一种基于ATP4B基因体DNA的表观修饰检测引物对及试剂盒的制作方法

本发明涉及一种用于基因体DNA甲基化修饰检测。更具体地，涉及基于PCR检测ATP4B基因体DNA甲基化修饰引物对及试剂盒。

背景技术：

胃癌是世界上最主要的恶性肿瘤之一，到目前为止仍然是世界上第三大致死性癌症，在亚洲的发病率越来越高(Bray F，et al.Lancet Oncol 13:790-801,2012；Ushijima,T.,J Biochem Mol Biol,2007.40(2):p.142-50.)，由于缺乏早期发现的有效检测手段，在就诊患者中，90％以上处于中晚期。而对于中晚期的患者，临床治疗多以化疗为主，这样的治疗方式虽然能在一定程度上抑制肿瘤的发展，但化疗所产生的副作用以及后期病人对化疗药的耐受，是不可忽视并亟需解决的问题，因此鉴别胃癌早期诊断和监测化疗敏感性的分子标志物及治疗靶点具有重要的临床应用价值(Bloushtain-Qimron,N.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2008.105(37):p.14076-81；Schneider,B.G.and R.M.Peek,Jr.,Cancer Prev Res(Phila),2013.6(4):p.253-6.)。

胃H⁺，K⁺-ATP酶(ATP4)是异源二聚体(<αβ>2)，由两个催化α-亚基和两个调节β-亚基组成，编码基因分别为ATP4A和ATP4B。ATP4在胃-肠壁细胞中表达，ATP4A除了在胃中高表达，在人体组织中也呈现出广泛表达模式，因此被认为其发挥着管家基因的作用；而ATP4B在细胞和组织中的表达呈特异性，因为被认为是胃功能基因。

ATP4作为胃中质子泵泵出H(+)交换管腔中的K(+)，也是胃酸性分泌的最后一步。ATP4B是胃H，K-ATP酶重要的组成部分，对保持胃组织结构与功能的平衡不可缺少(Scarff,K.L.,et al.,Gastroenterology,1999.117(3):p.605-18.)，如ATP4B曾被报道在小鼠模型中对其胃壁细胞生长和发挥功能起着重要作用。用于ATP4过度活化可能导致酸消化性溃疡疾病和胃黏膜炎症，因此ATP4是酸相关性胃疾病(胃及十二指肠溃疡和胃食管反流病)治疗中药物(如抑酸药如质子泵抑制剂，PPI)的主要药物靶标(Sachs,G.,et al.,J Clin Gastroenterol,2007.41Suppl 2:p.S226-42.)。

抑酸药如质子泵抑制剂在全球应用非常广泛，相关药物市场达数百亿美元，在美国属于非处方药，因而存在滥用的风险。最近研究发现，使用抑酸药抑制质子泵包括ATP4与胃癌发生的风险有相关性。如一项Meta分析的11项研究，汇集94558名参与者(5980例胃癌患者和88578名对照组)表明抑酸药物的使用与胃癌风险增加有显著关联。有报道提示ATP4在人胃癌组织中的低表达，与胃非贲门腺癌患者的不良预后相关(Herrmann,M.,et al.,Scand JGastroenterol,2007.42(11):p.1275-88；Ordonez,G.R.,et al.,Genome Biol,2008.9(5):p.R81.)。最近的研究表明，ATP4B在胃癌中的表达下调(Hasegawa,S.,et al.,Cancer Res,2002.62(23):p.7012-7；Kim,B.,et al.,Cancer Res,2003.63(23):p.8248-55；Wang,G.,et al.,PLoS One,2013.8(5):p.e63826.)。但ATP4B也曾被报道在人肝细胞癌中高表达(Shao,R.X.,et al.,World J Gastroenterol,2005.11(13):p.1995-9.)。这些研究虽印证ATP4B在胃癌发生发展过程中的重要性，但到目前为止仍然没有确定ATP4B在胃癌发生发展过程中的异常表达及机制其调控方式，及ATP4B功能的中断是否与胃癌的发展有关(Scarff,K.L.,et al.,Gastroenterology,1999.117(3):p.605-18.)。因此，ATP4B是澄清胃癌发生是否与采用质子泵抑制剂等阻断胃酸从而抑制H，K-ATP酶重要线索(Toh,B.H.,J.W.Sentry,and F.Alderuccio,Immunol Today,2000.21(7):p.348-54.)。ATP4B有可能成为胃酸抑制剂治疗是否导致胃癌发生的重要靶点，但如何检测ATP4B在胃细胞/组织中的特异性早期表达变化是一挑战。

表观遗传调控模式，如DNA甲基化和组蛋白修饰等，在正常发育和组织特异性基因表达中起着重要的作用(Deaton,A.M.,et al.,Genome Res,2011.21(7):p.1074-86.)。表观遗传调控是一个可逆的和渐进的过程，它的改变极大程度上参与了如胃癌等慢性炎症相关的癌症的发生(Lorincz,M.C.,et al.,Nat Struct Mol Biol,2004.11(11):p.1068-75；Ordonez,G.R.,et al.,Genome Biol,2008.9(5):p.R81)。事实上，肿瘤抑制基因在基因启动子区域由于甲基化引起的沉默是癌细胞最明确的表观遗传标志，因而对于胃癌的早期检测，治疗和预后评价具有重要意义。因此，鉴于表观遗传学改变对于癌症发生的重要性，界定在肿瘤发生过程中的组织特异性的表观遗传改变以进行精准医疗研究是亟不可待的(Jjingo,D.,et al.,Oncotarget,2012.3(4):p.462-74.)。

细胞/组织中基因的特异性表达可受基因体(intragenic)DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传模式调控的(Shao,R.X.,et al.,World J Gastroenterol,2005.11(13):p.1995-9.)。细胞/组织特异性的DNA甲基化多发于基因体内的CpG岛。基因体内近TSS位点的DNA甲基化被认为是基因转录沉默以及组织特异性表达的重要原因(Jjingo,D.,et al.,Oncotarget,2012.3(4):p.462-74.)。这种调控紊乱与癌症的发生发展密切相关。

