本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乙肝病毒的PRINS检测方法及其引物和检测试剂盒。
背景技术：
乙肝病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种重要的传染性疾病，可以经过血液等各种体液传播，引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等，严重威胁世界人类的身体健康和生命安全。其中，我国又是乙肝病毒的高发地区，据估计，约有60%的人曾经感染乙肝病毒，携带者高达10%，已感染人群中至少15～25% 最终死于HBV相关的肝病，大部分为肝细胞癌口。因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预防显得极为重要。
当前，对HBV的检测手段主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)。其中ELISA方案的依据是根据抗原抗体反应来检测乙肝病毒的血清标志物(HBV—M) 即HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBsAb、HBeAb的浓度，因此该方案反映的主要是人体对HBV感染的免疫状态，但不能直接反映HBV在患者体内的复制情况，更不能作为判断患者是否具有传染性的直接证据。PCR方案直接扩增并检测血清中HBV的DNA，因此能够反应出在体内的真实扩增和是否有传染性等情况。由此结果判断体内HBV是否正在复制、复制程度、或者经治疗后HBV是否被清除等方面均有重要作用，并为临床观察药物疗效、病情转化等提供依据。
但是，在血清样品内本身的游离DNA很少，在抽提HBV DNA时，容易导致DNA的丢失从而导致检测结果中的HBV DNA含量比实际值降低甚至由于丢失而导致假阴性结果。基于Q-PCR方案的检测体系，进口试剂盒灵敏度仅仅在300拷贝/ml，其灵敏度不满足临床检验的需要。
技术实现要素：
因此，针对目前HBV检测方法灵敏度不高的问题，本发明提供了一种新的乙肝病毒的PRINS检测方法及其引物和乙肝病毒PRINS检测试剂盒。 为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案：一种乙肝病毒的PRINS检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、采集血样，将血样离心后的血清涂布于载玻片，利用固定液将载玻片中的血清固定5-110分钟，固定后用PBS溶液浸泡洗涤，洗涤后的载玻片利用质量百分比0.001-0.25%的蛋白酶K孵育，然后用变性缓冲液处理5-15分钟，处理后的载玻片在90℃-98℃下热处理，使蛋白酶K灭活，然后用PBS溶液浸泡洗涤该载玻片；
步骤S2、将步骤S1处理后的载玻片上加入第一PRINS反应液，在载玻片上放置盖玻片，静置1-90分钟，然后用洗涤液洗涤；
步骤S3、在步骤S2处理后的载玻片上加入第二PRINS反应液，在载玻片上放置盖玻片，进行原位扩增标记反应，将反应后的载玻片放入终止反应液中浸泡，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于洗涤液中洗涤；
步骤S4、将步骤S3处理后的载玻片置于0.1-2mg/mL的碘化丙啶溶液中孵育，孵育后用水清洗，加盖玻片，于荧光显微镜下观察。
其中，步骤S1中所述的固定液为137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L 的KCl，10mmol/L 的Na2HPO4， 2 mmol/L 的KH2PO4 ，4%的多聚甲醛和0.2 mol/L的戊二醛组成的溶液，pH=7.2～7.4，所述的百分数为质量百分数。
其中，步骤S1中所述的PBS溶液为137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L的KCl，10mmol/L的Na2HPO4， 2mmol/L的KH2PO4组成的溶液，pH7.2～7.4 。
其中，步骤S1中所述的变性缓冲液为20mmol/L的甲酰胺，3mmol/L的NaCl和0.3mmol/L的柠檬酸钠组成的溶液。
其中，步骤S2中所述的第一PRINS反应液为：1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜碱，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L ddATP、0.05-0.5 mmol/L ddCTP、0.05-0.5 mmol/L ddGTP和0.05-0.5 mmol/L ddTTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
其中，步骤S3中所述的第二PRINS反应液为：10nM-100μM的上游检测引物，10nM-100μM的下游检测引物，50nM-1mM的封闭引物，1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜碱，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L dATP、0.05-0.5 mmol/L dCTP、0.05-0.5 mmol/L dGTP，0.01-0.5 mmol/L dTTP，0.01-0.5 mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
其中，所述的上游检测引物为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:2，SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，SEQ ID No:6，SEQ ID No:8，SEQ ID No:9，SEQ ID No:10，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的上游检测引物为SEQ ID No:13所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID No:16，SEQ ID No:17，SEQ ID No:18，SEQ ID No:20，SEQ ID No:21，SEQ ID No:22，SEQ ID No:23和SEQ ID No:24中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的上游检测引物为SEQ ID No:25所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:26，SEQ ID No:27，SEQ ID No:28，SEQ ID No:29，SEQ ID No:30，SEQ ID No:32，SEQ ID No:33，SEQ ID No:34，SEQ ID No:35和SEQ ID No:36中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的封闭引物为引物3’端碱基被氨基、磷酸或者双脱氧封闭，使其丧失进行PCR反应的能力。
