利用CRISPR/Cas9敲除人PD‑1基因构建靶向CD19CAR‑T细胞的方法与流程

本发明涉及基因工程、免疫学和肿瘤学领域，尤其是涉及一种利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD-1基因构建可靶向CD19新型CAR-T细胞的方法及其应用。

背景技术：

一直以来，癌症作为人类健康的头号杀手，引起了无数科学家的关注。尽管手术治疗、化疗、放疗等治疗方式的出现改善了癌症病人的病情，然而全球无数癌症患者依旧受到癌症的折磨。2013年，科学家们宣布使用一种新型的免疫细胞疗法成功治愈晚期急性淋巴细胞白血病，给全世界癌症病人带来了新的曙光。这种利用嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)T细胞免疫治疗方法，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，最终达到治愈肿瘤的目的。

CAR-T免疫疗法是目前最具颠覆性潜力的新兴技术之一，欧美及亚洲各国都在积极开展该疗法的临床试验，其中美国开展临床试验项目最多，达41项，占据了全球CAR-T疗法临床试验的74.5％。宾夕法尼亚大学医院、费城儿童医院、美国癌症研究院(NCI)、Fred Hutchinson癌症研究中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心和西雅图儿童医院等是最早开展CAR-T细胞疗法的研究机构。新兴国际生物制药公司如Juno、Kite、Celgene、Cellectis、Bluebird以及传统国际制药巨头如诺华、葛兰素史克、辉瑞、强生等都投入了大量资金和人力到CAR-T疗法的研发中，推动这一极具前景的疗法尽早进入到临床，从而造福癌症及肿瘤患者患者(A service of the U.S.National Institute of Health.http://clinicaltrials.gov)。

CAR-T细胞疗法在晚期难治性白血病和淋巴瘤患者中进行的早期临床试验已经显示出非常振奋人心的结果。宾夕法尼亚大学研究人员今年10月在世界顶尖医学杂志《新英格兰医学杂志》上发表的一项临床试验结果显示，在接受了CTL019输注(靶向CD19抗原的CAR-T疗法)的30名复发性或难治性ALL受试者中，治疗后1个月有27名患者获得完全缓解，其中甚至包括15位已经接受过骨髓干细胞移植的患者，6个月时无反复生存率为67％(20人)，总体生存率为78％(23人)。另外还有1名患者2年随访时仍然持续完全缓解(Grupp SA et al,N Engl J Med 2013,368(16):1509-18)。NCI开展的一项临床试验也展现了良好的结果，该试验入组了20名ALL患儿，在接受CAR-T细胞疗法后，14名达到了完全缓解；12名患儿的骨髓中已检测不到未成熟的白血病细胞，其中10名又接受了干细胞移植，至今无癌生存。研究结果还表明，CAR-T细胞疗法可帮助化疗无应答的患者顺利地过度到骨髓移植治疗。纪念斯隆凯特林癌症中心与NCI在成人患者中开展的1期临床试验也取得了类似的结果(Mazzarella L.2013American Society of Haematology meeting[J]2014,8:390)。

除白血病之外，CAR-T疗法对淋巴瘤也显示了喜人的疗效，NCI领导的CAR-T细胞临床试验招募了15名成人受试者，其中的绝大多数(9名)都患有晚期弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。据Kochenderfer博士及NCI的同事报道，该临床试验的大多数患者都达到了缓解，在7例可评估的DLBCL受试者中4例获得完全缓解，持续时间从9个月到22个月(Kochenderfer JN et al,Blood 2012,119(12):2709-20)。

然而癌细胞在长期的进化过程中也发展出了一套自身的逃逸机制，可以躲过T细胞的摧毁，进而肆无忌惮地扩张。研究人员发现T细胞表面有一个重要的“接头”分子，他们把它称为“程序性死亡受体-1”或PD-1(Programmed Death 1)，正常状态下，它都能明辨“敌我”。但当癌细胞表面出现“PD-L1”(Programmed Death Like 1)的时候，情况就变了。PD-L1蛋白是PD-1的配体，它俩一旦结合便会向T细胞传递一种负向调控信号，诱导T细胞进入静息状态，让其无法识别癌细胞，并且使T细胞自身增殖减少或凋亡，有效解除机体的免疫反应，因此癌细胞可以毫不费力就“登堂入室”。值得一提的是，许多癌细胞表面都存在这种PD-L1蛋白，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤等。于是，科学家们开始思索如何能阻止PD-1与PD-L1的结合，帮助T细胞恢复活性，正常识别癌细胞的威胁，进而全力攻击癌细胞。目前各大国际制药巨头纷纷致力于PD-1抑制剂和抗体药物的临床研究和开发。