发明人在近期的研究中首先发现ATP4B在胃癌细胞系和胃癌组织中mRNA分别呈现出低表达的状态；而胃正常人永生化细胞系GES-1以及癌旁组织中mRNA和蛋白呈现表达状态(如图1所示)，提示ATP4B的表达在人胃癌肿瘤组织和细胞株显著降低经过进一步筛选鉴定，肿瘤组织细胞中ATP4B基因体呈现高甲基化状态具显著性(如图2所示)。另外，使用表观药曲表观药物DNA甲基化抑制剂5-aza-21-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza)和组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin，TSA)以及二者联合用药可逆转ATP4B在胃癌细胞和胃癌组织中表达沉默，而且表观药物5-Aza和TSA可引起的组蛋白乙酰化可显著且特异地富集在ATP4B基因体区域，提示ATP4B在胃癌细胞和胃癌组织中表达沉默受表观调控(如图3所示)，表明ATP4B在胃癌中表达沉默与其基因体(intragenic)DNA高甲基化和与低组蛋白修饰相关。

为验证ATP4B基因体DNA高甲基化和与低组蛋白修饰的胃癌组织特异性，发明人检测了ATP4B在肝癌和胰腺癌细胞株的表达与表观调控。虽然在肝细胞癌和胰腺癌细胞中，ATP4B也呈现表达沉默(图4A、B)，并伴随着DNA高甲基化(图4C、D)，但不被表观药物5-Aza等逆转(图4A、B)，表明其转录表达可能不受表观遗传机制调节。这些结果提示ATP4B基因体DNA高甲基化和与低组蛋白修饰的胃癌组织特异性。

发明人进一步通过观察ATP4B基因体表观修饰在表观及其它化疗药物的作用下的变化，探讨ATP4B基因体的表观修饰的胃癌组织特异性及其在化疗药物敏感性中的作用。大蒜的主要成分DATS可以通过表观调控机制转录调节另一抑癌基因MT2A。MT2A属于金属硫蛋白家族，其作为一个金属的储存和运输的重金属结合蛋白(Babula,P.,et al.,Metallomics,2012.4(8):p.739-50.)。MT2A的表达也具有组织特异性，因此发明人想探究ATP4B在胃癌中发挥作用的方式是否类似于MT2A。经研究发现虽然DATS能上调MT2A在胃癌中的表达，但其并不能上调ATP4B的表达(图4E)(Pan,Y.,et al.,Antioxid Redox Signal,2016.)。数据表明，ATP4B基因体的DNA甲基化和组蛋白乙酰化调控的胃癌组织特异性，对化疗药物反应呈现选择性，即ATP4B基因体的表观调控与药物反应的特异性相关。

在培养和原代肿瘤细胞中均证实了表观药物的抗肿瘤作用，其通过改变表观调控的通路和影响肿瘤细胞对化疗药敏感性起作用(Azad,N.,et al.,T NatRev Clin Oncol,2013.10(5):p.256-66.)。发明人研究结果表明表观药物5-Aza和TSA及其联用可显著抑制胃癌细胞的增殖(图5)；作用可能是由于其诱导ATP4B表达；而且在胃癌细胞中外源性表达ATP4B也具有同样的肿瘤抑制作用(图6)，提示ATP4B基因体的表观调控与胃癌发生相关。重要的是，ATP4B的表达能增加DOC对胃癌细胞生长的抑制作用(图6)，说明ATP4B可增强胃癌细胞对化疗药的敏感性，进一步提示ATP4B基因体的表观沉默可作为胃癌发展的早期的的分子诊断标志物，还可为胃癌化疗敏感性靶标。其中，DOC是经美国药物管理局批准用于治疗包括胃癌在内的多种癌症广泛应用的化疗药物之一(Kang,B.W.,et al.,Molecules,2016.21(5))。

上述研究发现不仅为胃癌的发生发展提供了新的机制，也为胃酸抑制剂的临床应用提供新的线索，因而具有重要的科学价值和临床意义。基于表观变化的早期发生及可逆转的特点，ATP4B基因体区域DNA高甲基化和与低组蛋白修饰，可作为胃癌，尤其是由胃酸减少、萎缩性胃炎渐进向胃癌发展的早期的的分子诊断标志物，并可为胃酸抑制剂的临床应用、胃癌化疗等提供监测，还可为胃癌的靶向治疗及化疗敏感性提供了新的途径。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供ATP4B基因体DNA片段在制备胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物、药物作用靶点或试剂盒中的应用；

本发明的第二个目的在于提供一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物；

本发明的第三个目的在于提供一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的试剂盒中。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明公开了ATP4B基因体DNA片段在制备胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的药物作用靶点、分子标志物或试剂盒中的应用。

进一步，所述ATP4B基因体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(即ATP4B基因转录起始位点上游1000bp至下游7000bp的ATP4B基因体DNA序列)。优选的，所述ATP4B基因体DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(即ATP4B基因转录起始位点上游500bp至下游2200bp的ATP4B基因体DNA序列)。

本发明还公开了一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的分子标志物：所述分子标志物为如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示核苷酸序列上发生的表观修饰；其中，所述表观修饰包括但不限于DNA甲基化修饰和DNA相关组蛋白修饰。

本发明进一步公开了一种用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测的试剂盒，包括ATP4B基因体DNA片段的甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GAGTTTTAGCGTTATTGTTGGAATTCGGATAC-3'(如SEQ ID No.3所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-GTACCCCACCGAAACAAAATACG-3'(如SEQ ID No.4所示)；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GGAGTTTTAGTGTTATTGTTGGAATTTGGATATG-3'(如SEQ ID No.5所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-CACACATACCCCACCAAAACAAAATACA-3'(如SEQ ID No.6所示)。

利用上述甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果ATP4B基因启动子区存在甲基化，则会得到70bp大小的片段；如果ATP4B基因未发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的Tm 58.8，GC含量37.5％，下游引物的Tm 59.0，GC含量47.8％。

利用该非甲基化引物，以硫化修饰后的DNA为模板进行MSP扩增，如果ATP4B基因未发生甲基化，则会得到76bp大小的片段；如果ATP4B基因发生甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本发明将该引物称为非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm 56.83GC含量32.4％，下游引物的Tm59.1，GC含量39.3％。