其中，步骤S3中所述的原位扩增标记反应包括以下步骤：（1）90-98°C预变性0.5-10分钟；（2）90-96°C变性1-90秒；（3）45-68°C退火0.5-3分钟；（4）55-73°C延伸1-5分钟，（2）-（4）循环1-38次；（5）60-73℃延伸1-5分钟。
其中，步骤S3中所述的终止反应液为 0.15-0.75 mol/L NaCl和0.01-0.1 mol/L EDTA 组成的溶液，pH=6.8-8.0。
一种检测乙肝病毒的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物由上游检测引物，下游检测引物和封闭引物组成。
其中，所述的上游检测引物为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:2，SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，SEQ ID No:6，SEQ ID No:8，SEQ ID No:9，SEQ ID No:10，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的上游检测引物为SEQ ID No:13所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID No:16，SEQ ID No:17，SEQ ID No:18，SEQ ID No:20，SEQ ID No:21，SEQ ID No:22，SEQ ID No:23和SEQ ID No:24中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的上游检测引物为SEQ ID No:25所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:26，SEQ ID No:27，SEQ ID No:28，SEQ ID No:29，SEQ ID No:30，SEQ ID No:32，SEQ ID No:33，SEQ ID No:34，SEQ ID No:35和SEQ ID No:36中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
一种乙肝病毒的PRINS检测试剂盒，其特征在于，所述PRINS检测试剂盒包括载玻片、盖玻片、固定液、蛋白酶K、第一PRINS反应液、第二PRINS反应液、阴性对照和阳性对照。
其中，所述的固定液为137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L 的KCl，10mmol/L 的Na2HPO4， 2 mmol/L 的KH2PO4 ，4%的多聚甲醛和0.2 mol/L的戊二醛组成的溶液，pH=7.2～7.4，所述的百分数为质量百分数。
其中，所述的第一PRINS反应液为：1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜碱，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L ddATP、0.05-0.5 mmol/L ddCTP、0.05-0.5 mmol/L ddGTP和0.05-0.5 mmol/L ddTTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶；所述的第二PRINS反应液为：10nM-100μM的上游检测引物，10nM-100μM的下游检测引物，50nM-1mM的封闭引物，1-100m mol/L TrisCl（pH8.8），5-100 m mol/L KCl，1-5 m mol/L MgCl2，0.01-1% 牛血清白蛋白，0.5-2.5 mol/L甘油，0.5-3mol/L 甜菜碱，0.1-3mol/L海藻糖，0.05-0.5 mmol/L dATP、0.05-0.5 mmol/L dCTP、0.05-0.5 mmol/L dGTP，0.01-0.5 mmol/L dTTP，0.01-0.5 mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及0.5-5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
其中，所述的上游检测引物为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:2，SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，SEQ ID No:6，SEQ ID No:8，SEQ ID No:9，SEQ ID No:10，SEQ ID No:11和SEQ ID No:12中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的上游检测引物为SEQ ID No:13所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:14，SEQ ID No:15，SEQ ID No:16，SEQ ID No:17，SEQ ID No:18，SEQ ID No:20，SEQ ID No:21，SEQ ID No:22，SEQ ID No:23和SEQ ID No:24中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
优选的是，所述的上游检测引物为SEQ ID No:25所示的核苷酸序列，所述的下游检测引物为SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:26，SEQ ID No:27，SEQ ID No:28，SEQ ID No:29，SEQ ID No:30，SEQ ID No:32，SEQ ID No:33，SEQ ID No:34，SEQ ID No:35和SEQ ID No:36中所示的一种或多种核苷酸序列的组合。
其中，所述的阴性对照为没有HBV污染的健康人血清。
