一种用于大肠杆菌‑鸭疫里默氏杆菌的高效穿梭质粒的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种穿梭质粒，具体涉及一种用于大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌的高效穿梭质粒。

背景技术：

基因敲除技术是研究基因功能的常用手段，细菌缺失某个基因后往往会引起它的表型发生变化，但是表型的改变可能是由于这个基因被敲除后影响下游基因的表达造成的。所以，将被缺基因克隆到穿梭质粒并进行功能回补研究非常必要。

目前，能用于鸭疫里默氏杆菌基因回补的穿梭质粒数量有限，且酶切位点较少，接合转移效率低下，十分不利于基因回补实验的进行。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌的高效穿梭质粒。

本发明还提供了该穿梭质粒的制备方法及其应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌的高效穿梭质粒，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述穿梭质粒的制备方法，包括步骤：

(1)将转移位点oriT序列克隆至质粒pPM5中，得质粒pPM5+oriT；

(2)将鸭疫里默氏杆菌复制起始基因pRA0726 ori克隆至质粒pPM5+oriT中，所得质粒命名为pFY01；

(3)在pFY01上克隆一段带有多个内切酶位点的高表达启动子序列High EXP，所得质粒命名为pFY02。

优选的，oriT序列、pRA0726 ori和High EXP在NCBI中的序列号分别为AF047518.1、JF268689.1和CP003787.1。

优选的，步骤(1)的具体方法是：以质粒pEX18GM(Gene.1998；212(1):77–86)为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列为引物进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶SphI和HindIII酶切质粒pPM5(Infect Immun.2015,83(1):300-310)和oriT片段，用DNA连接试剂盒连接载体片段pPM5与基因片段oriT序列，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆，扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取得到质粒pPM5+oriT。

进一步优选的，采用HindIII酶单酶切进行质粒pPM5+oriT的鉴定。

进一步优选的，细菌的培养方法是：用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌。

进一步优选的，所述PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，30个循环，72℃延伸7min，22℃，∞。

进一步优选的，PCR扩增结束后和酶切结束后，分别用DNA纯化试剂盒回收PCR产物oriT序列和长片段酶切产物。

优选的，步骤(2)的具体方法是：以质粒pLMF01(Genbank:KU963002)为模板，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶SphI和PstI酶切pPM5+oriT和pRA0726 ori片段，用DNA连接试剂盒连接载体片段pPM5+oriT与基因片段pRA0726 ori，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，用含100μg/ml氨苄抗性的培养板培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆，扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取得到质粒pFY01。

进一步优选的，采用SphI酶单酶切进行质粒pFY01的鉴定。

进一步优选的，细菌的培养方法是：用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌。

进一步优选的，所述PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min，22℃，∞。

进一步优选的，PCR扩增结束后和酶切结束后，分别用DNA纯化试剂盒回收PCR产物pRA0726 ori和长片段酶切产物。

优选的，步骤(3)的具体方法是：以RA CH-1菌株基因组(BMC genomics.2014；15:479)为模板，以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物进行PCR扩增，PCR产物经限制性内切酶SalI和XbaI酶切质粒pFY01和High EXP片段，用DNA连接试剂盒连接载体片段pFY01与基因片段High EXP，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆，扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取得到质粒pFY02。

进一步优选的，采用XbaI酶单酶切进行质粒pFY02的鉴定。

进一步优选的，细菌的培养方法是：用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌。

进一步优选的，所述PCR扩增条件为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环，72℃延伸7min，22℃，∞。

进一步优选的，PCR扩增结束后和酶切结束后，分别用DNA纯化试剂盒回收PCR产物High EXP和长片段酶切产物。

上述穿梭质粒在鸭疫里默氏杆菌缺失株的基因回补中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明的穿梭质粒是在质粒pPM5的基础上进行改造的，由于此质粒中的复制起始位点与鸭疫里默氏杆菌的复制起始位点不同，为了使其能够在鸭疫里默氏杆菌中稳定的存在，将鸭疫里默氏杆菌复制起始基因(pRA0726 ori)克隆到此质粒中；为了提高其结合转移效率，将转移位点(oriT)克隆到此质粒中，使此穿梭质粒能够通过高效的结合转移导入鸭疫里默氏杆菌中，且能稳定的复制。为了方便基因片段插入穿梭质粒上且提高基因的表达量，将在穿梭质粒上克隆一段带有多个内切酶位点的高表达启动子序列(High EXP)。

本发明所得穿梭质粒可以在鸭疫里默氏杆菌中稳定存在，用于基因敲除株的回补。质粒较小且具有多个多克隆位点，易于操作。结合转移效率非常高。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为E.coli DH5α+pPM5+oriT菌落PCR鉴定图，即扩增的oriT片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以质粒pEX18GM为模板的阳性对照，2～4泳道是以E.coli DH5α+pPM5+oriT单克隆菌为模板；