如果上述两个76bp大小的片段均呈现在PCR扩增产物中，则提示ATP4B基因发生部分甲基化。

进一步，所述试剂盒还包括用于MSP的甲基化对照DNA模板和非甲基化对照DNA模板；

其中，所述用于MSP的甲基化对照DNA模板为经硫化修饰后的呈现90％以上高甲基化的DNA；优选的，为经硫化修饰后在ATP4B基因体区域呈现90％以上高甲基化的肿瘤细胞DNA。

所述用于MSP的非甲基化对照DNA模板正常组织细胞DNA；优选的，为ATP4B基因体区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA。

进一步，所述试剂盒还包括作为阴性系统对照的去离子水；

进一步，所述试剂盒还包括MSP反应所需的PCR反应试剂。

本发明的有益效果如下：

本发明所述ATP4B基因体DNA片段可有效用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测及药物作用靶点检测。本发明基于PCR检测ATP4B基因体DNA甲基化的试剂盒可以特异地检测ATP4B基因体相关的DNA甲基化水平，还能够对ATP4B基因体相关的DNA甲基化水平进行特异、定量检测。检测结果可以为胃癌患者病情及个体化用药监测、肿瘤早期预警，也为患者对药物治疗的愈后提供了评价方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出了ATP4B在胃癌细胞系、胃癌组织及其相邻癌旁组织中的表达。A.半定量RT-PCR分析人胃癌细胞系及永生化胃细胞系GES-1中ATP4BRNA水平的表达。B.定量RT-PCR(RT-qPCR)定量分析ATP4B在胃癌细胞系和GES-1细胞中的mRNA水平。采用2^-ΔΔCt方法分析ATP4B的相对表达量，其与GAPDH mRNA水平相关。实验结果以平均值±标准差(SD)呈现。C和D.蛋白免疫印迹法分析ATP4B在胃癌细胞系和GES-1(C)，或配对胃癌组织及其相邻癌旁中的蛋白水平(D)。

图2人胃癌中ATP4B基因的DNA甲基化。A.ATP4B基因组结构示意图，显示甲基化特异性PCR(MSP)、硫化测序(BS)及ChIP-PCR扩增分析ATP4B基因的区域位置，每条竖线代表一个CpG位点,数字代表着相距TSS的位置。TSS：转录起始位点；ChIP：染色质免疫共沉淀反应。B-D：MSP分析胃癌细胞系及GES-1(B)、14例正常胃组织样本(C)和23例人原发胃癌组织(D)中的ATP4B基因的DNA甲基化状态。E.ATP4B基因的DNA甲基化与胃癌的关系。**:p<0.01，胃癌与胃正常组织中ATP4B基因的DNA甲基化比较。F.ATP4B基因的甲基化的硫化测序验证。BGC823细胞系、GES-1细胞系、正常胃组织样本(N1)和人原发胃癌组织(T12)硫化测序的代表性结果。U：非甲基化；M：甲基化；IVD：体外的甲基化DNA作为MSP阳性控制；NL：正常血液淋巴细胞DNA作为MSP阴性控制。实心圆代表CpG二核苷酸甲基化位点，空心圆代表非甲基化位点。

图3胃癌细胞系经表观药物处理后ATP4B、ATP4A的mRNA表达及组蛋白修饰的变化。A.RT-qPCR分析表观药物5-AZA和/或TSA(5-AZA:5μΜ,96h；TSA:5μΜ,24h)处理后ATP4B的表达变化。ATP4B mRNA在每个细胞系的相对表达采用2^-ΔΔCt方法以GAPDH均化并进一步与其未处理组相比较。结果以平均值±标准差呈现。5-AZA:5-aza-2’-脱氧胞苷，TSA:曲古抑菌素A。B.RT-PCR分析表观药物处理前后ATP4A在胃癌细胞系中的表达。C.蛋白免疫印迹分析5-AZA或TSA处理后BGC823细胞系的表达。D.用抗H3K9ac抗体或非特异对照抗体IgG对5-AZA,或TSA,或DATS(40μΜ,12h)处理后BGC823进行染色质免疫共沉淀。通过qPCR检测分析共沉淀得到的DNA片段中，H3赖氨酸乙酰化在ATP4B基因体区域的富集，结果以相对于Input的百分比呈现。DATS:己二烯三硫化物。

图4ATP4B在人肝细胞癌(HCC)和胰腺癌细胞系中的表达沉默与表观调控无关。A和B：半定量RT-PCR分析ATP4B在人肝细胞癌细胞系和永生化肝原细胞L02(A)或人胰腺癌细胞系(B)中的mRNA表达水平。C和D：MSP分析ATP4B在肝细胞癌细胞系(C)或胰腺癌细胞系(D)中的DNA甲基化状态。E.RT-PCR分析胃癌细胞系BGC823经DATS(40μM,12h)处理后表达ATP4B和MT2A的情况。MT2A的表达作为DATS处理的阳性控制。MT2A:金属硫蛋白2A。

图5表观药物对胃癌细胞增殖的影响。5-AZA(5μM)每天给药，连续三天，或TSA(5μM)处理1天，或5-AZA每天给药、连续三天再TSA继续处理1天，处理后的细胞进行MTT检测。A.BGC 823.B.MGC803.C.SGC7901.5-AZA:5-aza-2’-脱氧胞苷；TSA:曲古抑菌素A。数据以平均值±标准差呈现(n＝3),*P<0.05,**P<0.005，与对照组形成显著性差异。

图6多烯紫杉醇(DOC)的抗GC细胞增殖作用。A.蛋白免疫印迹分析外源性ATP4B表达载体(ATP4B)瞬时转染到BGC823，MGC803和SGC7901细胞后的表达。B.MTT检测GC细胞接受多西他赛(20nM)每天给药、连续三天处理后的细胞增殖情况。ATP4B:外源性ATP4B表达载体；DOC:多西他赛。数据表示为平均值±标准偏差(n＝3),**P<0.05,***P<0.005。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：ATP4B基因体DNA甲基化的专用引物的设计