其中，所述的阳性对照为阳性对照血清，该阳性对照血清中HBV DNA浓度为30拷贝/ml、40拷贝/ml和50拷贝/ml。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：
（1）灵敏度高，按照本发明的方法抽提HBV DNA，并进行PRINS反应，在待检血清中的HBV DNA达到30-50拷贝/ml时，即可以检测出来，灵敏度比现有进口的试剂盒的相应指标有明显提高。
（2）操作简单，常规的检验实验室即可完成该操作，操作人员不需要特殊培训，因而保证了可操作性。
（3）在PRINS阶段，如果没有进口的原位PCR仪，采用国产的同类型PCR仪即可。另外，除了荧光显微镜外，不需要其它的贵重设备，便于普及。
（4）本方案基于载玻片的PRINS方案，直接将待检血清涂布于经处理的载玻片上，保证了样品的完整性，提高了检测灵敏度。由于检测灵敏度的提高，可以在HBV的潜伏期内就可以被检测到，从而可以提前预警，本技术已经稳定在30-50拷贝/ml的灵敏度。
具体实施方式
如下涉及到的载玻片、盖玻片为本领域常规的载玻片、盖玻片，其处理方法也是本领域的公知常识。
实施例1
特异性引物：所述的上游检测引物、下游检测引物、封闭引物分别为SEQ ID No:1、SEQ ID No:7和 SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:1，SEQ ID No:7和SEQ ID No:2所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物10nmol/L，下游检测引物10nmol/L和封闭引物50nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液:137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L 的KCl，10mmol/L 的Na2HPO4， 2 mmol/L 的KH2PO4 ，4%的多聚甲醛和0.2 mol/L的戊二醛组成的溶液，pH=7.2～7.4，所述的百分数为质量百分数。
2）变性缓冲液：20mmol/L的甲酰胺，3mmol/L的NaCl和0.3mmol/L的柠檬酸钠组成的溶液。
3）PBS 溶液：137mmol/L 的NaCl，2.7mmol/L的KCl，10mmol/L的Na2HPO4， 2mmol/L的KH2PO4组成的溶液，pH7.2～7.4 。
4）蛋白酶 K：质量百分数0.025%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
5）第一PRINS反应液（50μl）：10mmol/L TrisCl（pH8.8），50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，0.1% 牛血清白蛋白，2mol/L甘油，2mol/L 甜菜碱，0.5mol/L海藻糖，0.2mmol/L ddATP、0.2mmol/L ddCTP、0.2mmol/L ddGTP和0.2mmol/L ddTTP，以及2.5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
6) 第二PRINS反应液（50μl）：10nmol/L的上游检测引物，10nmol/L的下游检测引物，50nmol/L的封闭引物，2.5mmol/L TrisCl（pH8.8），5m mol/L KCl，1.2mmol/L MgCl2，0.5% 牛血清白蛋白，0.5mol/L甘油，0.5mol/L 甜菜碱，0.1mol/L海藻糖，0.05mmol/L dATP、0.05mmol/L dCTP、0.05mmol/L dGTP，0.01mmol/L dTTP，0.04mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及0.5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
7）洗涤液：0.3mol/L的NaCl，0.03mol/L的柠檬酸钠，0.05%的Tween-20组成的溶液，pH=7.2，其中所述百分比为质量百分比。
8）终止反应液:0.5mol/L NaCl 和0.05mol/L EDTA (pH8.1)组成的溶液；
9）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度1 mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μ离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液室温固定5分钟，固定后用25℃的 PBS溶液洗涤3次，每次5分钟，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K在4°C下孵育15分钟，然后用变性缓冲液于75℃下处理5分钟，处理后的载玻片在96°C条件下干热20分钟，使蛋白酶K灭活，然后在4℃下用PBS溶液洗涤3次，5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在60℃下做PRINS反应1小时，反应后于25℃下用洗涤液洗涤3次，5分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到95°C预变性5分钟, 95°C下变性1分钟，58°C下退火3分钟，64°C下延伸3分钟，做28个循环，最后64°C下延伸5分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，65°C的终止反应液，浸泡1分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于25℃的洗涤液中洗涤3次，10分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，10℃下于暗盒中孵育15分钟，孵育后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例2
