具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体及其制备方法，该载体具有对肿瘤细胞有特异靶向功能，并且可响应细胞内的还原环境而快速降解。该载体材料是双亲性星形聚合物，亲水链段材料为末端接有主动靶向配体的聚乙二醇；疏水链段为可降解吸收的星形聚己内酯；亲水和疏水链段之间通过具有生理环境响应功能的二硫键化学连接，形成功能化的星形嵌段共聚物。本发明聚合物可以作为药物载体，在水中通过自组装形成装载药物的纳米颗粒，可用于肿瘤的靶向治疗。
【专利说明】具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体的制备方法，属于药物控释【技术领域】。
【背景技术】
[0002]抗癌药物的副作用严重阻碍了其临床应用。为了解决这个问题，目前研究者们多采用纳米颗粒作为药物载体，比如用纳米胶束包载药物，这一应用的主要根据是，聚合物胶束是通过细胞的内吞作用携载抗癌药物进入细胞，绕开了 P-糖蛋白，避免药物经胞外分泌外流，从而使药物可以被具有多要耐药性的肿瘤细胞大量吸收，提高了治疗作用并且大大减小了毒副作用。
[0003]然而，聚合物胶束在抗癌药物的应用方面还面临着很多挑战，期望是使载药胶束在到达肿瘤细胞之前的血液循环中稳定性良好，又要能选择性地富集在肿瘤部位，并且在肿瘤细胞内部可以快速 释放出药物。通过细胞靶向和细胞质内可控释放抗癌药物，是降低肿瘤治疗对正常细胞伤害和克服耐药性问题的关键。因此，制备出结构稳定、具有靶向性和能响应肿瘤细胞内环境而快速释放药物的聚合物载体，是目前肿瘤治疗研究和技术开发的执占。
[0004]在形成胶束的嵌段共聚物结构设计上，两亲性星形聚合物除具备一般两亲性线性嵌段共聚物的性质外，由于多个链段通过共价键连接于一个多官能团核上，还有其特殊的性质。星形聚合物是由至少三个线性高分子链通过化学键连接到同一中心核上所形成的多臂支化聚合物，与线性聚合物相比，具备的独特性质包括:分子表面官能度高，分子链末端带有大量的可供进一步改性的官能团；分子链不易缠结、溶液和本体的粘度明显低于相同分子量的线性聚合物、结晶度较低；分子更易发生微相分离等。综合这些特点，与线性两亲嵌段共聚物相比，星型共聚物在水中更易于形成胶束，同时也具备更好的稳定性。
[0005]与人体正常细胞相比，多数肿瘤细胞表面呈现出一些特定受体的高表达，比如叶酸受体、半乳糖基受体等。因此，针对肿瘤细胞表面的特殊受体，在药物载体材料上通过化学键连接一些相应的配体，通过这种受体-配体的特异结合，就可实现药物载体的主动靶向功能。另外，在肿瘤细胞内部，谷胱甘肽含量远高于细胞外的血液中的含量，也大于正常细胞内的浓度。根据这个生理环境特征，我们可以在聚合物的亲水和疏水链段之间连接具有生理环境响应功能的二硫键，就可以实现载体在肿瘤细胞内还原条件下快速裂解断裂，释放药物导致肿瘤细胞快速凋亡。
[0006]目前，中国专利申请200910273157.0和201110004873.6公布了含有二硫键的共
聚物的制备方法，但是未涉及载体的靶向，以及载体聚合物不是星形聚合物。根据前面的分析，这些聚合物材料不能实现载体在血液循环中的稳定性，也不能实现对肿瘤治疗的靶向治疗性。但是，在我们涉及的这个体系中，我们根据肿瘤的生理环境特征，设计了一种既能在血液循环中保持稳定，又能对肿瘤细胞靶向和能响应细胞内还原条件而快速裂解断高分子链，快速释放出抗肿瘤药物的星形聚合物载体。该载体在体内还能完全生物降解。
【发明内容】
[0007]本发明目的是提供一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体的制备方法。使其获得的星形聚合物保证载体在血液循环中保持稳定性。
