一种PEP‑1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法与流程

本发明涉及细胞穿膜肽靶向运输的技术领域，特别涉及一种PEP-1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法。

背景技术：

近年来发现的细胞穿透肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)为大分子药物的跨膜转导开辟了新的途径。细胞穿透肽又称为蛋白转导域(proteintransduction domains,PTDs),是一类能携带大分子物质穿过细胞膜进入胞浆和胞核的小分子肽段。PEP-1是一种人工设计的细胞穿透肽,它已经成功的把GFP、β-Gal等大分子蛋白转导进入多种哺乳动物细胞。目前对PEP-1穿膜活性的研究多采用人工合成肽段再与目的蛋白非共价相结合的方法,合成PEP-1的成本高,难以进行大规模生产,细胞穿透肽和目的蛋白的非共价结合效率低、不稳定,这都给PEP-1穿膜活性的研究带来了不便。

目前，关于PEP-1肽介导绿色荧光蛋白转染各种细胞已经得到了广泛的应用，例如《基础医学与临床》2007年7月的第27卷第7期第798-801页，公开了一篇题为《细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导》的论文，介绍了利用PEP-1介导绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导的方案，该方案利用小鼠活体做为实验基础材料，利用基因工程的方法将PEP-1肽与绿色荧光蛋白进行连接，再连接到pET15b原核表达载体上，注射入小鼠体内，检测绿色荧光蛋白表达的区域，证明PEP-1载体可以将营养物质转移到大脑、心肌、肝、脾和肾组织中，以此来证明PEP-1载体可以将营养物质进行跨膜转导到小鼠的重要器官，但是，该技术方案并未披露任何关于PEP-1穿膜肽可以介导绿色荧光蛋白转移到胚胎细胞中的信息，而且，该技术方案利用小鼠活体做为试验，试验成本高，可重复利用率低，因此，在PEP-1肽介导绿色荧光蛋白转导细胞的过程中，有必要解决以下几个问题：(1)通过合理改进，进一步减少利用活体、器官做试验来研究蛋白或营养物质在活体、器官内的新陈代谢作用的常规手段；(2)高效、准确的将大分子物质导入水牛胚胎细胞。

技术实现要素：

鉴于上述内容，有必要提供一种PEP-1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法，进一步减少利用活体、器官做试验来研究蛋白或营养物质在活体、器官内的新陈代谢作用的常规手段；高效、准确的将大分子物质导入水牛胚胎细胞的目的。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种PEP-1肽介导绿色荧光蛋白转导水牛胚胎的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)PEP-1-EGFP和EGFP片段的优化：将PEP-1肽段连接到EGFP蛋白的N端，形成PEP-1-EGFP融合片段，对融合片段进行密码子优化，并亚克隆至puc57-simple载体中，命名为，puc57-PEP-1-EGFP；将EGFP蛋白片段亚克隆至puc57-simple载体中，命名为，puc57-EGFP；

(2)原核表达载体pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP的构建：

A、用Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切所述puc57-PEP-1-EGFP和puc57-EGFP，切胶回收获得PEP-1-EGFP和EGFP片段；

B、用Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切pCZN1载体，切胶回收获得线性化的pCZN1载体片段；

C、将PEP-1-EGFP和EGFP片段分别与线性化的pCZN1载体片段进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，扩大培养，提取质粒，得到pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP载体质粒；

(3)蛋白的原核表达：将步骤(2)中构建好的pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP载体质粒分别转染表达菌株，提取质粒经过琼脂糖凝胶电泳验证，获得阳性克隆；将阳性克隆菌接种于细菌培养液中并加入IPTG进行诱导蛋白PEP-1-EGFP-His和EGFP-His表达，并通过SDS-PAGE分析诱导后的蛋白表达情况，收集诱导表达后的菌体进行蛋白纯化，通过SDS-PAGE分析纯化后的蛋白表达情况，并通过应用HIS抗体进行蛋白印迹，检测所表达纯化的PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白；

(4)蛋白转染：用PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白转染CHO细胞，并进行跟踪记录，根据记录情况选取PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白转染CHO细胞的最佳浓度、时间，对水牛的胚胎细胞进行转染。

