猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT‑PCR检测试剂盒及其引物组的制作方法

本发明属于RT-PCR检测技术领域，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种急性、高度传染的病毒性传染病，其主要特征是怀孕母猪发生流产、早产、产死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各种年龄猪、特别是仔猪的呼吸系统疾病。该病病原PRRS病毒(PRRSV)可以分为欧洲型(基因I型)毒株(EU-PRRSV)和美洲型(基因II型)毒株(NA-PRRSV)。我国PRRSV流行毒株以NA-PRRSV经典株、高致病性变异株为主，但在部分省份也检测到EU-PRRSV。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、稳定性好的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其引物组，可同时检测并区分PRRSV野毒株、疫苗株。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

引物1、引物2、引物3、引物4的摩尔比为1∶1∶1∶1。

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，PCR反应液包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。

反转录RT反应液每管15μL，包括：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP1.0μL含各dNTP 10mM，随机引物6聚体50pmol/μL、1.5μL，RNA酶抑制剂40U/μL、0.5μL，RNase H-型反转录酶200U/μL、1.0μL，灭菌双蒸水7μL；PCR反应液每管45μL，包括：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物1至425pmol/μL各1.0μL，灭菌双蒸水16μL。

针对目前猪繁殖与呼吸综合征病毒检测存在的问题，根据NA-PRRSV经典株(C-PRRSV)与变异株(HP-PRRSV)在Nsp2基因的序列差异(变异株在Nsp2基因共缺失90个核苷酸)以及TJM-F92疫苗株(V-PRRSV)在Nsp2基因的序列特点(在缺失90个核苷酸的基础上还另外连续缺失360个核苷酸)，由此，发明人设计了猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR检测引物组，包括两对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.4的碱基序列。其中，引物1和2(B2-F/B2-R)用于区分美洲型经典株、变异株，引物3和4(TJM-F/TJM-R)用于区分野毒株和TJM-F92株，可实现三种不同类型毒株的鉴定在同一个扩增反应中一次性完成。据此，发明人还制备了检测试剂盒，并建立了相应的多重RT-PCR检测方法，该法可以特异检测PRRSV，而与猪的其他重要病原无交叉反应；对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝。临床检测结果表明，本发明具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点，可同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株，为临床快速鉴别检测及流行病学调查提供了有效的技术平台。

附图说明

图1是多重PCR特异性试验结果图，图中：M 2000bp DNA分子质量标准，1四种重组质粒混合物，2 CH-1R，3 HuN4-F112，4 TJM-F92，5 PCV2，6 PRV，7 FMDV，8 CSFV，9阴性对照。

图2是多重PCR敏感性试验结果图，图中：M 2000bp DNA分子质量标准，1-9质粒浓度分别为1.13×10⁹-1.13×10¹拷贝/μL，10阴性对照。

图3是多重PCR重复性试验结果图，图中M 2000bp DNA分子质量标准，1-6相同条件下的6次重复反应。

具体实施方式

以下实施例中，PRRSV美洲型经典毒株(CH-1R株)、美洲型变异毒株(HuN4-F112株)、疫苗毒TJM-F92株、猪瘟病毒(CSFV，疫苗毒C株)、猪口蹄疫病毒(FMDV，疫苗毒O/MYA/BY/2010株)、猪圆环病毒2型(PCV2，疫苗毒LG株)、猪伪狂犬病病毒(PRV，疫苗毒Bartha-K61株)均由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心提供。

1、引物的设计

针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株及疫苗株TJM-F92的Nsp2基因系列特点，利用Primer Express3.0软件设计并合成两对特异性引物。参照GenBank中发表的PRRSV VR-2332株、JXA1株、TJ株基因组序列，设计两对特异性引物，扩增Nsp2基因(表1)。