[0008]一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体的制备方法，包含如下的步骤:
[0009](I)星形聚己内酯的制备:以氯化亚锡为催化剂，加入多元醇和己内酯，在抽真空3小时后，于温度150度开环聚合，反应6小时合成理论分子量8000的星形聚己内酯，产物冷却后，以二氯甲烷溶解，在大量冰乙醇中沉析，抽滤，产物真空干燥，即得星形聚己内酯的制备；
[0010](2)、星形聚己内酯末端引入二硫键:环状二硫代二丙酸酐与(I)所得星形聚己内酯末端羟基反应，以二甲基甲酰胺DMF做溶剂，加入4- 二甲氨基吡啶DMAP和三乙胺催化反应进行，在35度水浴条件下，搅拌反应24h ;反应结束后，用0.1M稀盐酸来酸化反应液，将反应液倒入六倍体积的蒸馏水中，用二倍体积的二氯甲烷萃取三次，收集二氯甲烷层，加入无水硫酸钠除水，过滤后将澄清滤液旋蒸、冰乙醚沉析、抽滤，得以分子式PER-(PCL-SS-C00H) 4为主体的两亲嵌段共聚物；
[0011](3)、两亲性星形嵌段共聚物的形成:称取I当量的疏水链段产物(PER- (PCL-SS-C00H) 4)溶于一定量DMF中，将此溶液用恒压滴液漏斗慢慢滴入到8~10当量氨基化PEG的DMF溶液中，在催化剂NHS和DCC存在下，通过酰胺键连接成两亲性的嵌段共聚物，反应液过滤、旋转蒸发、冰乙醇沉析，得两亲性星形嵌段共聚物；
[0012](4)、具有生理环境`响应功能的主动靶向星形聚合物载体的制备:活化后的靶向材料与上一步制备的两亲嵌段共聚物以当量比4:1反应，室温搅拌24h，溶剂为二甲亚砜DMSO ;反应结束后，用截留分子量1000克/摩尔的透析袋透析3天，透析结束后，冷冻干燥得最终目标产物。
[0013]本发明方法的原料低廉易得，方法成熟简单，应用前景广。涉及的各个步骤与方法，本领域的技术人员均能实现。
[0014]本发明的目的还在于，以上述手段获得的目标物。
[0015]一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体，该载体材料是具有四臂或六臂星形结构的双亲性星形聚合物，亲水链段材料为末端接有主动靶向配体的聚乙二醇；疏水链段为可降解吸收的星形聚己内酯；亲水和疏水链段之间通过具有生理环境响应功能的二硫键连接，形成功能化的星形嵌段共聚物，这种聚合物可以作为药物载体，在水中通过自组装形成装载药物的纳米颗粒，用于肿瘤的靶向治疗。
[0016]这样，靶向分子的引入使载药胶束有选择性地富集在肿瘤细胞周围，并通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞；在的聚合物亲水和疏水链段之间连接的具有生理环境响应功能的二硫键，可以使载体在肿瘤细胞内还原条件下快速裂解断裂，释放药物导致肿瘤细胞快速凋亡。疏水链段主要组分为聚己内酯成分，可以在体内完全生物降解。因此，该载体可以提高肿瘤的治疗效果，同时可以减小药物的毒副作用。【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1星形聚己内酯的合成路线。
[0018]图2两亲性星形嵌段共聚物的合成路线。
[0019]图3靶向材料的合成路线。
【具体实施方式】
[0020](1)星形聚己内酯的制备(合成路线如图1所示):以氯化亚锡为催化剂，多元醇为星形结构的核。通常，对于I当量的季戊四醇，投入70当量的己内酯，总质量1%的氯化亚锡，使合成理论分子量8000的星形聚己内酯。在抽真空3小时后，于温度150度开环聚合，反应6小时。产物冷却后，以二氯甲烷溶解，在大量冰乙醇中沉析，抽滤，产物真空干燥，即得四臂聚己内酯。
[0021]以上制备过程中，所使用的作为星型结构的核的分子，可以是丙三醇、季戊四醇和双季戊四醇这类多元醇的一种，分别形成的是三臂、四臂和六臂的星形结构。所设计的这段星形聚合物理论分子量可以是500到10000。
