引起白化的巴马香猪MC1R突变基因及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及引起白化的巴马香猪MC1R突变基因，还涉及该基因的应用。
背景技术：
：影响猪毛色性状的色素主要是黑色素，黑色素可分为真黑色素和褐黑色素两种。真/褐黑色素在不同品种猪被毛中的含量和分布造就了不同的毛色类型。黑素皮质素受体1(Melanocortin1Receptor,MC1R)基因在控制动物黑色素合成的过程中发挥着重要作用，并被证实为控制动物毛色的主效基因。KijasJM等(KijasJM,MollerM,PlastowG,etal.AframeshiftmutationinMC1Randahighfrequencyofsomaticreversionscauseblackspottinginpigs.[J].Genetics,2001,158(2):779-85.)发现在塔姆沃思和赫里福德(TamworthandHereford)猪种的MC1R编码区第67-68位点处有CC插入的突变，这种移码突变可能引起的隐性红毛色。顿桂玲等(顿桂玲,李祥龙,曹洪战,等.3个猪品种黑素皮质素受体1(MC1R)基因变异研究[J].JournalofGeneticsandGenomics,2007,34(9):777-782.)研究发现所有长白、大白猪个体在894位点均存在CC插入，并推测该突变可能与长白、大白猪白毛色存在相关性，但未经过群体验证。而师科荣等(师科荣,王爱国,李宁,等.中国地方猪种黑素皮质激素受体1基因(MC1R)的单核苷酸多态性[J].中国科学,2004,34(2):144-149.)对中国地方猪种MC1R基因单核苷酸多态性检测发现，民猪、金华猪、荣昌猪、五指山猪、梅山猪等11个中国地方猪种的MC1R基因存在3个突变G284A，T309C和T364C，未检测出编码区67-68bp处有CC插入的突变，且认为MC1R基因对于中国地方猪种之间毛色的差异没有起到关键的影响作用。印崇等(印崇,高峰,李傲楠,等.猪毛色基因黑色素受体1的基因型分析[J].中国畜牧兽医,2014,41(11):44-49.)通过对猪MC1R基因型分析发现，西藏小型猪在nt894insCC位点表现出其他基因型，而非CC插入突变基因型。迄今为止，猪MC1R基因突变的研究中，尚未发现能引起巴马香猪白化的相关报道。而白化巴马香猪具有如下多种用途：一、在医学研究中的应用：广西巴马小型猪作为国内小型猪主要品种之一，具有遗传性稳定、多产、体重较小等特征，组织器官及生化指标与人类相似，已越来越广泛地应用于医学研究领域。医用疾病动物模型中常用白毛色动物为理想模型，普通巴马香猪毛色中间部分为白色，两头为黑色，对于实验观察存在不利之处。因此，体表全覆盖白毛的白化巴马香猪与普通巴马香猪相比更具有作为医用实验动物模型的价值。二、作为宠物用猪:目前市面上国内的宠物猪品种以香猪为主，其中主要为巴马香猪。由于巴马香猪是一个具有稳定的遗传基因、品质优良、珍贵稀有的地方小型猪种，且其体型矮小短圆，外形俊秀，聪明温顺，很受一些宠物爱好者的欢迎。目前，市面上的宠物用巴马香猪毛色品系主要为两头乌，全白毛色的巴马香猪宠物尚未出现，因此白化隐性巴马香猪品系开发成宠物猪具有一定的市场。三、巴马香猪毛色对遗传育种中的作用：毛色可以作为一种遗传标记，应用于评判品种的纯度、遗传稳定性、亲缘关系及在配套系培育中确定亲本的杂交组合类型。技术实现要素：本发明目的在于提供引起白化的巴马香猪MC1R突变基因及其应用，可引起巴马香猪白化并呈隐性遗传，能够用于制备白化医用动物模型、制备白化宠物用猪和遗传育种用途的遗传标记。为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：一种引起白化的巴马香猪MC1R突变基因，MC1R基因的第894位之后新插入CC两个碱基，该突变可引起巴马香猪白化并呈现隐性遗传。