特异性引物：上游检测引物、下游检测引物、封闭引物分别为SEQ ID No:13、SEQ ID No:19和SEQ ID No:14所示的核苷酸序列。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:13，SEQ ID No:19和SEQ ID No:14所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物50nmol/L，下游检测引物50nmol/L和封闭引物250nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.1%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：1.5mmol/L TrisCl（pH8.8），5mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.05% 牛血清白蛋白，0.5mol/L甘油，0.5mol/L 甜菜碱，3mol/L海藻糖，0.15mmol/L ddATP、0. 15mmol/L ddCTP、0. 15mmol/L ddGTP和0.15mmol/L ddTTP，以及5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：50nmol/L的上游检测引物，50nmol/L的下游检测引物，250nmol/L的封闭引物，3mmol/L TrisCl（pH8.8），20mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.05% 牛血清白蛋白，2.5mol/L甘油，1.5mol/L 甜菜碱，1mol/L海藻糖，0.08mmol/L dATP、0.08mmol/L dCTP、0.08mmol/L dGTP，0.05mmol/L dTTP，0.03mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度0.15mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液室温固定10分钟，固定后用35℃的PBS溶液洗涤5次，30分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K在65°C下孵育0.5分钟，然后用变性缓冲液于65℃处理10分钟，处理后的载玻片在90°C条件下干热30分钟，使蛋白酶K灭活，然后在10℃下用PBS溶液洗涤3次，0.5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在35℃下做PRINS反应1分钟，反应后于5℃下用洗涤液下洗涤4次，3分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到90°C预变性0.5分钟，90°C下变性1.5分钟，45°C下退火0.5分钟，55°C 下延伸5分钟，做38个循环，最后60°C下延伸1分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，0°C的终止反应液中，浸泡30分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于35℃的洗涤液中洗涤3次，1分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，55℃下于暗盒中孵育1分钟，孵育后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例3
特异性引物：上游检测引物、下游检测引物和封闭引物分别为SEQ ID No:25、SEQ ID No:31和SEQ ID No:26所示的核苷酸序列。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:25，SEQ ID No:31和SEQ ID No:26所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物1000nmol/L，下游检测引物1000nmol/L和封闭引物5000nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.002%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：20mmol/L TrisCl（pH8.8），5mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.01% 牛血清白蛋白，1mol/L甘油，1.5mol/L 甜菜碱，0.15mol/L海藻糖，0.1mmol/L ddATP、0.1mmol/L ddCTP、0. 1mmol/L ddGTP和0.1mmol/L ddTTP，以及3U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：1000nmol/L的上游检测引物，1000nmol/L的下游检测引物，5000nmol/L的封闭引物，50mmol/L TrisCl（pH8.8），50mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，0.8% 牛血清白蛋白，1mol/L甘油，2mol/L 甜菜碱，2mol/L海藻糖，0.2mmol/L dATP、0.2mmol/LdCTP、0.2mmol/L dGTP，0.5mmol/L dTTP，0.1mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及2U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度1.5mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液0℃下固定15分钟，固定后用4℃的PBS溶液洗涤4次， 0.5分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K在45°C下孵育35分钟，然后用变性缓冲液于75℃下处理15分钟，处理后的载玻片在98°C条件下干热1分钟，使蛋白酶K灭活，然后在35℃下用PBS溶液洗涤3次，30分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在73℃下做PRINS反应90分钟，反应后于35℃下用洗涤液下洗涤5次，6分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到98°C预变性10分钟，93°C下变性1秒，68°C下退火1分钟，73°C 下延伸1分钟，做1个循环，最后73°C下延伸3分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，73°C的终止反应液，浸泡10秒，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于30℃的洗涤液中洗涤5次，30分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，0℃下于暗盒中孵育45分钟，孵育后用水冲洗洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于在荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例4