进一步的，所述优化后的PEP-1-EGFP融合片段核酸序列为seq1，表达的蛋白序列为seq2。

进一步的，所述感受态细胞选用大肠杆菌DH5α细胞，连接酶为T₄连接酶。

进一步的，所述转染的表达菌株为Arctic Express，转染条件为，42℃热激60s，迅速插冰2min，之后进行转染菌株的培养，制备含有阳性克隆的质粒。

进一步的，所述蛋白的原核表达过程中，将pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP的阳性克隆菌液分别按照阳性克隆菌菌液与培养液的体积比为1：100接种于培养液中；培养液选用LB培养液，培养条件为37℃，220rpm摇床培养，菌体OD₆₀₀为0.6-0.8时完成培养，IPTG诱导条件为，37℃，220rpm摇床培养4h。

进一步的，所述蛋白纯化过程为，将诱导表达后的培养菌液进行低温离心后用lysis buffer重悬菌体沉淀，在超声条件下将菌体沉淀进行破碎，将超声破碎的细胞裂解液进行离心分离收集包涵体沉淀，使用包涵体洗涤液洗涤包涵体；用溶解缓冲液溶解洗涤之后的包涵体，低温放置过夜后，在室温条件下进行离心，将溶液用pH7.8的EDTA Buffer缓冲液成倍梯度稀释，稀释后在pH7.4的PBS溶液中透析过夜，透析后将包涵体溶液加入镍离子螯合亲和层析柱中进行层析，收集层析过程的流出液，加入pH7.4的磷酸缓冲盐溶液进行透析过夜，完成蛋白纯化过程。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明利用水牛的胚胎细胞做为最终的感染受体，哺乳动物，特别是高级哺乳动物的胚胎细胞是一类特殊的细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，无论在体外还是体内环境，胚胎细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，发明人利用PEP-1肽构建原核生物载体表达蛋白能高效、迅速介导大分子物质靶向作用进行体外胚胎细胞的绿色荧光蛋白的转导，将会大大提高目的大分子的靶向作用，借助胚胎细胞的全分化能力，可以诱导携带目的物质的胚胎细胞进行分化，并观察该目的物质在胚胎分化过程中的代谢、化学效力等作用，不需要针对活体或者单个器官进行实验，一定程度上节省了实验成本，而且更加高效、准确。

2、本发明先将本发明需要目的核苷酸亚克隆至puc57-simple载体中进行优化，再将目的基因通过限制性内切酶进行酶切，与原核表达载体pCZN1进行连接，进行表达，生产相应的蛋白，利用此方法进行基因优化有效的改进了常规手段中从自然界筛选目的基因，工作量大、不准确的缺陷，同时还克服了直接进行基因合成的过程成功率低，基因表达不完全的缺陷，能精确、快速的得到目的基因，减少试验成本，以期提高水牛体外胚胎的发育率或为研究大分子物质的功能提供模型。

【附图说明】

图1是本发明PEP-1-EGFP-His蛋白的原核表达SDS-PAGE分析图，其中，M、蛋白Marker；1、IPTG＝0mM；2、IPTG＝0.2mM；3、IPTG＝0.5mM；4、包涵体；5、上清；

图2是本发明EGFP-His蛋白的原核表达SDS-PAGE分析图,其中,M、蛋白Marker；1、IPTG＝0mM；2、IPTG＝0.2mM；3、IPTG＝0.5mM；4、包涵体；5、上清；

图3是本发明PEP-1-EGFP-His蛋白纯化前后SDS-PAGE分析图，其中，M、蛋白Marker；1、纯化前；2、废液；3、纯化后；

图4是本发明EGFP-His蛋白纯化前后SDS-PAGE分析图，其中，M、蛋白Marker；1、纯化前；2、废液；3、纯化后；

图5是本发明PEP-1-EGFP-His蛋白纯化后蛋白印迹检测图，其中，M、蛋白Marker；2、PEP-1-EGFP-His蛋白；

图6是本发明EGFP-His蛋白纯化后蛋白印迹检测图，其中，M、蛋白Marker；2、EGFP-His蛋白；

图7是本发明PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白的浓度分别为20μg/mL的穿透CHO细胞的绿色荧光效果表达图；

图8是本发明PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白的浓度分别为60μg/mL的穿透CHO细胞的绿色荧光效果表达图；