一种利用所述的引起白化的巴马香猪MC1R突变基因在制备医用动物模型中的应用。一种利用所述的引起白化的巴马香猪MC1R突变基因在制备白化宠物用猪的应用。一种利用所述的引起白化的巴马香猪MC1R突变基因在制备一种遗传标记，作为评判品种的纯度、遗传稳定性、亲缘关系及在遗传育种配套系培育中确定亲本的杂交组合类型中的应用。一种检测巴马香猪隐性白化位点的基因型的方法，是以检测巴马香猪MC1R基因第894位脱氧核糖核酸是否有CC插入，即第889位脱氧核糖核酸为起始的六个连续C是否突变为八个连续C，确定待测巴马香猪的基因型是--/--、CC/--或者CC/CC，其中CC/CC基因型的巴马香猪的毛色呈现全白，而--/--和CC/--基因型的巴马香猪的毛色呈现两头乌黑中间白；所述--/--基因型的个体为巴马香猪MC1R基因的自5’末端第894位脱氧核糖核酸无CC插入的纯合体；所述CC/CC基因型的个体为巴马香猪MC1R基因的自5’末端第894位脱氧核糖核酸有CC插入的纯合体；所述CC/--基因型的个体则为两个等位基因中仅有一个基因有CC插入的杂合体。确定待测巴马香猪MC1R基因第894位脱氧核糖核苷酸后是否插入CC的方法可采用测序分析方法。测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序；所述PCR扩增用的引物对设计：以巴马香猪基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有巴马香猪MC1R基因的第889位至第896位脱氧核糖核苷酸；PCR扩增得到的DNA片段为序列1所示的核苷酸序列或序列2所示的核苷酸序列。测序方法中，设计引物如下：正向引物F：5’-GGAGAGGAGGCTGCTGG-3’反向引物R：5’-TGGACACCTCCAGGCACT-3’用上述引物对在巴马香猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×TaqUnicornPremix12.5μl，DNA(1/100)1.0μl，PrimerF2(10μM)0.5μl，PrimerR2(10μM)0.5μl，AddH2OTo25.0μl；PCR反应程序：94℃4min；94℃20sec，57℃20sec，72℃20sec，20cycles；72℃3min；10℃。本发明的有益技术效果有：本发明的突变基因可引起巴马香猪白化并呈现隐性遗传，可用于选育白化巴马香猪品系，与普通巴马香猪品系两头黑、中间白相比，体表全覆盖纯白毛发的白化巴马香猪品系更适宜作为医用实验动物模型。同时，巴马香猪作为主要的宠物用猪，白化品系的培育可满足部分宠物猪爱好者对全白毛色的偏爱。此外，全白毛色还可以作为一种遗传标记，应用于评判品种的纯度、遗传稳定性、亲缘关系及在配套系培育中确定亲本的杂交组合类型。附图说明图1为正常巴马香猪外观；图2为白化突变巴马香猪外观；图3为基因型检测测序峰图；具体实施方式实施例1：白化巴马香猪遗传家系的建立以我国巴马香猪为模式动物，在进行近交建系的过程中意外获得了呈高度稳定隐性遗传的、白化巴马香猪遗传家系。具体过程如下：第一阶段：以1头F1建系公猪与野生型巴马香猪进行交配获得F2群体，选留F2母猪和F1公猪回交产生F3代；在F3代意外发现白化个体，为检测其遗传性，增加F2母猪和F1公猪回交以出生足够数量的F3代，结果共出生F3代125头，其中白化个体29头，正常个体96头；第二阶段(进展中)：利用F3代白化巴马香猪公猪与F3代白化巴马香猪母猪交配产生F4代白化巴马香猪，扩大白化巴马香猪遗传家系猪只数量。该家系目前共包括148头个体，包括携带隐性遗传基因的F1公猪1头，携带隐性遗传基因的F2母猪3头，F3代猪125头，及参与家系配种的野生型猪19头。将所有的白化家系产生的F3代进行隐性遗传卡方合适度检验，如表1所示。