技术领域
本发明涉及一种检测酵母老化的方法，将菌种进行传代培养，建立不同代数酵母细胞中SOD活性与超氧阴离子自由基的相互关系标准对照图，进而检测酵母老化程度的方法。
背景技术：
酵母是人类应用最广泛的微生物，传统上用于食品工业制作面包和馒头等面食，发酵工业中主要应用于酿酒。酿造酒类的过程实质上是酵母的代谢过程，酵母的代谢速率是与酵母的老化密切相关的，会直接影响到企业生产产量和经济效益。另一方面，酵母的代谢产物构成酒体和酒特有的风味。酒优良的风味主要是由酿酒酵母发酵代谢形成的各种风味物质综合行成，而酒中的缺点和杂味很大一部分也来自于酿酒酵母老化，自溶，尤其对啤酒及啤酒酵母而言更为重要。因此要获得高品质的酒，就必须要有活力强，品质良好的酵母。由此可见，酿酒酵母的老化问题直接影响发酵速度和酒的品质。酵母老化通常从其降糖速度，酒精生成量等指标来得以表征，但由于酵母老化是一个渐变过程，影响因素较多，目前没有比较准确的方法来鉴定酵母的老化程度，致使在啤酒酿造过程中只使用代数较小的酵母，导致酵母被大批的浪费甚至影响到生产。因此，找到一种可行的鉴定酵母老化的方法对于现代化工业生产有着重要的意义。
SOD（超氧化物歧化酶）是专一清除细胞内超氧阴离子自由基的抗氧化酶，稳定性强，普遍存在于酵母菌、动植物及所有真核细胞的生物中，在预防衰老等方面起着十分重要的作用，在酵母生长条件下，O2-可及时被SOD清除，不会对细胞产生伤害，但是在衰老等情况下，活性氧就会对酵母生理产生影响，超氧阴离子自由基的积累是酵母衰老的主要原因之一。
本研究通过对酿酒酵母2144和2146进行传代培养，得到不同代数的酵母，测定其SOD活性与O2-.的含量与产生速率，建立SOD活性与O2-.之间的相互关系标准对照图，通过测定生产使用的酵母的SOD活性与O2-.的含量与产生速率，比对标准对照图，就可以判断出酵母菌的老化程度，从而为生产决策提供可靠的依据。实验证明此方法是一种准确，可靠的检测方法。
技术实现要素：
本发明提供一种检测酵母老化的方法，首先对酵母菌体进行传代培养，得到不同代数的酵母细胞发酵液，将酵母发酵培养液通过离心分离得到酵母细胞，酵母细胞经冷冻干燥后，称取一定量冻干的细胞用破壁缓冲液溶解，超声破碎，破碎后的酵母细胞冷冻离心，取上清液测定SOD活性以及超氧阴离子自由基O2-.生成速率和含量；
具体的操作步骤如下：
第一步、培养酵母细胞，其中：
1）培养基：磷酸氢二钾10.5g，磷酸二氢钾4.5g，硫酸铵1g，柠檬酸三钠0.5g，葡萄糖60g，无氨基酵母氮源培养基6.7g，组氨酸10mg，甲硫氨酸20mg，色氨酸20mg，1000ml去离子水；
2）培养条件：按照3～8×106cfu/mL的接种量接种，在28～30℃，150～180r/min条件下培养到发酵终点，发酵结束；
3）从固体斜面培养基上的菌种转接到液体培养基定义为第一代酵母，到达发酵终点后，以5.05×106cfu/mL的接种量转接一次，进行传代；
4）收集细胞：发酵液在4000r/min条件下离心20分钟，用无菌水清洗3～5次，每次4000r/min，离心10分钟，得到干净的酵母细胞。通过冷冻干燥（-48℃,4Pa），得到冻干的酵母，备用。
其中所述的发酵终点为培养基中的残糖含量在1～3mg/mL时。
第二步、对酵母细胞采用反复冻融超声破壁，称取2g冻干的酵母，用30ml的破壁缓冲液溶解，在-20℃下冷冻4h，于30℃下溶解0.5h，反复两次，进行超声破碎，超声破碎时工作2s，间歇3s，全程时间25min，功率400w，保护温度4℃，破碎后的混合液冷冻离心，离心速率10000r/min，离心时间10min，保护温度4℃，取上清液，立即进行测定。
其中，破壁缓冲液配方是每1000ml中含有：50mmol/L的Tris-HCl，1.491gKCl，0.146gEDTA。
第三步、采用邻苯三酚自养化的方法和羟胺氧化法测定细胞提取液中SOD活性以及超氧阴离子自由基生成速率和含量，分析三者之间的相互关系，建立SOD活性与超氧阴离子自由基含量和产生速率之间的标准关系曲线，进而根据标准曲线，已知SOD活性，查到酵母的代数。
本发明通过分析不同代数酵母胞内SOD活性与O2-.之间的相互关系，建立SOD活性与O2-.之间相互关系标准对照图，当SOD活性与O2-.产生速率与含量变化呈现出不同变化趋势的时候，说明酵母细胞已经出现老化。这可以从降糖速度得到佐证。要判断酵母的老化程度，只需要建立不同代数酵母的SOD活性与O2-.之间相互关系标准对照图，再测定生产使用的酵母的SOD活性，与标准图对照，即可以看出酵母细胞的老化程度。因为SOD是稳定性高的胞内抗氧化酶，此方法准确，可靠，可以为生产决策提供可靠的依据。
表1、不同代数酿酒酵母2144SOD活性，超氧阴离子自由基产生速率和含量：
表2、不同代数酿酒酵母2146SOD活性，超氧阴离子自由基产生速率和含量：
附图说明
图1、牛血清白蛋白（BSA）标准曲线
图2、酿酒酵母2144SOD活性与自由基产生速率相关图，其中-□-为SOD活性，-●-为自由基产生速率。
图3、酿酒酵母2144SOD活性与自由基含量相关图，其中-□-为SOD活性，-●-为自由基含量。
图4、酿酒酵母2146SOD活性与自由基产生速率相关图，其中-□-为SOD活性，-●-为自由基产生速率。
