一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种萝卜硫素的获取方法，尤其涉及一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法。
【背景技术】
[0002]西兰花中含有丰富的抗癌物质萝卜硫素，被美国《时代周刊》评为十大最佳营养蔬菜之一。西兰花可以增强机体免疫力、促进生长、增强血管韧性等功效，可以预防患乳腺癌、胃癌等癌症的风险。西兰花种子与幼苗中的萝卜硫素含量低，但毛状根培养体系中萝卜硫素的产量高。
[0003]目前，萝卜硫素制备方法主要有化学合成法和酶法。化学合成法工艺复杂，中间产物难以控制;酶法是目前常用的萝卜硫素制备方法。但西兰花毛状根培养体系中萝卜硫素的提取鲜有报道，对萝卜硫素的提取大多数都集中在西兰花幼苗、花蕾、种子中，且未有西兰花毛状根中萝卜硫素外分泌的研究报道。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、高效的从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤:
⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养的西兰花毛状根;然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出所述液体培养基中所述培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末;同时，所述液体培养基封口置于4°C条件下保存；
⑵将新收获的芥籽粉碎至55?65目，得到芥籽粉;该芥籽粉用蒸馏水经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到粗酶液；
(3)将所述冻干的毛状根粉末按照Ig:1OmL?Ig: 30mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35°C下静置酶解0.5?1.5h，然后用体积浓度为70?95%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液；
⑷将所述萝卜硫素粗提液先于45?55°C真空浓缩，再于65°C浓缩，得到膏状物A;所述膏状物A用其质量3?5倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2?3次，得到乙酸乙酯相A;
(5)将所述步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1:1?3的体积比萃取2?3次，得到乙酸乙酯相B;
(6)将所述乙酸乙酯相A与所述乙酸乙酯相B合并后，在50?60°C下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量5?10倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存备用；
⑵将所述萝卜硫素甲醇溶液于40?50°C真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物； (8)所述萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为5?30%的萝卜硫素粗品。
[0006]所述液体培养基均指MS基本培养基。
[0007]所述步骤⑴与所述步骤(8)中冷冻干燥的条件均是指先对材料进行预冷冻，待温度达至lj-35—45°C时抽真空，待压力达到25?35Pa开始加热;从-35至O°C，每5°C为一个阶段，每阶段控温加热0.5?1.5h，最后在5 °C控温加热I?3h即可。
[0008]所述步骤⑵中超声波振荡提取的条件是指料液比为Ig:55?65mL，温度为30?40 °C，超声波功率为700?900W，提取时间为8?12min。
[0009]所述步骤⑶中超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为Ig: 15-30mL，温度为30?40 °C，超声波功率为700?900W，提取时间为15?45min。
[0010]所述步骤⑷和所述步骤(6)及所述步骤(7)中真空浓缩的条件均是指真空度为-0.06?-0.08MPa。
[0011 ]所述步骤⑷中乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为I: I?3。
[0012]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明合并提取毛状根及其液体培养基中的萝卜硫素，且毛状根培养基中含有大量的萝卜硫素，填补了萝卜硫素的分泌性研究空白。
[0013]2、本发明接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体MS培养基中培养一个周期(15d)的西兰花毛状根培养体系中萝卜硫素收获量可达3~6.25mg，毛状根生物量可达4.5?5g。
[0014]3、本发明投资少，工艺简单，适合工厂化生产。
【具体实施方式】
[0015]实施例1一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤: ⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养后的西兰花毛状根;然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出液体培养基中培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末;同时，液体培养基封口置于4°C条件下保存。
[0016]其中:冷冻干燥的条件是指先对材料进行预冻，待温度达到-35°C时抽真空，待压力达到25Pa开始加热；从-35至(TC，每5°C为一个阶段，每阶段控温加热0.5h，最后在5°C控温加热Ih即可。
[0017]⑵将新收获的芥籽粉碎至55目，得到芥籽粉;该芥籽粉用蒸馏水以lg:55mL的料液比在温度为30°C、超声波功率为700W的条件下经超声波振荡提取Smin后真空抽滤除杂，得到粗酶液。
[0018]⑶将冻干的毛状根粉末按照lg:1OmL加入粗酶液，搅拌均匀，于35°C下静置酶解
0.5h，然后用体积浓度为70%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液。