根据DNA甲基化修饰在基因体分布特性(Maunakea AK.,et al.Nature 2010,466(7303)；Jjingo D.,et al.Oncotarget 2012；3(4).)，通过人工比对分析，从GenBank选取特定的ATP4B基因序列中富含CG的DNA区域，用软件Primer Express 3.0设计多条引物对,筛选出以下甲基化引物和非甲基化引物，所有引物由天一辉远技术公司合成。

所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GAGTTTTAGCGTTATTGTTGGAATTCGGATAC-3'(如SEQ ID No.3所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-GTACCCCACCGAAACAAAATACG-3'(如SEQ ID No.4所示)；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列为：5'-GGAGTTTTAGTGTTATTGTTGGAATTTGGATATG-3'(如SEQ ID No.5所示)，下游引物核苷酸序列为：5'-CACACATACCCCACCAAAACAAAATACA-3'(如SEQ ID No.6所示)。

实施例2：检测ATP4B基因体DNA甲基化修饰的试剂盒的组成

一种检测ATP4B基因体DNA甲基化修饰的试剂盒，即用于胃癌早期诊断、化疗敏感性检测及药物作用靶点检测的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的甲基化引物，核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的非甲基化引物、用于MSP的甲基化对照DNA模板(经硫化修饰后在ATP4B基因体区域呈现90％以上高甲基化的DNA)、非甲基化对照DNA模板(ATP4B基因体区域呈现非甲基化的正常组织细胞DNA)、作为阴性系统对照的去离子水、PCR反应试剂。

实施例3：细胞及组织中ATP4B甲基化的检测

(1)细胞系DNA的提取流程

将生长状态良好、处于生长对数期的胃癌细胞系和正常胃细胞系，用胰酶消化后进行细胞计数，收集至1.5mL离心管中，细胞数约为10⁵至10⁶个。13000rpm离心10s，弃上清后加入200μL 1×PBS重悬细胞，再次洗涤之后，将细胞重悬于180μL 1×PBS中，以下步骤参照Biomed基因组DNA快速提取试剂盒操作手册，具体操作如下：

在细胞悬液中加入20μL，20mg/mL蛋白酶K，充分混匀后加入200μL的结合液，70℃放置10min。冷却后加入100μL异丙醇，将混合物加入吸附柱，13000rpm离心30s，弃废液。加入500μL抑制物去除液，12000rpm离心30s，弃废液。加入500μL漂洗液，12000rpm离心30s，弃废液，重复两次。用100μL的洗脱液将吸附柱上的DNA洗脱后，NanoDrop测定DNA浓度，DNA-20℃放置。

(2)胃组织DNA提取流程

从液氮罐中取出冻存的胃组织，切取约200mg，作为冷研钵研磨组织标本。

每100mg组织标本加入200μL提取液，20μL，20mg/mL的蛋白酶K，混匀置于70℃恒温水浴锅中，消化16h。之后步骤同细胞系DNA提取流程。

(3)细胞系和组织DNA样品硫化

取1ug基因组DNA于0.2mL离心管中，用ddH₂O稀释至20μL。以下步骤参照ZYMO EZ DNA Methylation Gold Kit操作手册，具体操作如下：

在离心管中添加130μL CT溶液至20μL的DNA样品中，将样品放入PCR仪中，98℃10min，64℃2.5h，将样品转入吸附柱中。加入600μL Binding Buffer，颠倒混匀。12000rpm离心30s，弃废液。加入100μL Wash Buffer，12000rpm离心30s，弃废液。加入200μL Desulphonation Buffer，室温放置20min，12000rpm离心30s，弃废液。加入200μL Wash Buffer，12000rpm离心30s，弃废液，重复两次。用10μL Elution Buffer洗脱DNA，放置于-20℃保存。

(4)甲基化特异性PCR

MSP非甲基化引物序列：

上游引物5'-GGAGTTTTAGTGTTATTGTTGGAATTTGGATATG-3'(如SEQ ID No.3所示)

下游引物5'-CACACATACCCCACCAAAACAAAATACA-3'(如SEQ ID No.4所示)

MSP甲基化引物序列：

上游引物5'-GAGTTTTAGCGTTATTGTTGGAATTCGGATAC-3'(如SEQ ID No.5所示)

下游引物5'-GTACCCCACCGAAACAAAATACG-3'(如SEQ ID No.6所示)。

用于PCR扩增的反应体系如表1：

表1PCR扩增的反应体系

每一组PCR反应包括一个阳性对照(Human Methylated DNA Standard)，一个阴性对照(正常人外周淋巴细胞DNA)。

普通PCR反应条件为：95℃10min，95℃30s；60℃30s；72℃30s；35个循环，72℃7min，反应产物经2％的琼脂糖凝胶电泳确认。

(5)结果判定

图2以硫化修饰后的人外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化对照，硫化修饰后的Human Methylated DNA Standard(北京艾德生物有限公司)作为甲基化对照，去离子水作为阴性系统对照建立对照体系，分别用甲基化引物及非甲基化引物对胃癌细胞系和组织标本进行MSP检测，图4同时对肝癌和胰腺癌细胞DNA进行MSP检测。

IVD标记为甲基化对照，NL标记非甲基化对照，H₂O为阴性系统对照。

结果判读方法如下：

用甲基化引物(图中以M表示)进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物(图中以U表示)进行扩增，无扩增产物的标本，判读为完全甲基化；

用甲基化引物及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物的标本，判读为部分甲基化；

用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物的标本，判读为非甲基化。

部分甲基化及完全甲基化的标本均判读为甲基化。

扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图所示：如图2B中，六株胃癌细胞系中，AGS,MGC803和SGC7901为甲基化状态；BGC823和NCI-N87均为部分甲基化状态,胃永生化细胞系GES-1为部分甲基化状态；图2C中，除N14为部分甲基化状态，其余组织均为未甲基化状态；图2D中，胃癌组织均为甲基化或部分甲基化状态。图4C和4D中，肝癌和胰腺癌细胞系均为甲基化或部分甲基化状态。

实施例4亚硫酸氢钠测序法验证

(1)亚硫酸氢钠修饰和PCR扩增

胃癌细胞系BGC823，正常胃细胞系GES-1，胃正常组织N1以及胃癌组织T12硫化过程如前所示。

引物设计：BSP的引物位于测序序列的侧面，覆盖MSP引物和TSS，PCR产物的大小为240bp。引物序列如下：

上游引物5'-GGAGGATTTTAGGTTAGGGA-3'(如SEQ ID No.7所示)

