一种猪MITF基因突变的检测方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种导致猪白化和听力缺失的基因突变的检测方法。

背景技术：

mitf(microphthalmia-associtatedtranscriptionfactor)是小眼畸形相关转录因子，mitf蛋白属于tfe转录因子超级家族的成员，具有典型的基本螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(basichelix-loop-helixleucinezipper，bhlh-zip)结构。mitf蛋白能够形成同源二聚体或与tfe3、tfeb、tfec形成异源二聚体，从而结合以“canntg”为核心的e-盒或m-盒序列，起到调控目标基因转录表达的作用。在小鼠的眼发育形成过程中，如果mitf丧失了正常功能，将导致眼裂减小，或导致成年时的小眼畸形。另外，在神经嵴细胞定向分化发育成黑色素细胞过程中，mitf参与了其分化，mitf突变将导致皮肤着色的改变。人类的mitf基因突变会引起waardenburg2a型综合症和tietz综合症，两者均为常染色体显性遗传疾病，表现为皮肤色素减退、虹膜色素异常和听觉神经性耳聋等症状。

小鼠的mitf基因定位于6号染色体的6qd3上，基因组全长约为211.7kb；人类的mitf基因定位于3号染色体的3p14.1上，基因组全长约为228.9kb。它们均由9－10个外显子构成，而且都存在多个不同转录本。ncbi的genbank中，小鼠至少有9种不同的mitf转录本:mitf-a，-a1，-a2，-h，-h1，-h2，-h3，-m和-m1，编码的mitf蛋白的氨基酸长度从349aa变化到526aa；人类也存在10种不同的mitf转录本:mitf-a1，-a2，-b1，-b2，-c1，-c2，-h1，-h2，-m1和-m2，编码的mitf蛋白的氨基酸长度从413aa变化到526aa。在这些不同转录本中，外显子2～9或3～10都同源。

目前有关猪mitf基因的snp检测偶见报道，但基本局限在个别外显子的单个碱基突变，并没有发现与导致猪白化和听力缺失相关的突变。然而，建立用于研究人类waardenburg2a型综合症和tietz综合症的猪模型，亟需确定导致猪产生相同症状的突变位点。

技术实现要素：

针对上述行业和市场的需要，本发明在研究中发现猪mitf基因c.740t>c碱基突变导致猪白化和听力缺失，从而提供一种猪mitf基因突变的检测方法，有助于研究猪mitf基因的分子结构、功能以及分析猪相关毛色基因的遗传学和进化。

本发明提供了一种猪mitf基因突变的检测方法，其包括：

1)通过pcr扩增猪mitf基因的外显子；所述猪为具有全身白化和听力缺失的表型的广西巴马小型猪；

2)判断猪mitf基因的第8号外显子上是否存在c.80t>c的单核苷酸碱基突变；

其中，步骤2)是通过选自dna直接测序、杂交测序、酶切测序、dna芯片技术、变性高效液相色谱中的一种或多种方法实现的。

所述检测方法不用于疾病的诊断和治疗目的。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述pcr的引物包含序列为seqidno:15的正义引物和序列为seqidno:16的反义引物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述pcr的反应条件为：

反应条件：95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃再延伸5min。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)所述pcr的引物包括:

序列为seqidno:1的正义引物和序列为seqidno:2的反义引物；

序列为seqidno:3的正义引物和序列为seqidno:4的反义引物；

序列为seqidno:5的正义引物和序列为seqidno:6的反义引物；

序列为seqidno:7的正义引物和序列为seqidno:8的反义引物；

序列为seqidno:9的正义引物和序列为seqidno:10的反义引物；

序列为seqidno:11的正义引物和序列为seqidno:12的反义引物；

序列为seqidno:13的正义引物和序列为seqidno:14的反义引物；

序列为seqidno:17的正义引物和序列为seqidno:18的反义引物；

序列为seqidno:19的正义引物和序列为seqidno:20的反义引物；

序列为seqidno:21的正义引物和序列为seqidno:22的反义引物。

本发明具有以下有益效果：

本发明确定了一种猪mitf基因有效的单核苷酸突变碱基及相应的编码氨基酸改变，分析碱基突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，为猪的mitf基因的分离和功能分析以及猪相关毛色基因的遗传学和进化分析提供参考，同时，为建造人类听力疾病模型提供基因工程技术帮助。本发明的上述的方法可以应用在建立人类waardenburg综合征的动物模型，进而可以应用在筛选或制备用于诊断和/或治疗人类waardenburg综合征的药物中。

附图说明

图1为本发明实施例2中mitf基因第8个外显子区域pcr扩增产物page电泳示例；

图2为为第8个外显子区域突变点测序结果图；其中，mitf+/-为发生突变的第8号外显子突变部位测序结果图；mitf+/+为野生型的第8号外显子与mitf对应的部位的测序结果图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

本申请通过设计猪mitf基因序列特异性扩增引物，对猪基因外显子区域进行pcr扩增；分离、纯化特异性扩增产物进行核酸序列测定、比对，找寻不同检测个体mitf基因存在的单核苷酸碱基突变，分析基因突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、功能的改变。

本发明所用的广西巴马小型猪购自中国科学院动物研究所北方大动物研究基地。

实施例1引物设计

根据genbank数据库中猪mitf基因序列设计特异引物，如表1所示

表1猪mitf基因序列引物

实施例2应用上述对待检测猪基因外显子区域进行pcr扩增。

1)以下述反应体系和反应条件进行pcr扩增

pcr扩增反应体系，25μl体系：

反应条件：

95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，59℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30个循环后72℃再延伸5min。

2)应用核酸纯化试剂盒(tiangen，dp214)，参照厂商提供方案对pcr扩增产物进行分离、纯化。图1所示为mitf基因第8个外显子区域pcr扩增产物page电泳示例。

实施例3测序及单核苷酸多态检测

对分离纯化的扩增产物进行序列测定、比对分析，得出待检猪mitf基因第8个外显子区域存在单链t>c单核苷酸碱基突变。图2所示为第8个外显子区域突变点测序结果图，其中，mitf+/-为发生突变的第8号外显子 突变部位测序结果图；mitf+/+为野生型的第8号外显子与mitf对应的部位的测序结果图，因此可以确定白化猪的第8号外显子上发生了t>c单碱基突变，即mitf基因c.740t>c碱基突变。

对纯化的猪mitf基因引物pcr扩增产物直接测序，比对不同样本pcr产物测定序列。结果，在被检测的9头广西巴马小型猪实验样本中，mitf基因基因组dna序列第八号外显子上在白化猪种发现有c.740t>c碱基突变。

通过研究发现猪mitf基因dna序列第八号外显子上在白化猪种中存在c.740t>c碱基突变，直接导致编码氨基酸出现l247s改变，氨基酸性质随之发生变化，造成mitf基因功能域超螺旋结构的改变，影响mitf作为转录因子对下游基因的转录调控，进而表现白化和听力缺失，从而为猪作为waardenburg综合征的疾病模型提供遗传依据。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。