[0019]其中:超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为lg:15mL，温度为30°C，超声波功率为700W，提取时间为15min。
[0020]⑷将萝卜硫素粗提液先于45°C、真空度为_0.06MPa条件下真空浓缩(除去大部分乙醇)，再于65°C浓缩，得到膏状物A(完全除去乙醇)；膏状物A用其质量3倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2次，得到乙酸乙酯相A。
[0021]其中:乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为ImL:l mL。
[0022](5)将步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按I mL:l mL的体积比萃取2次，得到乙酸乙酯相B。
[0023](6)将乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B合并后，在50°C、真空度为-0.06MPa条件下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量5倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存备用。
[0024]⑵将萝卜硫素甲醇溶液于40°C、真空度为-0.06MPa条件下真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物。
[0025](8)萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为5%的萝卜硫素粗品。
[0026]其中:冷冻干燥的条件同步骤⑴。
[0027]实施例2—种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤: ⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养后的西兰花毛状根;然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出液体培养基中培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末;同时，液体培养基封口置于4°C条件下保存。
[0028]其中:冷冻干燥的条件是指先对材料进行预冻，待温度达到-40°C时抽真空，待压力达到30Pa开始加热;从-35至(TC，每5°C为一个阶段，每阶段控温加热lh，最后在5°C控温加热2h即可。
[0029]⑵将新收获的芥籽粉碎至65目，得到芥籽粉;该芥籽粉用蒸馏水以lg:65mL的料液比在温度为40°C、超声波功率为900W的条件下经超声波振荡提取12min后真空抽滤除杂，得到粗酶液。
[0030]⑶将冻干的毛状根粉末按照Ig:30mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35 V下静置酶解
1.5h，然后用体积浓度为95%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液。
[0031]其中:超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为lg:30mL，温度为40°C，超声波功率为900W，提取时间为45min。
[0032]⑷将萝卜硫素粗提液先于55°C、真空度为-0.0SMPa条件下真空浓缩(除去大部分乙醇)，再于65°C浓缩，得到膏状物A(完全除去乙醇)；膏状物A用其质量5倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取3次，得到乙酸乙酯相A。
[0033]其中:乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为ImL:3 mL。
[0034](5)将步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按I mL:3 mL的体积比萃取2次，得到乙酸乙酯相B。
[0035](6)将乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B合并后，在60°C、真空度为-0.0SMPa条件下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量10倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存备用。
[0036]⑵将萝卜硫素甲醇溶液于50°C、真空度为-0.0SMPa条件下真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物。
[0037](8)萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为20%的萝卜硫素粗品。
[0038]其中:冷冻干燥的条件同步骤⑴。
[0039]实施例3—种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤: ⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养后的西兰花毛状根;然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出液体培养基中培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末;同时，液体培养基封口置于4°C条件下保存。
[0040]其中:冷冻干燥的条件是指先对材料进行预冻，待温度达到-45°C时抽真空，待压力达到35Pa开始加热；从-35至(TC，每5°C为一个阶段，每阶段控温加热1.5h，最后在5°C控温加热3h即可。
[0041]⑵将新收获的芥籽粉碎至60目，得到芥籽粉;该芥籽粉用蒸馏水以lg:60mL的料液比在温度为35°C、超声波功率为800W的条件下经超声波振荡提取1min后真空抽滤除杂，得到粗酶液。
[0042]⑶将冻干的毛状根粉末按照Ig:20mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35 V下静置酶解lh，然后用体积浓度为85%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液。