下游引物5'-CACTATCAAAAACCCTCTACTC-3'(如SEQ ID No.8所示)

用于PCR扩增的反应体系如表2：

表2PCR扩增的反应体系

PCR反应条件为：95℃10min，95℃30s；60℃30s；72℃30s；35个循环，72℃7min，反应产物经2％的琼脂糖凝胶电泳确认后在紫外凝胶成像仪内将正确的单一条带切胶回收，放置干净的1.5mL的离心管中。

(2)PCR产物胶回收

参照天根琼脂胶DNA回收试剂盒说明书操作流程进行，具体如下：

用移液器吸取500μL的BL液体，将其加入到收集管中，12000rpm离心1min，弃废液。称取1.5mL EP管中切下来的胶块的重量。按较快重量吸取适量的溶胶液，置于1.5mL EP管中，将EP管放置于50℃电热恒温水浴箱中，至胶块完全溶解。将溶胶液转移到含有吸附柱的收集管中，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃废液。加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，重复一次。12000rpm离心2min，室温风干。加入30μL洗脱液，12000rpm离心2min，NanoDrop测定产物浓度后置于-20℃保存。

(3)PCR产物的连接与转化

参照pGEM-T Cloning Kit说明书操作，具体如下：

在0.5mL离心管中加入表3中各组分：

表3组分组成

混匀后，置于4℃过夜连接。将连接产物加入到50μL刚解冻的DH-5α感受态

细胞内，使其混匀后置于冰上，反应30min。42℃反应90s，迅速置于冰上2min。在1.5mL的离心管中加入250μL无抗性的LB液体培养基，200rpm，37℃孵育1h。在氨苄抗性的LB培养板上加入8μL，500mM IPTG，40μL，20mg/mL X-gal将其均匀地涂开，倒置于37℃恒温培养箱，30min。取出菌液，4000rpm离心1min，弃上清，保留150μL液体，加入到培养板上，涂板，先正置于37℃电热恒温培养箱培养30min，然后倒置于培养箱内，继续培养14h。用枪头挑取挑大的、白色的克隆，将其置于含有0.1％氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，培养14h。

(4)质粒提取

以下步骤参照全式金EasyPure Plasmid MiniPrep Kit操作手册，具体操作如下：

去上述过夜培养的菌液，12000rpm离心1min，弃上清。加入250μL含RNase A的RB溶液，震荡沉淀，使细菌悬浮。加入250μL LB溶液，温和混匀，使溶液呈蓝色透亮。加入350μL NB溶液，轻轻混合数次，至形成黄色凝集块后室温静置2min。12000rpm离心5min，吸出上清加入离心柱，12000rpm离心1min，弃废液。加入650μL WB溶液，12000rpm离心1min，弃废液。12000rpm离心2min，弃废液。加入30μL EB溶液，室温静置1min后，12000rpm洗脱DNA，将洗脱后的DNA置于-20℃保存。

(5)重组子鉴定及测序

采用Sph I和Not I双酶切体系进行鉴定，双酶切反应体系如表4：

表4双酶切反应体系

酶切反应条件为：30℃，30min；37℃，30min，经1％琼脂糖胶鉴定后送公司测序。用SP6引物进行测序，分析测序结果。

(6)结果判定

图2F中白色空心圆代表非甲基化位点，黑色实心圆代表甲基化位点。如图所示，胃癌细胞BGC823以及胃永生化细胞系GES-1均为半甲基化状态，正常组织N1为未甲基化状态，胃癌组织T12为甲基化状态，与实施例3的MSP检测结果基本一致。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京交通大学