[0022](2) 二硫代二丙酸环状酸酐的制备:一定量二硫代二丙酸在乙酰氯中温度65度回流反应，可得二硫代二丙酸的环状内酸酐。
[0023](3)星形聚己内酯末端引入二硫键:上述合成的环状二硫代二丙酸酐与星形聚己内酯末端羟基可反应，以二甲基甲酰胺(DMF)做溶剂，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)和三乙胺催化反应进行，在35度水浴条件下，搅拌反应24h。反应结束后，用0.1M稀盐酸来酸化反应液。将反应液倒入六倍体积的蒸馏水中，用二倍体积的二氯甲烷萃取三次。收集二氯甲烷层，加入无水硫酸钠除水。过滤，将澄清滤液旋蒸、冰乙醚沉析、抽滤，得产物。产物分子式 PER-(PCL-SS-C00H)4。
[0024](4)双氨基化聚乙二醇的制备:采用Gabriel法进行聚乙二醇的氨基化。对于PEG双端氨基化的方法，也可以使用其他成熟的氨基化方法，例如，用PEG合成磺酰化的PEG后，高温高压釜中与氨水反应。
[0025](5)两亲性星形嵌段共聚物的形成(如合成路线图2所示):根据上述方案，称取I当量的疏水链段产物(PER-(PCL-SS-C00H) 4)溶于一定量DMF中，将此溶液用恒压滴液漏斗慢慢滴入到8~10当量氨基化PEG的DMF溶液中，在催化剂NHS和DCC存在下，通过酰胺键连接成两亲性的嵌段共聚物。反应液过滤、旋转蒸发、冰乙醇沉析，得产物。
[0026](6)靶向材料的制备:靶向分子的来源可以是叶酸和半乳糖分子中的一种，其受体均有在人体肿瘤细胞表面过量表达的情况。
[0027](a)叶酸靶向材料的制备(如合成路线图3所示):叶酸经等当量的NHS和DCC在冰水浴条件下活化。活化后的叶酸与上一步制备的两亲嵌段共聚物以当量比4:1反应，室温搅拌24h，溶剂为二甲亚砜(DMS0)。反应结束后，用截留分子量1000克/摩尔的透析袋透析3天。透析结束后，冷冻干燥得最终产物，具有叶酸靶向基团并且有二硫键的星形聚合物。
[0028](b)半乳糖靶向材料的制备:制备方法与上同，将叶酸换成乳糖酸，就可得到有半乳糖靶向基团并且有二硫键的星形聚合物。
[0029]实施例1[0030]称取0.17克季戊四醇，10克己内酯和0.1克氯化亚锡，置于单口瓶中，抽真空3h后，在温度150度条件下开环聚合，6小时后取出，待产物从熔融冷却为固体状态，加入5mL二氯甲烷使溶解，滴入到250mL冰乙醇中沉析，抽滤，真空干燥，即得四臂聚己内酯。
[0031 ] 称取2克二硫代二丙酸，加入20克乙酰氯，在温度65度回流反应，磁力搅拌4h后，旋转蒸发除去大部分有机溶剂，用冰乙醚沉析，抽滤，真空干燥，即得。
[0032]称取1份二硫代二丙酸酐与5.2克上述的星形聚己内酯，加入到70mLDMF中，催化剂DMAP0.3176克，三乙胺0.4mL,在温度35度水浴条件下，搅拌反应24h。反应结束后，用配置好的0.1M盐酸调节pH值为5，然后将该反应液倒入六倍体积的蒸馏水中，用二倍体积的二氯甲烷萃取，共萃取三次。收集下部二氯甲烷层，加入无水硫酸钠除水。待液体层澄清,过滤掉硫酸钠,将滤液旋蒸,大量冰乙醚沉析、抽滤,得产物。产物分子式PER-(PCL-SS-C00H) 4。[0033]称3克双氨基化的聚乙二醇(PEG)溶于50mL DMF中，置于三口烧瓶中，另外称1.2克疏水链段产物PER- (PCL-SS-C00H) 4溶于30mL DMF中，将此溶液慢慢滴入到氨基化聚乙二醇的DMF溶液中，加入催化量的NHS和DCC，室温反应24h。反应液过滤、旋蒸、大量冰乙醇沉析、抽滤，重复三次，真空干燥得到星形两亲性嵌段共聚物产物。