图5、酿酒酵母2146SOD活性与自由基产生速率相关图，其中-□-为SOD活性，-●-为自由基产生速率。
具体实施方式
结合实施例，对本发明技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不仅限于此。实施例中所用菌种及培养基为：
酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2144、2146，菌种由大连工业大学菌种保藏所提供。
培养基：K2HPO410.5g，KH2PO44.5g，(NH4)2SO41g，柠檬酸三钠0.5g，葡萄糖60g，YNB培养基6.7g，L-His10mg，L-Met20mg，L-try20mg，1000ml去离子水。
实施例1
酿酒酵母2144
第一步、不同代数酵母细胞获得：
1)种子培养：固体斜面培养基上的菌种，转接到种子培养基中，28℃，170r/min，培养15h，到达对数生长期，此作为种子液。
2)发酵培养：按照5.05×106cfu/mL的接种量接种，28℃，170r/min，培养65h，到达发酵终点。从固体斜面培养基上的菌种转接到液体培养基定义为第一代酵母，发酵结束后，以相同的接种量转接，进行传代。
3)收集细胞：发酵液在4000r/min条件下离心20分钟，用无菌水清洗3～5次，每次4000r/min，离心10分钟，得到干净的酵母细胞。通过冷冻干燥（-48℃,4Pa），得到冻干的酵母，备用。
第二步、样液制备：
采取反复冻融超声破碎的方法破碎细胞，步骤如下：称取2g冻干的酵母，用30ml的破壁缓冲液溶解，在-20℃下冷冻4h，于30℃下溶解0.5h，反复两次，进行超声破碎（工作2s，间歇3s，全程时间25min，功率400w，保护温度4℃）。破碎后的混合液冷冻离心（4℃，10000r/min，10min），取上清液，立即进行测定。
第三步、指标测定：
采用邻苯三酚自养化方法测定SOD活性，羟胺氧化法测定O2-.产生速率和含量，建立SOD活性与O2-.之间相互关系标准对照图。测定的数据如表1，在第九代时SOD活性达到最高值，此后SOD活性开始下降，而O2-.的产生速率加快，含量继续上升，此刻就出现了老化的节点，在此之后的酵母菌开始老化，可从培养65h后，培养基中残糖含量得到佐证，酿酒酵母2144第1、3、6、9、12代，培养65h后残糖含量（mg/ml）依次分别为：2.46，1.79，1.51，1.38，1.49。
第四步、实际应用：
实验中按照上述培养方法培养酿酒酵母2144的第2代、第5代和第10代，得到酵母细胞，按照本文所说的方法，测定2、5、10代细胞的SOD活性，分别为24.08、26.98、29.03U/mgprotein，而根据标准图对照，2、5、10代细胞SOD活性的理论值是23.89、27.41、29.83U/mgprotein，与实验所获得的数据基本一致，由此可证明此方法是可行的。
实施例2
酿酒酵母2146
第一步、不同代数酵母细胞获得：
1)种子培养：固体斜面培养基上的菌种，转接到种子培养基中，28℃，170r/min，培养17h，到达对数生长期，此作为种子液。
2)发酵培养：按照5.05×106cfu/mL的接种量接种，28℃，170r/min，培养72h，到达发酵终点。从固体斜面培养基上的菌种转接到液体培养基定义为第一代酵母，发酵结束后，以相同的接种量转接，进行传代。
3)收集细胞：发酵液在4000r/min条件下离心20分钟，用无菌水清洗3～5次，每次4000r/min，离心10分钟，得到干净的酵母细胞。通过冷冻干燥（-48℃,4Pa），得到冻干的酵母，备用。
第二步、样液制备：
采取反复冻融超声破碎的方法破碎细胞，步骤如下：称取2g冻干的酵母，用30ml的破壁缓冲液溶解，在-20℃下冷冻4h，于30℃下溶解0.5h，反复两次，进行超声破碎（工作2s，间歇3s，全程时间25min，功率400w，保护温度4℃）。破碎后的混合液冷冻离心（4℃，10000r/min，10min），取上清液，立即进行测定。
第三步、指标测定：
采用邻苯三酚自养化方法测定SOD活性，羟胺氧化法测定O2-.产生速率和含量，建立SOD活性与O2-.之间相互关系标准对照图。测定的数据如表2，在第七代时SOD活性达到最高值，此后SOD活性开始下降，而O2-.的产生速率加快，含量继续上升，此刻就出现了老化的节点，在此之后的酵母菌开始老化，可从培养72h后，培养基中残糖含量得到佐证，酿酒酵母2146第1、3、5、7、9、10代，培养72h后残糖含量（mg/ml）依次分别为：2.06，1.87,1.48，1.22，1.28，1.31。
第四步、实际应用：
实验中按照上述培养方法培养酿酒酵母2146的第4代和第8代，得到酵母细胞，按照本文所说的方法，测定4、8代细胞的SOD活性，分别为39.08、60.53U/mgprotein，而根据标准图对照，4、8代细胞SOD活性的理论值是38.19、60.07U/mgprotein，与实验所获得的数据基本一致，由此可证明此方法是可行的。
综上所述，本发明在鉴定酵母老化程度方面可以作为一种简便、可靠的手段，可以为生产决策提供可靠的依据。