最新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9能快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，基于PD-1分子在肿瘤免疫逃逸过程中的重要作用，我们利用CRISPR/Cas9在靶向CD19的CAR-T细胞中将PD-1基因敲除，阻断癌细胞对T细胞的逃逸和抑制作用，使得CAR-T细胞能更加高效地识别和攻击癌细胞。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD-1基因构建可靶向CD19新型CAR-T细胞的方法。

本发明的第二个目的在于提供一种新型CAR-T细胞。

本发明的第三个目的在于提供上述新型CAR-T细胞的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采用以下内容：

一种利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD-1基因构建可靶向CD19新型CAR-T细胞的方法，该方法利用CRISPR/Cas9技术通过使用携带人PD-1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染CAR-T细胞来敲除人PD-1基因，得到可靶向CD19新型CAR-T细胞；其中，人PD-1基因的mRNA序列由SEQ ID No.22至SEQ ID No.26所示的人PD-1基因外显子组成，靶向sgRNA序列由SEQ ID No.27至SEQ ID No.32所示的人PD-1基因靶向sgRNA序列PD-1-Tn组成；Cas9-HF核酸酶由序列表SEQ ID No.33至SEQ ID No.36所示的Cas9-HF-NLS-HA核酸酶序列组成。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)构建携带人PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体

所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG的序列排列规则，且所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于基因的外显子；所述sgRNA在PD-1基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA在PD-1上的靶位点序列由SEQ ID No.27至SEQ ID No.32所示的人PD-1基因靶向sgRNA序列PD-1-Tn组成；合成sgRNA寡聚核苷酸双链，并退火，之后与线性化的慢病毒载体连接，获得携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体；

2)构建携带Cas9-HF核酸酶病毒载体

在Cas9核酸酶氨基酸序列上依次进行1-4个位点的突变，包括N497A、R661A、Q695A和Q926A，得到高保真Cas9-HF核酸酶，之后将高保真Cas9-HF克隆进慢病毒载体，获得Cas9-HF核酸酶病毒载体；

3)转导T细胞

按照MOI＝1-10的值将携带PD-1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染CAR-T细胞，完成敲除人PD-1基因，获得敲除PD-1基因以及表达靶向CD19CAR分子的T细胞，即新型CAR-T细胞。

为实现上述第二个目的，本发明采用以下内容：

一种新型CAR-T细胞，该T细胞中PD-1基因被敲除并且表达靶向CD19的CAR分子，该CAR分子由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的序列组成；

其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.2为引导序列；

SEQ ID No.3至SEQ ID No.10为scFv序列；

SEQ ID No.11至SEQ ID No.12为CD8铰链区；

SEQ ID No.13至SEQ ID No.14为CD8跨膜区；

SEQ ID No.15至SEQ ID No.16为4-1BB胞内结构域；

SEQ ID No.17至SEQ ID No.20为CD3ζ结构域。

将所述CAR分子克隆进慢病毒载体，构建单一编码框的全长CAR序列表达框，利用EF1alpha启动子(序列表SEQ ID No.21)进行表达。

为实现上述第三个目的，本发明还公开了上述可靶向CD19新型CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用，所述肿瘤为CD19阳性肿瘤细胞、CD20阳性肿瘤细胞、CD30阳性肿瘤细胞、CD33阳性肿瘤细胞、CD138阳性肿瘤细胞，优选为CD19阳性肿瘤细胞。