特异性引物：上游检测引物、下游检测引物和封闭引物分别为SEQ ID No:1、SEQ ID No:7和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:1，SEQ ID No:7和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物100nmol/L，下游检测引物100nmol/L和封闭引物800nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.08%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：57mmol/L TrisCl（pH8.8），55mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，0.35% 牛血清白蛋白，1.2mol/L甘油，3mol/L 甜菜碱，2.2mol/L海藻糖，0.3mmol/L ddATP、0.3mmol/L ddCTP、0.3mmol/L ddGTP和0.3mmol/L ddTTP，以及3.5U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：100nmol/L的上游检测引物，100nmol/L的下游检测引物，800nmol/L的封闭引物，100mmol/L TrisCl（pH8.8），100mmol/L KCl，5mmol/L MgCl2，0.65% 牛血清白蛋白，1.3mol/L甘油，2.9mol/L 甜菜碱，3mol/L海藻糖，0.4mmol/L dATP、0.4mmol/LdCTP、0.4mmol/L dGTP，0.3mmol/L dTTP，0.1mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及1.2U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度0.5mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液于55℃下固定40分钟，固定后用10℃的PBS溶液洗涤3次，10分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K在15°C下孵育10分钟，然后用变性缓冲液于75℃下处理5分钟，处理后的载玻片在96°C条件下干热10分钟，使蛋白酶K灭活，然后在4℃下用PBS溶液洗涤4次，5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在55℃下做PRINS反应15分钟，反应后于25℃下用洗涤液洗涤3次，5分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到92°C预变性5分钟，95°C下变性1分钟，50°C下退火3分钟，60°C下延伸3分钟，做2个循环，最后68°C下延伸3分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，15°C终止反应液，浸泡5分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于25℃的洗涤液中洗涤4次，5分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分钟，孵育后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例5
特异性引物：上游检测引物和下游检测引物分别为SEQ ID No:1、SEQ ID No:7所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:8所示的核苷酸序列和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列的等量混合。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:1，SEQ ID No:7，SEQ ID No:8和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物5000nmol/L，下游检测引物5000nmol/L和封闭引物2.8×104nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.12%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：15mmol/L TrisCl（pH8.8），50mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，0.58% 牛血清白蛋白，0.5mol/L甘油，1.8mol/L 甜菜碱，1.5mol/L海藻糖，0.45mmol/L ddATP、0.45mmol/L ddCTP、0.45mmol/L ddGTP和0.45mmol/L ddTTP，以及2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：5000nmol/L的上游检测引物，5000nmol/L的下游检测引物，2.8×104nmol/L的封闭引物，88mmol/L TrisCl（pH8.8），55mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.25% 牛血清白蛋白，1.8mol/L甘油，2.5mol/L 甜菜碱，0.3mol/L海藻糖，0.45mmol/L dATP、0.45mmol/LdCTP、0.45mmol/L dGTP，0.35mmol/L