图9是本发明PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白的浓度分别为100μg/mL的穿透CHO细胞的绿色荧光效果表达图；

图10是本发明PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白的浓度分别为30μg/mL穿透水牛胚胎的绿色荧光效果表达图，其中，A、PEP-1-EGFP-His穿透水牛胚胎前的效果；B、PEP-1-EGFP-His穿透水牛胚胎后的效果；C、EGFP-His穿透水牛胚胎前的效果；D、EGFP-His穿透水牛胚胎后的效果。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

1、PEP-1-EGFP融合片段的设计及优化：

分析PEP-1和EGFP肽段的结构特点，将PEP-1肽段设计于EGFP蛋白的N端，对PEP-1-EGFP融合片段进行密码子优化，优化后的核酸序列如seq1，表达的蛋白序列如seq2，将优化后的序列及EGFP序列亚克隆至puc57-simple载体中，命名为pUC57-PEP-1-EGFP和pUC57-EGFP。

2、原核表达载体pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP的构建：

(1)应用Nde Ⅰ(Fermentas)和Xba Ⅰ(Fermentas)酶切上述的pUC57-PEP-1-EGFP和pUC57-EGFP，胶回收获得PEP-1-EGFP和EGFP片段，酶切体系为：酶切体系为pUC57-PEP-1-EGFP或pUC57-EGFP质粒3μg，10×FastDigest 5μL，3μL Nde Ⅰ，3μL Xba Ⅰ，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；

(2)应用Nde Ⅰ(Fermentas)和Xba Ⅰ(Fermentas)酶切pCZN1载体(购自南京中鼎生物技术有限公司)，胶回收获得线性化的pCZN1载体片段，酶切体系为：酶切体系为pCZN1质粒3μg，10×FastDigest 5μL，3μL Nde Ⅰ，3μL Xba Ⅰ，加水至50μL，37℃孵育3h；将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，测定浓度，存于-20℃，备用；

(3)连接上述a、b两步获得的产物，连接体系：1μL T4ligase(Fermentas)，1μL 10×T4ligase Buffer(Fermentas)，线性化的pCZN1载体片段30ng，PEP-1-EGFP或EGFP片段30ng，加水至10μL，16℃过夜连接。将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒并进行序列测定，得到pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP载体质粒。

3、PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白原核表达、纯化提取、内毒素去除及Western Blot检测：

(1)阳性克隆制备：pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP载体质粒分别转化表达菌株Arctic Express，具体为：将pCZN1-PEP-1-EGFP质粒0.5μL加入到100μL Arctic Express感受态细胞中，冰上静置30min；42℃热激60s，迅速插入冰上2min，加入0.5mL的LB培养液；37℃，220rpm摇1h后，均匀地涂布于含50μg/mL Amp的LB培养皿中，37℃倒置培养12h，挑取单克隆菌落到3mL的含50μg/mL Amp的LB培养液中，37℃，220rpm摇12h后，提取质粒并经1％的琼脂糖凝胶电泳验证，获得阳性克隆。

(2)蛋白的原核表达：将pCZN1-PEP-1-EGFP和pCZN1-EGFP的阳性克隆菌液分别按1：100的比例接种于10mL的LB培养液中，37℃，220rpm摇至菌体OD₆₀₀为0.6-0.8时，取1mL菌液离心收集菌体，加入100μL 1x上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的9mL菌液中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃，220rpm摇4h，诱导PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白表达，取1mL菌液离心收集菌体，加入100μL 1x上样缓冲液重悬菌体沉淀，进行12％SDS-PAGE分析，如图1所示，结果显示在常规诱导条件(IPTG终浓度0.5mM，37℃)下，菌株Arctic Express能够成功高表达PEP-1-EGFP-His且以包涵体的形式为主，如图2所示，结果显示在常规诱导条件(IPTG终浓度0.5mM，37℃)下，菌株Arctic Express能够成功高表达EGFP-His蛋白，且以包涵体的形式为主。

(3)蛋白纯化：将诱导表达后的培养菌液低温离心6000g，10min后，用20ml lysis buffer(20mM Tris-HCl containing 1mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail,pH 8.0)重悬菌体沉淀，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集包涵体沉淀；使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；.用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素，pH8.0)溶解包涵体，4℃放置过夜后，在室温条件下15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20mM Tris-HCL 5mM EDTA Buffer PH7.8缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于PBS pH7.4溶液中透析过夜；利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜；进行12％SDS-PAGE分析，如图3、图4所示，可知，PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白纯化后杂质含量明显减少，可以得到较纯的包涵体。