本发明具有以下优点：

本发明应用CRISPR/Cas9技术将CAR-T细胞中的人PD-1基因敲除，阻断肿瘤细胞对T细胞的逃逸和抑制作用，得到可靶向CD19新型CAR-T细胞，该新型CAR-T细胞能更有效地靶向攻击肿瘤细胞，可用来制备用于治疗肿瘤的制剂，尤其是CD19阳性肿瘤细胞的制剂。本发明的制备方法步骤简单、获得的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率高。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1是PD-1敲除CAR设计图。

图2是KD-019CAR分子的表达。

图3是PD-1和Cas9-HF蛋白表达分析。

图4是KD-019CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤率。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

一种利用CRISPR/Cas9特异性敲除人PD-1基因构建靶向CD19的新型CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

1)携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体的构建

sgRNA在PD-1基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG的序列排列规则，且sgRNA在PD-1基因上的靶序列位于基因的外显子；sgRNA在PD-1基因上的靶序列是唯一的，并且sgRNA在PD-1上的靶位点序列由SEQ ID No.27至SEQ ID No.32所示的人PD-1基因靶向sgRNA序列PD-1-Tn组成；

人PD-1基因的mRNA序列由SEQ ID No.22至SEQ ID No.26所示的人PD-1基因外显子组成；

合成sgRNA寡聚核苷酸双链(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)，混合后于95℃退火5分钟，之后与线性化的慢病毒载体lentiGuide-Puro连接，获得携带PD-1基因sgRNA寡聚核苷酸病毒载体；

2)携带Cas9-HF核酸酶病毒载体的构建

在Cas9核酸酶氨基酸序列上依次进行1-4个位点的突变，包括N497A、R661A、Q695A和Q926A，得到高保真Cas9-HF核酸酶，由序列表SEQ ID No.33至SEQ ID No.36所示的Cas9-HF-NLS-HA核酸酶序列组成，之后将高保真Cas9-HF克隆进慢病毒载体lentiCas9-Blast，获得Cas9-HF核酸酶病毒载体；

3)转导T细胞

按照MOI＝1-10的值将携带PD-1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染靶向CD19的CAR-T细胞(记为KD-019CAR-T细胞)，完成敲除人PD-1基因，获得敲除PD-1基因以及表达靶向CD19的CAR分子T细胞，即得到敲除基因后的新型CAR-T细胞。

该特异CAR分子，记为KD-019CAR分子，由序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.20所示的序列组成；其中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.2为引导序列；SEQ ID No.3至SEQ ID No.10为scFv序列；SEQ ID No.11至SEQ ID No.12为CD8铰链区；SEQ ID No.13至SEQ ID No.14为CD8跨膜区；SEQ ID No.15至SEQ ID No.16为4-1BB胞内结构域；SEQ ID No.17至SEQ ID No.20为CD3ζ结构域。将CAR分子克隆进慢病毒载体，构建单一编码框的全长CAR序列表达框，利用EF1 alpha启动子(序列表SEQ ID No.21)进行表达。

图1是PD-1敲除CAR设计图。

对获得的KD-019CAR-T细胞进行体外活性分析

1)T细胞分离培养

通过密度梯度离心分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cell)；利用偶联anti-CD3和anti-CD28抗体的paramagnetic beads(Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28,Invitrogen,Camarillo,CA,USA)富集CD3+细胞，磁珠与细胞比例为3：1；细胞稀释到TNC(total nucleated cell)浓度为(10-30)×10⁶/mL，在培养皿中与磁珠在室温共孵育2-3小时；利用Magnetic particles concentrator(MPC)(Invitrogen)富集CD3+细胞；含有CD3+的细胞在培养皿中重悬于培养液(OpTmizer^TM CTS^TMT-Cell Expansion SFM,Life Technologies)中，终浓度为1×10⁶cells/mL。在37℃、5％CO₂培养箱中培养2天。

2)病毒液的制备

将KD-019CAR分子、人PD-1基因sgRNA以及高保真Cas9-HF核酸酶DNA片段分别克隆进慢病毒穿梭载体；包装载体按照Lenti-X Packaging Single Shots(Takara)说明书进行制备。所有载体进行高纯度无内毒素抽提，共转染Lenti-X 293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48h和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