[0043]其中:超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为lg:25mL，温度为35°C，超声波功率为800W，提取时间为30min。
[0044]⑷将萝卜硫素粗提液先于50°C、真空度为_0.07MPa条件下真空浓缩(除去大部分乙醇)，再于65°C浓缩，得到膏状物A(完全除去乙醇)；膏状物A用其质量4倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2次，得到乙酸乙酯相A。
[0045]其中:乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为ImL:2 mL。
[0046](5)将步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按I mL:2 mL的体积比萃取3次，得到乙酸乙酯相B。
[0047](6)将乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B合并后，在55°C、真空度为-0.07MPa条件下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量8倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存备用。
[0048](7)将萝卜硫素甲醇溶液于45°C、真空度为-0.07MPa条件下真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物。
[0049](8)萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为30%的萝卜硫素粗品。
[0050]其中:冷冻干燥的条件同步骤⑴。
[0051 ]上述实施例1?3中的液体培养基均指MS基本培养基。
【主权项】
1.一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，包括以下步骤: ⑴将西兰花毛状根按接种量为鲜重0.1g接种于300mL的液体培养基进行培养，15d后得到增殖培养的西兰花毛状根;然后于超净工作台上，用灭菌后的镊子取出所述液体培养基中所述培养后的西兰花毛状根，置于滤纸上，吸附根表面水分，经冷冻干燥至恒重后研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末;同时，所述液体培养基封口置于4°C条件下保存； ⑵将新收获的芥籽粉碎至55?65目，得到芥籽粉;该芥籽粉用蒸馏水经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到粗酶液； (3)将所述冻干的毛状根粉末按照lg:1OmL?lg:30mL加入粗酶液，搅拌均匀，于35°C下静置酶解0.5?1.5h，然后用体积浓度为70?95%的乙醇经超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液； ⑷将所述萝卜硫素粗提液先于45?55°C真空浓缩，再于65°C浓缩，得到膏状物A;所述膏状物A用其质量3~5倍的乙酸乙酯溶解后经蒸馏水萃取2?3次，得到乙酸乙酯相A; (5)将所述步骤⑴中的液体培养基与乙酸乙酯按1:1?3的体积比萃取2?3次，得到乙酸乙酯相B; (6)将所述乙酸乙酯相A与所述乙酸乙酯相B合并后，在50?60°C下真空浓缩，得到膏状物B，该膏状物用其质量5?10倍的甲醇溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液，该萝卜硫素甲醇溶液于-10°C下避光保存备用； ⑵将所述萝卜硫素甲醇溶液于40?50°C真空浓缩至膏状，即得萝卜硫素粗提物； (8)所述萝卜硫素膏状粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为5?30%的萝卜硫素粗品。2.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于:所述液体培养基均指MS基本培养基。3.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于:所述步骤⑴与所述步骤(8)中冷冻干燥的条件均是指先对材料进行预冷冻，待温度达到_35~-45°C时抽真空，待压力达到25?35Pa开始加热；从-35至(TC，每5°C为一个阶段，每阶段控温加热0.5?1.5h，最后在5 °C控温加热I?3h即可。4.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于:所述步骤⑵中超声波振荡提取的条件是指料液比为lg:55?65mL，温度为30?40 °C，超声波功率为700?900W，提取时间为8?12min。5.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于:所述步骤⑶中超声波振荡提取的条件是指冻干的毛状根粉末与乙醇的料液比为Ig: 15?30mL，温度为30?40 °C，超声波功率为700?900W，提取时间为15?45min。6.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于:所述步骤⑷和所述步骤(6)及所述步骤(7)中真空浓缩的条件均是指真空度为-0.06—0.08MPa。7.如权利要求1所述的一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，其特征在于:所述步骤⑷中乙酸乙酯与蒸馏水的体积比为1:1?3。
【专利摘要】本发明涉及一种从西兰花毛状根培养体系中获取萝卜硫素的方法，该方法包括以下步骤：⑴将西兰花毛状根接种于液体培养基，经增殖培养后冷冻干燥并研磨成粉末，得到冻干的毛状根粉末；⑵将新收获的芥籽粉碎后经超声波振荡提取、抽滤除杂，得到粗酶液；⑶冻干的毛状根粉末中加入粗酶液，经酶解、超声波振荡提取后真空抽滤除杂，得到萝卜硫素粗提液；⑷将萝卜硫素粗提液浓缩后萃取，得到乙酸乙酯相A；⑸将液体培养基萃取，得到乙酸乙酯相B；⑹合并乙酸乙酯相A与乙酸乙酯相B后经真空浓缩、溶解，得到萝卜硫素甲醇溶液；⑺萝卜硫素甲醇溶液真空浓缩，即得萝卜硫素粗提物；⑻萝卜硫素膏状粗提物干燥，即得纯度为5~30%的萝卜硫素粗品。本发明简单，高效。
【IPC分类】C07C331/22, C12P13/00
【公开号】CN105713937
【申请号】CN201610050128
【发明人】李胜, 马绍英, 俞颖, 张真, 李秉建
【申请人】甘肃农业大学