<120> 一种基于ATP4B基因体DNA的表观修饰检测引物对及试剂盒

<130> JLC16I0546E

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8000

<212> DNA

<213> ATP4B基因体DNA片段

<400> 1

aagcttgtca ccaaagtcct ttcttccatc accacctcac tgatccttgc cacagatcag 60

taactcatca atcaccagtc tcaccttaca ggtgaggagg ccaaggctgg ctttgcactt 120

ccagagctgg ccaggaagct acacgtgccc gacacacctg ttacatctca tggccacagc 180

acatcccaac gcaggctcaa gcacactgaa actcactatg tcgagccctg ttacccggac 240

ccataggtta ctgagttctt gtatttctaa ttaaagattt tattaacact taagattaat 300

ataaagtaat actatatatt gtatcacaat gcaatataaa agttaataaa atcattgttt 360

tgttaatatt taccataaaa gttatattta tctttgaagc actaagatca atacctaggg 420

acaccattct actctgtggg attgcaggtc aaagattaaa tacaaattta tttaaataaa 480

ggccctttaa tagcatagaa acaatatata ttcatacaat aaaatgtaag ctgaaaaatg 540

cacggaacaa aatatgtgtg ctgtgaccac agacgcgttc tgaaaaatac gtgcgctgtg 600

attgcagacg cgttctgaaa aatacgtgta ccataatcac agaccctcct gaaggagagg 660

agggaagggg aagggcctgt gagtgctgct caccccggaa cgtgccctca ccgcaatcag 720

agcagacaaa gctgcagcca agggcgtccc aagagcagca gggtgaggaa agcgggcctg 780

gcccgcccca ggggcaacag ccgggctgca cccagcccct ggtgtttggt gaggcgatgg 840

ccggcgctga taaacggccc tggcctctcc ctgggatcct tcgcctgcga tgcctttgac 900

ctctggcaga ggaaactata aagcccagag gtgggcatct ggcctcagtc tgggcgtaga 960

gggtgcaggg agcagacggg aggatctcag gccagggacg atggcggctc tgcaggagaa 1020

gaagacgtgt ggccagcgca tggaggagtt ccagcgttac tgctggaacc cggacacggg 1080

gcagatgctg ggccgcaccc tgtcccggtg gggtacgtgc ggggggcggg ccggctgggt 1140

gcatggaggg ggccgctctg aggacgcagc ctccaggtga gctcaggagg aggggagcag 1200

agggcccctg acagtgagac cccgatgctg cctggatggc gtggacgggc ttcggccagg 1260

gcctcacttg cctcccaggg aaagcgaggg tccccagagc atcctgaagg ctgagttgac 1320

ctggagcccc agctgcagaa cgccggtgga gggcgtccac agactggccc caaatgtcag 1380

ccgtatgtct gagaacagca ttttaaaagt atgtttctaa agtgaatcat tttgaaaata 1440

acgtgaaagg tggcaacggt gattccttgg tcacacagat tcacgcaatg acctgaataa 1500

ggggctctgc cgagacgcgg ctgccagccc ctttccggga cacccgctgg cgtccagatg 1560

cggaggtggg gagtaaacca ggcctgcctc agcctgcagc acctgcgcct tgtgcgaggt 1620

ctgccctgca gggtcctgtc cccgtggctg cacagaggcg cgggcagcct ggccctcctg 1680

ggaggaaagc agatgcctgg gcctccaagg ccacacaggt ggtggaagcg tctgcgtcta 1740

catcagggct gccacacccg ttccgggaaa cgccctcacc ccttatgaga gagtctggag 1800

gaagcacctg tgcgccccca cctccccctg cgacccctgg gcgtcgggat gcggctgaac 1860

tggctggcct ggtgccgtcc ccggctccca gggaaggtca ggccctcctc aattcccacg 1920

gtgcccggct ctgggggtcc cagagccgag gtgggaatgc aaagccccag gcccgcccca 1980

cctgtgtgtg tagctgagac gtgctgggaa tgcccgtgac acgctgccaa atcccccaca 2040

ctcaccacag tgctggtgaa ggctgcagcc cccgctggag gctccacggt ctcaaagggc 2100

accagagcca gctggagtca tgggcgcatt tgaagtagaa caaatacccc gttcctagag 2160

aggcagggac cgggggcaga agggcctcct gggccaggcg gggcggcaga gcgggaggcc 2220

aggatgggga aggagctgag ggcgggggct gggctggggc tgccggccag gtccttggaa 2280

gccccatctt ttgggccatt ctagatgctg agactcccat gtgccgcctc ctggctgcag 2340

ggccacagag aaccttctgg aatggtctca ctgcctggcc ggtagacatg gcctccgttt 2400

gggataagaa agtcttaggg ccccaggaaa acacaactca agtgaaatga caaaaacaaa 2460

aggaatagga cacgttattc ttactaattg ggggacgggt gcaggtgcag gagaggcaga 2520

gtgagctgca cccggccggc cccaggagct ggcgggaatg ggactctcag tcacctccca 2580

acccctcccc tgtgcactgc agcgtgccct gaacaccgtg gtgcaagcgg gggcccagga 2640

agtgcaggga gcatggccct cccgagcctg ggcccagcct ggccaacctc gggctcctac 2700

ccgggaggca gggctgagcc gcctggtgga gctgagactc gccacagagt gggtcagcag 2760

ccactgggga gacacgcacc gcccacatct ccactgtgca ccacgggccc cagagcagac 2820

ccacaggacc cacagcgggg gaacagagac ccctgccgtc acgagcgtag gtccccgggg 2880

gacaggcggc caagtcaaat agaagccaca tcaggagtga cctggggaca ctgaggcagg 2940

acctgcaggg ccagcaccag ggaggcacca ggcgtgatcc agtgacagga cagaaaccct 3000

ccaccactgc gggccccaca ctgctgaagc tggaaactca aaaccggagg ctgaagccaa 3060

gctgctgtgg ccacacaaga acgccgtcac cagggacgcc cggcggggaa aggagggact 3120

caaagtggat gccaggtgag caagacccag ccctgagccc agctggtgct gaagggacct 3180

ggctcagaga tctgtgctgt cccagctcac agaagagggc aggcagtcca caggccacag 3240

cctctcatca cagctcaggg ctctggcctc ttggccctgc actcccttgc ttctctgact 3300

tggtcctgcc ctttggttgt gttttgggtc actggagaac ggctcactaa gcagaatcca 3360

tgccacatca gcggagagga ggagcaggag gcccagttca ttacagactt tccagaaaga 3420

caaaagccgt agcaaacaca aaaccgtcct cttcctgccg gtgtctccct gcaaatgcct 3480

cctgcgatcc acacaagcta atttacagag acgaagacag cacacaggca gtcgcctgtg 3540

tccaggagcc gcccatggcc acggggacgg tggcttccgt taggttctga cgctgcaggg 3600

gaagctcaca ggagggtctc agaagcagat gagatgaagc tgcaccctga gttgccggtg 3660