3)敲除人PD-1基因的KD-019CAR-T细胞的制备

培养T细胞至浓度为(1-2)×10⁶/ml；将状态良好的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×10⁵/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50-70％之间；第二天将适量的携带KD-019CAR分子以及人PD-1基因sgRNA的病毒液和携带高保真Cas9-HF核酸酶的病毒液一同加入细胞培养瓶后，封好口，放入平角离心机后，低速(500g-1000g/min)离心1h，然后放入培养箱中37℃培养。感染后48小时后可以进行下一步的功能实验。

4)利用流式细胞术分析检测CAR分子的表达

离心细胞，用PBS清洗两次后重悬于FACS液中(含0.1％叠氮化钠和0.4％BSA的PBS)；将Biotin-labeled polyclonal goat anti-mouse-F(ab)2抗体(anti-Fab,Jackson Immunoresearch)加入细胞悬液中，4℃孵育30分钟；清洗细胞两次后，加入phycoerythrin(PE)-labeled streptavidin(BD Pharmingen)，室温30分钟；BD FacsCanto II用于获取染色细胞，FlowJo用于分析结果。如图2所示，对照组为感染空载体病毒液的T细胞，几乎检测不到CAR分子的表达；而在感染KD-019 CAR分子病毒液的T细胞中，CAR分子的表达率达到44.7％。

5)Cas9-HF的表达及PD-1基因敲除的验证

首先利用western blotting检测了Cas9-HF核酸酶的表达。感染病毒后的细胞经过离心、清洗以后在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解1小时，高速离心后得到的裂解上清液与4x LDS上样缓冲液混合后在10％Bis-Tris预制胶(Life technologies)中进行分离，然后通过电转将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭一小时，在1：1000的兔抗HA抗体中4℃孵育过夜。用TBST清洗膜3次，用1：5000偶联HRP的羊抗兔IgG二抗室温孵育1小时。用ECL Plus发光液孵育5分钟后，在Tanon 9500机器中曝光。如图3所示，相对于没有感染病毒液的对照T细胞而言，在感染Cas9-HF核酸酶病毒液的T细胞中有很强的Cas9-HF蛋白表达。

接下来利用western blotting检测PD-1蛋白在CAR-T细胞中的表达情况。感染病毒后的细胞经过离心、清洗以后在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解1小时，高速离心后得到的裂解上清液与4x LDS上样缓冲液混合后在10％Bis-Tris预制胶(Life technologies)中进行分离，然后通过电转将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭一小时，在1：1000的兔抗人PD-1抗体中4℃孵育过夜。用TBST清洗膜3次，用1：5000偶联HRP的羊抗兔IgG二抗室温孵育1小时。用ECL Plus发光液孵育5分钟后，在Tanon 9500机器中曝光。如图3所示，相对对照组，PD-1的蛋白表达量在敲除组有明显的下降。

6)KD-019CAR-T细胞杀伤测试

利用7-AAD/CFSE细胞毒性测试试剂盒评估KD-019CAR-T细胞对肿瘤细胞Raji的杀伤力。CSFE标记肿瘤细胞后，以每孔2×10⁴的细胞铺于培养板中，分别以10：1、3：1和1：1的比例将KD-019 CAR-T细胞加入肿瘤细胞中，培养20小时后离心去上清，细胞沉淀清洗之后用7AAD染色，BD FacsCanto II用于获取染色细胞，FlowJo 用于分析结果。如图4所示，相对于不感染病毒和感染空载体病毒液的对照组，KD-019CAR-T细胞对靶细胞Raji有明显的杀伤作用，并且在KD-019CAR-T细胞中敲除人PD-1基因能显著提高该杀伤率。

本发明的CAR分子能特异性靶向识别CD19阳性的肿瘤细胞。本发明的Cas9-HF核酸酶能有效降低CRISPR/Cas9基因组编辑过程中的脱靶现象。利用本发明方法敲除PD-1基因后得到的靶向CD19新型CAR-T细胞可用于评估对白血病癌细胞的靶向杀伤力，对正常细胞的副作用，以及用于白血病及其他淋巴癌、淋巴瘤等各类血液癌症。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。