表1 引物信息

表1中，引物对B2-F/B2-R扩增C-PRRSV 320bp片段、扩增HP-PRRSV和V-PRRSV(TJM-F92株)230bp片段；引物对TJM-F/TJM-R扩增C-PRRSV和HP-PRRSV 493bp片段、扩增V-PRRSV(TJM-F92株)133bp片段。因此，利用引物对B2-F/B2-R和TJM-F/TJM-R扩增出320bp、493bp时为C-PRRSV，扩增出230bp、493bp时为HP-PRRSV，扩增出230bp、133bp时为V-PRRSV(TJM-F92株)。

2、样本制备

取2014-2016年广西各地发病死亡的疑似病猪的脾、肺、淋巴结适量，按比例(1∶4)加入1mol/L PBS(pH7.2)混合研磨后，反复冻融3次，离心取上清提取总RNA。应用所建立的多重RT-PCR，对PRRSV进行检测。

提取病毒总RNA后反转录获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增PRRSV Nsp2基因片段，回收产物，连接载体、转化感受态细胞，选取阳性克隆，提取质粒，进行PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定，证实成功构建了重组质粒标准品。

以CH-1R株、HuN4-F112株的cDNA为模板，由引物B2-F/B2-R扩增产物构建的重组质粒p-CH1R-B和p-HuN4-B；以HuN4-F112株、TJM-F92株的cDNA为模板，由引物TJM-F/TJM-R扩增产物构建的重组质粒p-HuN4-T和p-TJM-T。

3、试剂盒配置

根据研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。试剂盒含有以下试剂：反转录RT反应液、PCR反应液、灭菌双蒸水，其中：

反转录RT反应液每管15μL，包括：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP(各10mM)1.0μL，随机引物6聚体(50pmol/μL)1.5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，RNase H-型反转录酶(200U/μL)1.0μL，灭菌双蒸水7μL；

PCR反应液每管45μL，包括：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物B2-F/B2-R上、下游引物(25pmol/μL)各1μL、引物TJM-F/TJM-R上、下游引物(25pmol/μL)各1μL，

灭菌双蒸水16μL。

4、多重RT-PCR程序及条件

经优化，确定多重RT-PCR的反应条件，包括反转录和PCR扩增两步程序。

20μL反转录体系为：5×Prime Scrip II buffer 4.0μL，dNTP(各10mM)1.0μL，随机引物6聚体(50pmol/μL，购自TaKaRa公司)，PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒1.5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，RNase H-型反转录酶(200u/μL)1.0μL，模板总RNA 5.0μL，灭菌双蒸水7.0μL；反转录程序为：30℃10min，48℃45min，95℃5min。

50μL PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物B2-F/B2-R上、下游引物(25pmol/μL)各1μL、引物TJM-F/TJM-R上、下游引物(25pmol/μL)各1μL，cDNA 5μL，灭菌双蒸水补至50μL；反应程序为：94℃2min；94℃30s，58.9℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

5、本发明实验应用

应用前述配制的试剂盒和确定的最佳反应条件，以PRRSV经典株CH-1R、变异株HuN4-F112、疫苗株TJM-F92、CSFV、FMDV的cDNA以及PCV2、PRV的DNA为模板，进行多重PCR检测其特异性。如图1所示，只有PRRSV的3种毒株呈阳性，而CSFV、FMDV、PCV2、PRV均为阴性，没有交叉反应。结果表明，本发明PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法具有较强的特异性。

将4种重组质粒p-CH1R-B、p-HuN4-B、p-HuN4-T和p-TJM-T作10倍系列稀释成1.13×10⁹-1.13×10¹拷贝/μL，将同一浓度梯度的各种质粒等体积混合后作为模板，进行多重PCR检测其敏感性，结果如图2，结果引物对B2-F/B2-R检测质粒p-CH1R-B、p-HuN4-B的检出下限均为1.13×10³拷贝/μL，引物对TJM-F/TJM-R检测质粒p-HuN4-T、p-TJM-T的检出下限均为1.13×10²拷贝/μL。表明本发明PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法具有较强的敏感性。

以等体积混合后浓度均为1.13×10⁵拷贝/μL的4种重组质粒为模板，进行多重PCR，重复6次反应，分析其重复性。结果如图3，6次重复试验均能扩增出均匀一致的目的片段，表明本发明PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法具有较好的重复性。