本发明涉及生物医药技术领域，更具体的，本发明涉及适于抗VEGF抗体生产的培养基及应用。
背景技术：
随着环境的不断恶化，全球癌症发病率和死亡率呈现逐年递增的趋势，世界卫生组织和各国政府卫生部门纷纷把攻克恶性肿瘤列为一项重要任务。有研究表明肿瘤血管形成是肿瘤生长、转移的重要条件，实体瘤的生长和转移依赖于血管生成(Folkman J.N Engl J Med，1971，285(21)：1182)。因此干扰和阻断肿瘤血供是有效的治疗方法。另外，有研究发现，血管内皮生长因子(VEGF)是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子(Ferrara N.Endocr Rev，1997，18(1)：4)，且在多种原发性恶性肿瘤组织中均呈高表达(Brown L F等Human Pathol，1995，26(1)：86)；新近研究发现VEGF高表达与结肠癌转移的发生有密切联系，提示VEGF在原位肿瘤的形成和生长及转移瘤的形成中均起着举足轻重的作用(Cancer Res，1995，55(18)：3964)。而且有研究表明其它多种血管生长因子是通过直接或间接诱导、刺激VEGF表达而发挥作用的，如TGF-α、bFGF、TGF-β、TNF-α、KGF等均可上调VEGF的表达(Li J，Hampton T等，J Clin Invest，1997，100(1)：18；Brown L F等，Detmar M，Claffey K，et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor：a multifunctional angiogenic cytokine.Exs，1997，79：233)。因此，VEGF被公认为是阻断肿瘤血管生长的理想靶点之一。众多科学家针对抗VEGF抗体抑制肿瘤生长展开了深入研究，Kim KJ利用VEGF单抗成功地抑制了横纹肌肉瘤、恶性胶质瘤、平滑肌肉瘤在裸鼠体内的生长；Asano(Asano M等，Cancer Res，1995，55(22)：5196)利用VEGF121单抗MV303不仅抑制了体外培养的人脐静脉内皮细胞生长及BALB/C鼠体内人纤维肉瘤细胞株HT-1080的生长，而且抑制了BALB/C鼠转移瘤的形成。广泛的研究证明，抗VEGF抗体具有明显的抑制肿瘤血管生成的功能。
针对血管内皮生长因子，研究人员开发了多种抗体，例如：CN98805914.2(抗－血管内皮生长因子的抗体)、CN02111093.X(人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物)、CN201110007354.5(一种抗血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用)、CN201210185573.7(一种抗VEGF抗体片段的纯化制备方法)、CN201410036335.9(一种抗VEGF抗体及其应用)等等，其中，由美国GENENTECH公司开发的Bevacizumab已被用于治疗乳腺癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、非小细胞性肺癌等等多种肿瘤疾病。
但是，抗体产业化生产很复杂，生产成本高。目前人们多是用常规的培养基来制备抗VEGF抗体，但是用常规的DMEM/F12、RPMI1640等培养基对抗VEGF单克隆抗体进行培养，细胞表达效果不是很好，而且DMEM/F12等培养基价格非常昂贵，这也使得抗VEGF单克隆抗体生产成本进一步提高。
因此，有必要开发一种适合于抗VEGF单克隆抗体的制备的培养基，以便最大限度地提高抗VEGF单克隆抗体的生产效率，降低生产成本。
技术实现要素：
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种新型培养基。具体地，本发明的发明人经过大量的实验研究，在DMEM/F12培养基(Sigma公司购买)的基础上成功开发了一种新型培养基，其特别适于抗VEGF人源化单克隆抗体规模化生产的培养基，与现有商业化DMEM/F12培养基相比，本发明的培养基可大大提高细胞表达率。具体地，
本发明公开了一种新型培养基，其包括：氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物和其他有机分子。
优选地，所述的培养基的氨基酸的组分和用量如下：
更优选地，上述培养基的氨基酸的组分和用量如下：
更优选地，上述任一所述的培养基的微量元素及无机盐的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的微量元素及无机盐的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的维生素的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的的维生素的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的碳水化合物和其他有机分子的组分和用量如下，