(4)蛋白内毒素去除：首先，活化树脂。将预装柱置于铁架台，垂直固定，去除预装柱顶部的盖子，打开流速控制器，使保护液在重力作用下流干，勿使柱床干燥，沿柱壁缓缓加入5ml冷的再生缓冲液调节流速控制器，保持流速在0.25ml/min(或者10滴/min)，待再生缓冲液流干，再加入5ml再生缓冲液，重复操作两次以上，确保体系无热原(即内毒素)存在。其次，平衡树脂。活化完毕，沿柱壁缓缓加入6ml的平衡缓冲液，调节流速控制器，保持流速在0.5ml/min，流干平衡缓冲液。在此过程中需用平衡缓冲液冲洗柱壁，重复该平衡步骤两次以上。再次，内毒素去除。将流速控制器关闭，使用无热源枪头将样品沿柱壁加入，打开控制器，控制流速为0.25ml/min或10滴/min，流出液体积达到1.5ml后，开始使用无热源接收管收集流出液，样品流干后，再加入1.5ml-3.0ml的平衡缓冲液淋洗，收集淋洗液，并合并保存。

(5)Western Blot检测：制备聚丙烯酰胺凝胶；按照0.1ug/孔的量上样蛋白样品后，先90V跑完积层胶，再将电压升至200V直到电泳结束；取下凝胶进行转膜，条件为恒压100V，约为1.5小时；电转结束后，取下膜并用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤4次，每次5分钟，然后置于37℃5％脱脂奶粉封闭液中封闭1小时；用封闭液按1：500的比例稀释一抗，并将膜浸泡在一抗稀释液中37℃反应1小时；洗膜4次，每次5分钟；用含5％牛奶的封闭液按1：1500的比例稀释二抗，膜在二抗中37℃反应1小时；洗膜4次，每次5分钟，ECL显影，成像拍照如图5、图6所示，可知，PEP-1-EGFP-His和EGFP-His蛋白纯化后杂质含量明显减少，可以得到较纯的包涵体，而且能对抗体有抗性，可表达蛋白。

4、PEP-1-EGFP-His蛋白感染细胞条件摸索：

蛋白添加前一天，CHO细胞培养于35mm的培养皿中，培养基为含10％进口胎牛血清(FBS)的DMEM，培养条件为37℃，5％的CO₂，蛋白添加当天，按照0μg/mL，20μg/mL，60μg/mL和100μg/mL的浓度进行添加，并分别于1h，2h，3h，4h后进行荧光观察拍照如图7、图8、图9所示，可知在蛋白浓度越大，时间越长，则绿色荧光蛋白在CHO细胞的富集越多PEP-1肽能有效的介导绿色荧光蛋白穿透细胞，感染CHO细胞，可以达到向CHO细胞靶向运输药品、营养物质的目的，其中，蛋白浓度为20μg/mL以上，60μg/mL以下是最佳转染浓度，3h-4h为最佳转染时间。

5、PEP-1-EGFP-His蛋白进行胚胎感染：

如图10所示，根据PEP-1-EGFP-His蛋白感染CHO细胞的摸索，选出最佳的感染条件，最佳条件为：30μg/mL的蛋白，感染时间为4h，在此条件下往水牛胚胎培养液中添加终浓度为30μg/mL的蛋白，对照组用终浓度为30μg/mLEGFP-His蛋白在同等条件下感染水牛的胚胎细胞，4h后进行荧光观察对比，A、B是PEP-1-EGFP-His穿透水牛胚胎的绿色荧光效果检验；C、D是EGFP-His穿透水牛胚胎的绿色荧光效果检验图，由此发现利用本法明构建的PEP-1-EGFP-His蛋白能靶向的介导绿色荧光蛋白在水牛胚胎中的转运。

综上所述，使用本发明的方法进一步减少了利用活体、器官做试验来研究蛋白或营养物质在活体、器官内的新陈代谢作用的常规手段；能达到高效、准确的将大分子物质导入水牛胚胎细胞的效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。