图2为质粒pPM5+oriT酶切(HindⅢ)鉴定图，是用限制性内切酶(HindⅢ)酶切鉴定质粒的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是质粒pPM5+oriT，2泳道是pPM5；

图3为E.coli DH5α+pFY01菌落PCR鉴定图，是扩增的pRA0726 ori片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以质粒pLMF01为模板的阳性对照，2-3泳道是以E.coli DH5α+pFY01单克隆菌为模板；

图4为质粒pFY01酶切(SphI)鉴定图，是用限制性内切酶(SphI)酶切鉴定质粒的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是质粒pPM5+oriT，2泳道是pFY01；

图5为E.coli DH5α+pFY02菌落PCR鉴定图，是扩增的High EXP片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以RA CH-1菌株为模板的阳性对照，2-6泳道是以E.coli DH5α+pFY02单克隆菌为模板；

图6为质粒pFY02酶切(XbaI)鉴定图，是用限制性内切酶(XbaI)酶切鉴定质粒的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是质粒pFY01，2泳道是pFY02；

图7为E.coli S17.1+pFY02菌落PCR鉴定图，是扩增的oriT+pRA0726 ori片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以质粒pFY02为模板的阳性对照，2～4泳道是以E.coli S17.1+pFY02单克隆菌为模板；

图8为RA ATCC+pFY02菌落PCR鉴定图，是扩增的oriT+pRA0726 ori片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以质粒pFY02为模板的阳性对照，2～4泳道是以RA ATCC+pFY02单克隆菌为模板；

图9为阳性克隆RA ATCC+pFY02传10代菌落PCR鉴定图，是扩增的oriT+pRA0726 ori片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以质粒pFY02为模板的阳性对照，2～3泳道是以RA ATCC+pFY02单克隆菌传十代后的菌落为模板；

图10为结合转移后长出的菌落，是结合转移后长出的菌落图，1是使用普通穿梭质粒pLMF01长出的菌落，2是使用穿梭质粒pFY02长出的菌；

图11为pFY02的质粒图谱；

图12为pPM5+oriT+pRA0726 ori构建得到pFY01的质粒图谱；

图13为pFY01构建得到pFY02的质粒图谱；

图14为E.coli DH5α+pFY02::tonB2菌落PCR鉴定图，是扩增的tonB2片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以RA ATCC11845(BMC genomics.2014；15:479)为模板的阳性对照，2-4泳道是以E.coli DH5α+pFY02::tonB2单克隆菌为模板；

图15为RA ATCCΔtonB2+pFY02::tonB2菌落PCR鉴定图，是扩增的tonB2片段后的电泳图，其中M是DNA marker，1泳道是以RA ATCC11845为模板的阳性对照，2泳道是以RA ATCCΔtonB2+pFY02::tonB2单克隆菌为模板；

图16为RA ATCC野生株、RA ATCC tonB2敲除株，RA ATCC tonB2回补株生长曲线。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1：

重组质粒pPM5+oriT的构建

本发明的穿梭质粒是在质粒pPM5的基础上进行改造的，为了提高其结合转移效率，申请人将转移位点oriT序列(NCBI中序列号为AF047518.1)克隆到此质粒中。

根据oriT序列设计两条PCR引物：

上游引物：5'-CCCAAGCTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCC-3'，如SEQ ID NO.2所示；

下游引物：5'-ACATGCATGCCTAGAGTCGATCTTCGCCAGC-3'，如SEQ ID NO.3所示。

以质粒pEX18GM为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物用PCR扩增oriT序列，扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸7min，22℃，∞。用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物oriT序列，用限制性内切酶SphI和HindIII酶切质粒pPM5和oriT片段，用DNA纯化回收试剂盒回收长片段酶切产物。用DNA连接试剂盒连接载体片段pPM5与基因片段oriT，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆(鉴定oriT片段，约800bp)，结果如图1。用LB液体培养基扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取质粒，用酶(HindⅢ)单酶切的方法鉴定，将新构建质粒命名为pPM5+oriT，酶切结果如图2。即质粒pPM5+oriT构建成功。

实施例2：

重组质粒pFY01的构建

由于此质粒中的复制起始位点与鸭疫里默氏杆菌的复制起始位点不同，为了使其能够在鸭疫里默氏杆菌中稳定的存在，申请人将鸭疫里默氏杆菌复制起始基因pRA0726 ori(NCBI中序列号为JF268689.1)克隆到此质粒中。