cctatggaca cccttgcttc tgagaagagc catctccagg gcttcccttc ctccctttct 3720

cttcctgatg tctttgtgga agcaggaccg gccatgcact tccaggctgc actatgggtc 3780

accatgggca ggaccccacc tctctgcctc agtttccctt cctgtgatgg gggaaccata 3840

actcccccct cagagggccc tcggttcctg ctggagctgg ggtggtggcg catcctcggc 3900

cacatctcaa acagcggctg gagtgaaggc agctgggtgc aactgcctcg ggtcgcagga 3960

ttctgcctat gtggacgtcc agacgggcaa acccagaggc agaacgtggc cggtggtgcg 4020

gcgctgggag gggattgtag tgactgtttg tggggacggg gtttctgttt tgggggagga 4080

gaatgttctg gaactaggta gggaagatgg tcacgccaca tcacggacgc gctcaaggcc 4140

accgaattgt gtgcgttaaa atggctgacg tggtaaattt tgtgcctgcc ttgtgtcgca 4200

gtgtggatca gcctgtacta cgtggccttc tacgtggtga tgactgggct cttcgccctg 4260

tgcctctatg tgctgatgca gacagtggac ccgtacacac cggactacca agaccagcta 4320

cggtcaccag gtaagcgccc gggatgttgc ccccatgccg tgtgacaggc caggctgccg 4380

cctcctcggc tctggagacg cccgggggac ccgtgccctc cccagaaatg aagcccaggg 4440

aagccagccc ggcagcccca gggtgagcca cacaccccag caggtgcccc cgagggcagc 4500

ccctggcccc tgaaccggct ttaagagcag caccaaggca taagcggccc cttagtttct 4560

ttccatgagg aaaatgactc caaattataa aatctgactt tggctttagt tttaattatg 4620

aaacagaagg gttttgttat agagacaaag tttttccatc cacttacttc ctgtgcttgg 4680

atatgcacac ggaatgtttc tgcaaggacg cacaggaaac agtttccaag gagcacaccc 4740

gggagaccag cagaaaagag cccgctggtc acctacacat cagcagggtg caaggacaga 4800

ggaacaggca tccgagtcgt cagaggccac aggacagacg tccccatcgg tgtgcagagc 4860

aagtgcagaa cctccttttc cctcagaccc tgctgaaggt ttttatttta aaccacgtat 4920

agattttact cttaacaaaa tccactaaac agcaacacct agcctcaaat gtaaagccag 4980

ctgcatccat aggggaccaa ctaagcaaac tgcaggcttc acacaatgaa accacattta 5040

tggaaagaat gaggtgagtt gacacaaaat gacagaaaaa gaggctccca atcgcacggg 5100

aagtggaagt gtgtggccac tgggaagcca gtggtgtgtg gatggcgggc tgttcctaag 5160

gacctgcagt aaacacacgt ttctgcatct gtgtttccac agaaacagga aagtgtgcaa 5220

aggatgcaca tttgacggtt cacatcggga aagtcgacgg ctctgcgttt cactccccgc 5280

tgtgtgcatc ctgatgttca gttttacagt taacatgttg ttagactgct tttgttctta 5340

accaaaacca gtgaagattt tttttaatgc atgttcaaat gcaattttac atagaaaccc 5400

aggtgcagcc tctggattag tcatcacctg tcacagagca ggcacccggt ggagagagcc 5460

agccaccccc caccccccac catggcagcc agccaggttc cagggccggg gcaactccca 5520

gcagggaccc aggctgcatt ctgactgtgc tgtcctgggg gtccttcctt cctgtgctgc 5580

agacagttta ctccgaggag gctcctgggt tgggccaccg cctctggcgt atcctcagcc 5640

acttcagaac tgatggctta aatgtggtga gcatttggag acgctaagca caaaggtctc 5700

tctctccagg ggtaacctta aggccggatg tttacgggga gaaaggcctg gaaattgtct 5760

acaacgtctc tgataacaga acctgggcag acctcacaca gactctccac gccttcctag 5820

caggtgaggt gtgaaacggc aggtgaggtg tgaagcggcg ggtgggtgag gtgtgaagcg 5880

gcgggtgggt gaggtgtgaa gcggcgggtg ggtgaggtgt gaagcagcag gtgaggtgtg 5940

aaacggctcc acagcttcgg ccttttctat ttcatgagaa actcgcactc agggcttgca 6000

aggccttccc ggggggcagc caggcgtcag ggccagggca ggacagggct ggcaggtgcg 6060

tccgtctgca ggctactctc cagcagccca ggaggacagc atcaactgca cctccgagca 6120

gtacttcttc caggagagtt tccgcgctcc caaccacacc aagttctcct gcaagttcac 6180

ggcagatatg ctgcagaact gctcaggcct ggcggatccc aacttcggct ttgaagaagg 6240

aaagccatgt tttattatta aaatgaacag ggtgagtact gagggtctcc ttcacacgcc 6300

actacaacag tgcagtcagg gcctctcacc cacacccacc acgaggagca caggtgtcct 6360

gtctggggct tgcccaagcg ggacagggac tccagcctca ccaccctgta ccttggtttg 6420

gcacgcacct gtcccgtgtg gttcttagat acaaatttga aaccactcgt cagacaccag 6480

cacatagccg gccctctaaa acatgtggaa acatttgaac aggggtctct gcaaggccag 6540

ggcccccttc agggcagcca gagatgccag ggccaggtaa aggggcctca agttctggag 6600

tcaggattgg gaggggttta gcaccttcta aagcagaggc ttccaacctg ggaccagggg 6660

ccccttaggg ggtgtgggga ggtgatccct gagccaggct cgagcagggc aggtcctggc 6720

caagcagagg gcttggggcc accactccat ggaccaatca gcagctctgt gctgggcctc 6780

cgggcagctg tgctgttcct tttccactta agaggctgca ggcttgtgcc ctctacacct 6840

cacgggtccc cgtcagccag ggtctcagca ctgccggcat ggaggggctg tgacgggggt 6900

cccagcaggg cgtggtggcc actgtgcccg tctcatggca gctgccaccc tcggagcaca 6960

gcaggggatg gctggggctg gagaagccca gggaagaggt gtggggaagg gggctgaagg 7020

cccgggtggg ccagagagag ttttctggaa gagctgtgca gagcaggagg caggccggcc 7080

cgtgctctgt ctcagtgctc caccggacct ggacatggtt cgagggctaa gaccaccccg 7140

ccccagctct gcctcctgcc agccgcctcc tgaagcctgg gccaagtggc ttgctgatgg 7200

gtgggtgggg ggagggctgt ggctctgaat gatgagttag tgacacctat ggggattcct 7260

ccaagggaag ccgcaaacca gaccaagggc ccttctcagt cctggtcaga aagcccaggc 7320

tggggccggc cagatctcag ctccatgggt gggtgccgtg cacctcacat ggcggtgggg 7380

gtggggagcg gccacgctca agcttttccc ttctagatcg tcaagttcct ccccagcaac 7440

ggctcggccc ccagagtgga ctgcgccttc ctggtgagta cggccgcgcg gcgggcaggg 7500