dTTP，0.25mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及1.8U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度2mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液于55℃下固定60分钟，固定后用10℃的PBS溶液洗涤3次，10分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K液在10°C下孵育15分钟后，然后用变性缓冲液于75℃处理5分钟，处理后的载玻片在96°C条件下干热10分钟，使蛋白酶K灭活，然后在4℃下用PBS溶液洗涤4次，5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在45℃下做PRINS反应10分钟，反应后于25℃下用洗涤液洗涤3次，5分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到98°C预变性10分钟，90°C下变性1.5分钟，60°C下退火3分钟，73°C下延伸3分钟，做2个循环，最后68°C下延伸3分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，15°C的终止反应液，浸泡5分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于25℃的洗涤液中洗涤4次，5分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分钟，孵育后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例6
特异性引物：上游检测引物、下游检测引物和封闭引物分别为SEQ ID No:13、SEQ ID No:19和SEQ ID No:23所示的核苷酸序列。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:13，SEQ ID No:19，SEQ ID No:23所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物500nmol/L，下游检测引物500nmol/L和封闭引物2600nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.11%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：29mmol/L TrisCl（pH8.8），37mmol/L KCl，1.2mmol/L MgCl2，0.08% 牛血清白蛋白，1.4mol/L甘油，3mol/L 甜菜碱，1.3mol/L海藻糖，0.14mmol/L ddATP、0.14mmol/L ddCTP、0.14mmol/L ddGTP和0.14mmol/L ddTTP，以及4.2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：500nmol/L的上游检测引物，500nmol/L的下游检测引物，2600nmol/L的封闭引物，47mmol/L TrisCl（pH8.8），65mmol/L KCl，2.9mmol/L MgCl2，0.28% 牛血清白蛋白，0.8mol/L甘油，0.9mol/L 甜菜碱，0.8mol/L海藻糖，0.45mmol/L dATP、0.45mmol/LdCTP、0.45mmol/L dGTP，0.1mmol/L dTTP，0.35mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及3.6U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度1.9mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液于55℃下固定95分钟，固定后用10℃的PBS溶液洗涤3次，10分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K在10°C下孵育15分钟，然后用变性缓冲液于75℃处理5分钟，处理后的载玻片在96°C条件下干热10分钟，灭活蛋白酶K，然后在4℃下用PBS溶液洗涤4次，5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在45℃下做PRINS反应10分钟，反应后于25℃下用洗涤液洗涤3次，5分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到92°C预变性5分钟，95°C下变性1分钟，50°C下退火3分钟，60°C下延伸3分钟，做2个循环，最后68°C下延伸3分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，15°C的终止反应液，浸泡5分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于25℃的洗涤液中洗涤4次，5分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分钟，然后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例7
特异性引物：上游检测引物、下游检测引物分别为SEQ ID No:13、SEQ ID No:19所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:15所示的核苷酸序列和SEQ ID No:17所示的核苷酸序列的等量混合。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:13，SEQ ID No:19，SEQ ID No:15和SEQ ID No:17所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物80nmol/L，下游检测引物80nmol/L和封闭引物450nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.18%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：56mmol/L TrisCl（pH8.8），100mmol/L KCl，2.8mmol/L MgCl2，1% 牛血清白蛋白，2.5mol/L甘油，1.9mol/L 甜菜碱，1.8mol/L海藻糖，0.05mmol/L ddATP、0.05mmol/L ddCTP、0.05mmol/L ddGTP和0.05mmol/L ddTTP，以及3.2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：80nmol/L的上游检测引物，80nmol/L的下游检测引物，450nmol/L的封闭引物，36mmol/L TrisCl（pH8.8），49mmol/L KCl，2.8mmol/L MgCl2，0.08% 牛血清白蛋白，1.4mol/L甘油，1.9mol/L 甜菜碱，1.8mol/L海藻糖，0.5mmol/L dATP、0.5mmol/LdCTP、0.5mmol/L dGTP，0.1mmol/L