[0034]称0.022 克叶酸，0.0103 克 DCC, 0.0058 克 NHS，加入 20mL 二甲亚砜(DMSO)中磁力搅拌12h，前2h在冰水浴条件下进行。称上步已经合成的星形两亲性嵌段共聚物产物3克，溶于50mL DMSO中，活化好的叶酸溶液滴入该聚合物溶液中，反应24h。反应结束后，用截留分子量1000克/摩尔的透析袋透析3天，冷冻干燥得最终产物:具有生理环境响应功能的主动靶向四臂星形聚合物载体。
[0035]实施例2
[0036]本例是将实施例1中的季戊四醇换做双季戊四醇，投入的双季戊四醇与己内酯的比例为1:105，其他实施方法实施例1，以此得到六臂的星形共聚物。
[0037]实施例3
[0038]本例是将实施例1中的叶酸分子换做乳糖酸其他方法同实施例1，可以合成得到有半乳糖靶向基团并且有二硫键的星形四臂聚合物。
[0039]实施例4
[0040]本例是将实施例1中的叶酸分子换做乳糖酸，季戊四醇换做双季戊四醇，其他方法同实施例1，可以合成得到有半乳糖靶向基团并且有二硫键的星形六臂聚合物。
【权利要求】
1.一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体的制备方法，包含如下的步骤: (1)星形聚己内酯的制备:以氯化亚锡为催化剂，加入多元醇和己内酯，在抽真空3小时后，于温度150度开环聚合，反应6小时合成理论分子量8000的星形聚己内酯，产物冷却后，以二氯甲烷溶解，在大量冰乙醇中沉析，抽滤，产物真空干燥，即得星形聚己内酯的制备; (2)、星形聚己内酯末端引入二硫键:环状二硫代二丙酸酐与(I)所得星形聚己内酯末端羟基反应，以二甲基甲酰胺DMF做溶剂，加入4- 二甲氨基吡啶DMAP和三乙胺催化反应进行，在35度水浴条件下，搅拌反应24h ;反应结束后，用0.1M稀盐酸来酸化反应液，将反应液倒入六倍体积的蒸馏水中，用二倍体积的二氯甲烷萃取三次，收集二氯甲烷层，加入无水硫酸钠除水，过滤后将澄清滤液旋蒸、冰乙醚沉析、抽滤，得以分子式PER-(PCL-SS-C00H)4为主体的两亲嵌段共聚物； (3)、两亲性星形嵌段共聚物的形成:称取I当量的疏水链段产物(PER- (PCL-SS-COOH) 4)溶于一定量DMF中，将此溶液用恒压滴液漏斗慢慢滴入到8~10当量氨基化PEG的DMF溶液中，在催化剂NHS和DCC存在下，通过酰胺键连接成两亲性的嵌段共聚物，反应液过滤、旋转蒸发、冰乙醇沉析，得两亲性星形嵌段共聚物； (4)、具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体的制备:活化后的靶向材料与上一步制备的两亲嵌段共聚物以当量比4:1反应，室温搅拌24h，溶剂为二甲亚砜DMSO ;反应结束后，用截留分子量1000克/摩尔的透析袋透析3天，透析结束后，冷冻干燥得最终目标产物。
2.根据权利要求1所述之方法，其特征在于，所述多元醇为季戊四醇，步骤(1)中季戊四醇与己内酯的投料重量比为 1.7:100。
3.根据权利要求1所述之方法，其特征在于，所述多元醇为双季戊四醇，步骤(1)中双季戊四醇与己内酯的投料重量比为1:105。
4.根据权利要求1所述之方法，其特征在于，所述靶向材料为叶酸和半乳糖之一。
5.一种具有生理环境响应功能的主动靶向星形聚合物载体，该载体材料是具有四臂或六臂星形结构的双亲性星形聚合物，亲水链段材料为末端接有主动靶向配体的聚乙二醇；疏水链段为可降解吸收的星形聚己内酯；亲水和疏水链段之间通过具有生理环境响应功能的二硫键连接，形成功能化的星形嵌段共聚物，这种聚合物可以作为药物载体，在水中通过自组装形成装载药物的纳米颗粒，用于肿瘤的靶向治疗，其特征在于，采用权利要求1或2或3或4的方法制得。
【文档编号】C08G63/91GK103865069SQ201410062358
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】周绍兵, 史春丽, 郭星, 王毅 申请人:西南交通大学