ctgccccagg aaaggagctt gtcagggtcg tgctggttca tgctgggcac ggcccacctg 7560

gttctctcca ggaatgtcag ccgtcggccc agtaaaccag acgtaaacac cgaaccatca 7620

ccacagcgag ctccaccatg gcgggtaaaa cccagcaagg gaaacaatgg ggctttttct 7680

tattgtttgg cttccagaag catctgagta gcgtgtcagc agcacgcttc aaaacgcctg 7740

gtggcgatgt ggaaagacca gtgcaccttc caccagttct gtccttttta tgtgcttctt 7800

tacaaaaagg ttccagcttg ccagcagcta cagttgttta actgtgttta gtatacagac 7860

tgctaagagt tggcatcgat ctcaggctaa ttccaggttg tttttcaaaa ctgcttttta 7920

agtcaacatt ttttaaaact gaatttttta aattaaatgt cttctaagat ttgcttccac 7980

catgacaccc aaaggcaaag 8000

<210> 2

<211> 2700

<212> DNA

<213> ATP4B基因体DNA片段

<400> 2

acaatatata ttcatacaat aaaatgtaag ctgaaaaatg cacggaacaa aatatgtgtg 60

ctgtgaccac agacgcgttc tgaaaaatac gtgcgctgtg attgcagacg cgttctgaaa 120

aatacgtgta ccataatcac agaccctcct gaaggagagg agggaagggg aagggcctgt 180

gagtgctgct caccccggaa cgtgccctca ccgcaatcag agcagacaaa gctgcagcca 240

agggcgtccc aagagcagca gggtgaggaa agcgggcctg gcccgcccca ggggcaacag 300

ccgggctgca cccagcccct ggtgtttggt gaggcgatgg ccggcgctga taaacggccc 360

tggcctctcc ctgggatcct tcgcctgcga tgcctttgac ctctggcaga ggaaactata 420

aagcccagag gtgggcatct ggcctcagtc tgggcgtaga gggtgcaggg agcagacggg 480

aggatctcag gccagggacg atggcggctc tgcaggagaa gaagacgtgt ggccagcgca 540

tggaggagtt ccagcgttac tgctggaacc cggacacggg gcagatgctg ggccgcaccc 600

tgtcccggtg gggtacgtgc ggggggcggg ccggctgggt gcatggaggg ggccgctctg 660

aggacgcagc ctccaggtga gctcaggagg aggggagcag agggcccctg acagtgagac 720

cccgatgctg cctggatggc gtggacgggc ttcggccagg gcctcacttg cctcccaggg 780

aaagcgaggg tccccagagc atcctgaagg ctgagttgac ctggagcccc agctgcagaa 840

cgccggtgga gggcgtccac agactggccc caaatgtcag ccgtatgtct gagaacagca 900

ttttaaaagt atgtttctaa agtgaatcat tttgaaaata acgtgaaagg tggcaacggt 960

gattccttgg tcacacagat tcacgcaatg acctgaataa ggggctctgc cgagacgcgg 1020

ctgccagccc ctttccggga cacccgctgg cgtccagatg cggaggtggg gagtaaacca 1080

ggcctgcctc agcctgcagc acctgcgcct tgtgcgaggt ctgccctgca gggtcctgtc 1140

cccgtggctg cacagaggcg cgggcagcct ggccctcctg ggaggaaagc agatgcctgg 1200

gcctccaagg ccacacaggt ggtggaagcg tctgcgtcta catcagggct gccacacccg 1260

ttccgggaaa cgccctcacc ccttatgaga gagtctggag gaagcacctg tgcgccccca 1320

cctccccctg cgacccctgg gcgtcgggat gcggctgaac tggctggcct ggtgccgtcc 1380

ccggctccca gggaaggtca ggccctcctc aattcccacg gtgcccggct ctgggggtcc 1440

cagagccgag gtgggaatgc aaagccccag gcccgcccca cctgtgtgtg tagctgagac 1500

gtgctgggaa tgcccgtgac acgctgccaa atcccccaca ctcaccacag tgctggtgaa 1560

ggctgcagcc cccgctggag gctccacggt ctcaaagggc accagagcca gctggagtca 1620

tgggcgcatt tgaagtagaa caaatacccc gttcctagag aggcagggac cgggggcaga 1680

agggcctcct gggccaggcg gggcggcaga gcgggaggcc aggatgggga aggagctgag 1740

ggcgggggct gggctggggg ctgccggcca ggtccttgga agccccatct tttgggccat 1800

tctagatgct gagactccca tgtgccgcct cctggctgca gggccacaga gaaccttctg 1860

gaatggtctc actgcctggc cggtagacat ggcctccgtt tgggataaga aagtcttagg 1920

gccccaggaa aacacaactc aagtgaaatg acaaaaacaa aaggaatagg acacgttatt 1980

cttactaatt gggggacggg tgcaggtgca ggagaggcag agtgagctgc acccggccgg 2040

ccccaggagc tggcgggaat gggactctca gtcacctccc aacccctccc ctgtgcactg 2100

cagcgtgccc tgaacaccgt ggtgcaagcg ggggcccagg aagtgcaggg agcatggccc 2160

tcccgagcct gggcccagcc tggccaacct cgggctccta cccgggaggc agggctgagc 2220

cgcctggtgg agctgagact cgccacagag tgggtcagca gccactgggg agacacgcac 2280

cgcccacatc tccactgtgc accacgggcc ccagagcaga cccacaggac ccacagcggg 2340

ggaacagaga cccctgccgt cacgagcgta ggtccccggg ggacaggcgg ccaagtcaaa 2400

tagaagccac atcaggagtg acctggggac actgaggcag gacctgcagg gccagcacca 2460

gggaggcacc aggcgtgatc cagtgacagg acagaaaccc tccaccactg cgggccccac 2520

actgctgaag ctggaaactc aaaaccggag gctgaagcca agctgctgtg gccacacaag 2580

aacgccgtca ccagggacgc ccggcgggga aaggagggac tcaaagtgga tgccaggtga 2640

gcaagaccca gccctgagcc cagctggtgc tgaagggacc tggctcagag atctgtgctg 2700

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成甲基化引物的上游引物

<400> 3

gagttttagc gttattgttg gaattcggat ac 32

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成甲基化引物的下游引物

<400> 4

gtaccccacc gaaacaaaat acg 23

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成非甲基化引物的上游引物

<400> 5

ggagttttag tgttattgtt ggaatttgga tatg 34

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成非甲基化引物的下游引物

<400> 6

cacacatacc ccaccaaaac aaaataca 28

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成BSP的引物的上游引物

<400> 7

ggaggatttt aggttaggga 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成BSP的引物的下游引物

<400> 8

cactatcaaa aaccctctac tc 22