dTTP，0.5mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及2.4U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度1.2mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液于55℃下固定95分钟，固定后用30℃的PBS溶液洗涤3次，15分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K液在30°C下孵育25分钟后，然后用用变性缓冲液于75℃处理5分钟，处理后的载玻片在96°C条件下干热10分钟，灭活蛋白酶K，然后在20℃下用PBS溶液洗涤4次，5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在45℃下做PRINS反应60分钟，反应后于20℃下用洗涤液洗涤3次，5分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到92°C预变性5分钟，95°C下变性1分钟，50°C下退火3分钟，60°C下延伸3分钟，做25个循环，最后68°C下延伸3分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml终止反应液，15°C，浸泡5分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于25℃的洗涤液中洗涤4次，5分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分钟，孵育后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
实施例8
特异性引物：上游检测引物、下游检测引物分别为SEQ ID No:25、SEQ ID No:31所示的核苷酸序列，所述的封闭引物为SEQ ID No:27所示的核苷酸序列和SEQ ID No:29所示的核苷酸序列的等量混合。
引物的制备：
人工合成上游检测引物、下游检测引物和封闭引物，详细序列见序列表（SEQ ID No:25，SEQ ID No:31，SEQ ID No:27和 SEQ ID No:29所示的核苷酸序列）。合成后的引物进行稀释处理，分别为上游检测引物700nmol/L，下游检测引物700nmol/L和封闭引物5600nmol/L。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下试剂：
1）固定液、变性缓冲液、PBS 溶液、洗涤液和终止反应液包括的组分和含量与实施例1中的组分和含量一致。
2）蛋白酶 K：质量百分数0.25%的蛋白酶K，以PBS溶液溶解；
3）第一PRINS反应液（50μl）：98mmol/L TrisCl（pH8.8），69mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，0.25% 牛血清白蛋白，1.9mol/L甘油，2.3mol/L 甜菜碱，1.2mol/L海藻糖，0.5mmol/L ddATP、0.5mmol/L ddCTP、0.5mmol/L ddGTP和0.5mmol/L ddTTP，以及1.2U的Taq DNA 聚合酶，所述百分比为质量百分比。
4) 第二PRINS反应液（50μl）：1×105 nmol/L的上游检测引物，1×105 nmol/L的下游检测引物，1×106 nmol/L的封闭引物，48mmol/L TrisCl（pH8.8），57mmol/L KCl，4.3mmol/L MgCl2，0.1% 牛血清白蛋白，1.3mol/L甘油，0.8mol/L 甜菜碱，2.2mol/L海藻糖，0.5mmol/L dATP、0.5mmol/LdCTP、0.5mmol/L dGTP，0.114mmol/L dTTP，0.016mmol/L 荧光素标记的dUTP，以及3.5U的Taq DNA 聚合酶，其中所述百分比为质量百分比。
5）碘化丙啶溶液：碘化丙啶溶解于PBS溶液中，浓度0.8mg/mL。
乙肝病毒的PRINS检测方法中包括如下步骤：
1）以促凝血真空采血管采血1 ml，静置30分钟后，在3000转下离心5分钟，取50μl离心后的血清均匀涂布于载玻片中，利用固定液于55℃下固定95分钟，固定后用30℃的PBS溶液洗涤3次，15分钟/次，洗涤后的载玻片利用蛋白酶K在30°C下孵育25分钟，然后用变性缓冲液于75℃处理5分钟，处理后的载玻片在96°C条件下干热10分钟，灭活蛋白酶K，然后在20℃下用PBS溶液洗涤4次，5分钟/次；
2）在载玻片上加入50μl第一PRINS反应液，以ddNTPs为底物在45℃下做PRINS反应60分钟，反应后于20℃下用洗涤液洗涤3次，5分钟/次；
3）在载玻片上加入50μl第二PRINS反应液，这里以dNTPs和荧光标记的dUTP为底物，放置盖玻片，用橡皮泥封闭，将样品加热到92°C预变性5分钟；以95°C变性1分钟，50°C退火3分钟，60°C 延伸3分钟，做25个循环，最后68°C延伸3分钟；
4）去掉盖玻片，将样品载玻片放入50ml，15°C的终止反应液，浸泡5分钟，使原位扩增标记反应终止，然后将载玻片置于25℃的洗涤液中洗涤4次，5分钟/次；
5）将载玻片置于碘化丙啶溶液中，30℃下于暗盒中孵育15分钟，孵育后用水冲洗3次，5分钟/次，加盖玻片，于荧光显微镜下观察，以蓝色和红/绿色重叠为阳性信号。
除了dUTP可以标记用于测定之外，dATP，dCTP，dGTP，dTTP也可以用于标记。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
<110> 上海复阳生物科技有限公司
<120> 一种乙肝病毒的PRINS检测方法及其引物和检测试剂盒
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 32
gcccngtaaa gtttcccacc ttavh 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 33
gcccngtaaa gtttcccacc ttbvh 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 34
gcccngtaaa gtttcccacc tvbvh 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 35
gcccngtaaa gtttcccacc vvbvh 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
gcccngtaaa gtttcccacd vvbvh