更优选地，上述任一所述的培养基的碳水化合物和其他有机分子的组分和用量如下，
最优选地，所述培养基中各组分和用量如下，
另外，发明还公开上述任一所述培养基在抗体生产中的应用，尤其是在抗VEGF人源化单克隆抗体生产中的应用。非常适合于抗VEGF人源化单克隆抗体的生产过程中的细胞培养，可大大提高生产效率。
现有培养基的组分一般包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、微量元素、类固醇激素和相关蛋白替代物，其中，氨基酸：是中主要营养物质之一，用于蛋 白、核酸以及脂类等物质的合成，还可以通过几个主要的中间代谢节点进入TCA循环，用于能量的生成，并同其他营养物质的代谢相关联；无机盐：NaCl维持渗透压平衡，协调共同转运有机大分子进入细胞，K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+等离子则参予代谢与信号转导以及促进贴壁和细胞增殖，各种阴离子(SO42-，NO3-等)，则主要用于调节转细胞膜势能或作为含硫或氮元素有机分子的前体；维生素：培养基中主要营养物质之一，维生素在培养基中存在的量很微量，但在细胞代谢中作为细胞功能有机催化剂，起重要的调控作用；碳水化合物：葡萄糖是主要的碳水化合物，作为主要的碳源和能源物质；微量元素：主要起调节、传递和控制的作用，在无血清培养基中的作用尤为重要，如：Fe：酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分；Cu：超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分；Mg：对ATP酶、激酶等起活化作用；Zn：酶的辅基；此外，培养基中还加入酚红用作培养基pH的指示剂，为适合细胞发酵罐中的大规模培养而添加有0.1％的Pluronic F68以消除剪切力的影响。但是如何对这些成分进行合理设计，是开发培养基的关键。
本发明人通过对DMEM/F12培养基的组分和含量进行适当的改变，经过大量的实验最终确定培养基的各个组分及最佳剂量，从而完成了本发明。实验结果表明，本发明的培养基与DMEM/F12培养基相比，本发明的培养基特别适合于抗VEGF人源化单克隆抗体的生产，细胞培养效率得到了大大提高。
具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。本发明的基础培养基DMEM/F12购自Sigma公司，并按相关要求储存。
实施例1：培养基配制
通过常规方法配制培养基，本发明的培养包括：氨基酸、微量元素及无机盐、维生素、碳水化合物和其他有机分子，优选的3种培养基各组分和用量如下：
培养基1：
培养基2：
培养基3：
培养基干粉配置方法：
将1L用量的干粉加入900ml超纯水中，温度35℃左右，搅拌半小时后，加入一定量的氢氧化钠助溶，然后加入浓盐酸和碳酸氢钠，调节PH到6.5～7.5。用0.2um负压过滤，分装于500毫升的玻璃瓶中无菌避光保存。
本发明获得的培养基的理化性质参数、检测方法和检测结果如表1所示。
表1：培养基检测结果表
从检测结果看，配置的液体培养基结果合格，能够用于CHO大规模悬浮细胞培养。
实施例2：不同培养基在相同培养条件下的细胞培养效果对比
培养条件如下表2所示：
表2：细胞培养条件列表
如上述培养方法，本发明人分别将上述配制好的4种培养基300ml装入1000ml的摇瓶中，再加入CHO细胞，接种密度为6.0×105细胞/ml，放置CO2培养箱中(CO2为5％)中培养，温度为37℃，每隔24小时取样20μl，通过细胞计数仪(购自invitrogen)进行细胞计数，通过MTT法检测细胞存活率，并通过光镜观察细胞成团情况。实验结果如表3所示：
表3：不同培养基培养的细胞密度、细胞存活率和细胞成团情况检测结果表
以上实验结果表明，本发明的培养基1、培养基2和培养基3相比市售的DMEM/F12培养基具有更好的细胞培养效果，且本发明的培养基在细胞培养过程中未见细胞成团现象，而未加肝素的商业培养基DMEM/F12则见有细胞成团现象产生。
另外，本发明人还对CN98805914.2、CN201110007354.5、CN201210185573.7、CN201410036335.9公开的专利文献中获得的CHO细胞，重复上述实施例2的试验，实验结果与上述实施例2的实验结果类似，结果显示本发明的培养基相比市售的DMEM/F12培养基具有更好的细胞培养效果，本发明培养基1、培养基2和培养基3在对上述抗VEGF抗体的细胞培养中，在第5-7天活细胞密度均在86×105--98×105之间，8天细胞存活率均大于80％，且未见细胞成团现象产生。