表1白化家系F3代产仔记录正常白化总数观察次数O9629125理论次数T93.7531.25125|O-T|-0.51.751.75(|O-T|-0.5)23.06253.0625(|O-T|-0.5)2/T0.03270.0981、假设H0：正常和白化的分离比符合理论比3：1，H1：不符合。2、显著水平：α＝0.053、计算χ2值：由于自由度df＝k-1＝1，所以χ2需要连续矫正。χ2＝0.0327+0.098＝0.13074、推断：从卡方分布表中查得χ20.05(1)＝3.841，实得χ2<χ20.05(1)，结论是接受H0，即正常与白化的分离比符合理论比3：1。同时，该性状在不同性别间无差异分布。表明该家系白化性状遗传模式符合常染色体单基因隐性遗传的孟德尔遗传定律，故可确定该巴马香猪家系是一个呈单基因隐性遗传的遗传性白化家系。目前，已经建立了遗传关系清楚、连续传代2代共148头个体，白化表型符合孟德尔隐性遗传模式的遗传大家系。实施例2：家系特征分析正常巴马香猪外貌颜色特征主要表现为两头黑、中间白(如图1所示)，部分个体背腰部稍带黑斑，额头有白线或倒三角型白斑，俗称“两头乌”、“芭蕉猪”。突变巴马香猪外貌颜色特征表现为全身覆盖白毛色(如图2所示)。实施例3：家系基因定位众多文献表明，黑素皮质素受体1(Melanocortin1Receptor,MC1R)基因在控制动物黑色素合成的过程中发挥着重要作用，并被证实为控制动物毛色的主效基因。因此，本研究对此白化巴马香猪遗传家系的MC1R候选基因外显子测序，共检测家系内58个体头，其中29头白化个体、25头正常个体、4头表型正常的携带隐性遗传基因个体，测序发现：29头白化个体MC1R基因第894碱基处插入了两个CC，且为纯合突变，命名为--/--基因型；4头表型正常的携带隐性遗传基因个体也发现MC1R基因第894碱基处插入两个CC，但为杂合突变，命名为--/CC基因型；25头正常个体MC1R基因未发现突变，命名为CC/CC基因型。具体的检测巴马香猪隐性白化位点基因型测序方法如下：设计引物如下：正向引物F：5’-GGAGAGGAGGCTGCTGG-3’反向引物R：5’-TGGACACCTCCAGGCACT-3’用上述引物对在巴马香猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×TaqUnicornPremix12.5μl，DNA(1/100)1.0μl，PrimerF2(10μM)0.5μl，PrimerR2(10μM)0.5μl，AddH2OTo25.0μl。PCR反应程序：94℃4min；94℃20sec，57℃20sec，72℃20sec，20cycles；72℃3min；10℃。PCR产物纯化、测序所得--/--基因型序列和CC/CC基因型序列分别如序列表中序列1和序列2所示；--/--基因型序列、--/CC和CC/CC基因型突变位点的测序峰图如图3所示(图中由上至下分别对应突变体纯合、突变体杂合、以及野生型纯合)。以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。序列表<110>深圳市金成实验动物科技有限公司<120>引起白化的巴马香猪MC1R突变基因及其应用<130>16A100348JYC<160>2<210>1<211>110<212>DNA<213>人工序列<400>1ggagaggaggctgctggcttccctcagctccgcgcccccagccgccccccgcctcgggct60ggccgccaaccagaccaaccagacgggcccccagtgcctggaggtgtcca110<210>2<211>112<212>DNA<213>人工序列<400>2ggagaggaggctgctggcttccctcagctccgcgcccccagccgccccccccgcctcggg60ctggccgccaaccagaccaaccagacgggcccccagtgcctggaggtgtcca112当前第1页1 2 3