求1或2所述的方法或权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述培养基含有葡萄糖、磷酸二氢钠、硫酸铵、柠檬酸钠、NaN03、MgSO4.7H20、CaCl2、胰蛋白胨和/或酵母提取物。
11.一种制备丝状真菌发酵用淀粉衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括:采用酸化法或酶解法处理选自玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉、豆类淀粉或其任意混合物的普通淀粉，以获得DE值为0.1-3、粘度为1-1OOcp的淀粉衍生物，从而获得所述丝状真菌发酵用淀粉衍生物； 优选的，所述方法还包括，研磨或粉碎所获得的淀粉衍生物，以获得粒径中间值为1-30 μ m的丝状真菌发酵用淀粉衍生物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酸化法包括: (1)配制普通淀粉与水的重量比为1:0.8 — 1:3的混合液； (2)加入占该所述水的体积0.5%- 10%的稀酸；和 (3)将步骤(2)所得混合液在110-130°C、0.05MPa-0.12MPa处理2 — 20分钟后终止反应，将PH调节至中性，洗涤，干燥，从而获得所述淀粉衍生物。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酸化法包括: (1)配制普通淀粉与水的重量比为3:1.5-3:0.8的混合液； (2)加入其体积与水的体积比为1:3-1:1的稀酸； (3)在40-50°C、常压下反应25-30小时后终止反应，将pH调节至中性，洗涤，干燥，从而获得所述淀粉衍生物。
14.一种淀粉衍生物，其特征在于，所述淀粉衍生物的DE值为0.1-3，粘度为1-lOOcp。
15.如权利要求14所述的淀粉衍生物，其特征在于，所述淀粉衍生物的粒径中间值为1-30 μ m。
16.如权利要求14所述淀粉衍生物，其特征在于，所述淀粉衍生物是玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉、高粱淀粉或豆类淀粉的淀粉衍生物，或是这些淀粉衍生物的混合物。
17.—种丝状真菌发酵用培养基，其特征在于，所述培养基含有权利要求14 - 16中任一项所述的淀粉衍生物。
【文档编号】C08B31/00GK103834625SQ201210484085
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月23日 优先权日:2012年11月23日
【发明者】包悦佚, 高霓思, 关惠琴, 滕健, 朱玲 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司