根据复制起始基因pRA0726 ori设计两条PCR引物：

上游引物：5'-ACATGCATGCCTATTTAGGCATTAGCCCTC-3'，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物：5'-AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACAGATCTCGTATAGAGCTCG-3'，如SEQ ID NO.5所示。

以pLMF01(Genbank:KU963002)为模板，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物用PCR扩增pRA0726 ori基因序列，扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸7min，22℃，∞。用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物pRA0726 ori，用限制性内切酶SphI和PstI酶切质粒pPM5+oriT和pRA0726 ori片段，用DNA纯化回收试剂盒回收长片段酶切产物。用DNA连接试剂盒连接载体片段pPM5+oriT与基因片段pRA0726 ori，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆(鉴定pRA0726 ori片段，约2000bp)，结果如图3。用LB液体培养基扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取质粒，用酶(SphI)单酶切的方法鉴定，将新构建质粒命名为pFY01，酶切结果如图4。即pFY01构建成功(图12)。

实施例3：

重组质粒pFY02的构建

为了方便基因片段插入穿梭质粒上且提高基因的表达量，申请人在穿梭质粒上克隆一段带有多个内切酶位点的高表达启动子序列High EXP(NCBI中序列号为CP003787.1)。

根据高表达启动子High EXP序列设计两条PCR引物：

上游引物：5'-ACGCGTCGACGTCGGCCATATTTCAAAAATTTAACTTAAACC-3'，如SEQ ID NO.6所示；

下游引物：

5'-TGCTCTAGAGCAGCGCGCAGGCCTGCTAGCCCGCGGAATTTTAAATAATTTTTTTAAATTTG-3'，如SEQ ID NO.7所示。

其中如SEQ ID NO.7所示的下游引物中添加了酶切位点SacII，NheI，StuI，BsshII。

以RA CH-1菌株为模板，如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的为引物用PCR扩增High EXP基因序列，扩增程序为：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环，72℃延伸7min，22℃，∞。用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物High EXP，用限制性内切酶SalI和XbaI酶切质粒pFY01和High EXP片段，用DNA纯化回收试剂盒回收长片段酶切产物。用DNA连接试剂盒连接载体片段pFY01与基因片段High EXP，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆(鉴定High EXP片段，约250bp)，结果如图5。用LB液体培养基扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取质粒，用酶(XbaI)单酶切的方法鉴定，将新构建质粒命名为pFY02，酶切结果如图6。即pFY02(图11和图13)构建成功，其基因序列如SEQ ID NO.1所示：

AAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATATCGACATCCGCCCTCACCGCCAGGAACGCAACCGCAGCCTCATCACGCCGGCGCTTCTTGGCCGCGCGGGATTCAACCCACTCGGCCAGCTCGTCGGTGTAGCTCTTTGGCATCGTCTCTCGCCTGTCCCCTCAGTTCAGTAATTTCCTGCATTTGCCTGTTTCCAGTCGGTAGATATTCCACAAAACAGCAGGGAAGCAGCGCTTTTCCGCTGCATAACCCTGCTTCGGGGTCATTATAGCGATTTTTTCGGTATATCCATCCTTTTTCGCACGATATACAGGATTTTGCCAAAGGGTTCGTGTAGACTTTCCTTGGTGTATCCAACGGCGTCAGCCGGGCAGGATAGGTGAAGTAGGCCCACCCGCGAGCGGGTGTTCCTTCTTCACTGTCCCTTATTCGCACCTGGCGGTGCTCAACGGGAATCCTGCTCTGCGAGGCTGGCCGGCTACCGCCGGCGTAACAGATGAGGGCAAGCGGATGGCTGATGAAACCAAGCCAACCAGGAAGGGCAGCCCACCTATCAAGGTGTACTGCCTTCCAGACGAACGAAGAGCGATTGAGGAAAAGGCGGCGGCGGCCGGCATGAGCCTGTCGGCCTACCTGCTGGCCGTCGGCCAGGGCTACAAAATCACGGGCGTCGTGGACTATGAGCACGTCCGCGAGCTGGCCCGCATCAATGGCGACCTGGGCCGCCTGGGCGGCCTGCTGAAACTCTGGCTCACCGACGACCCGCGCACGGCGCGGTTCGGTGATGCCACGATCCTCGCCCTGCTGGCGAAGATCGACTCTAGGCATGCCTATTTAGGCATTAGCCCTCTTTTTAACCTGACTTAAAAAATAATTAAATCATAAGATATTAAATATCAAGTGATTATGATTTACTATGCTATACATAATATCACCCAGTGTTAGAAAATTCTTGCTATGCTTTTTGTTTGTTTTTTTTCATTCGTGAACTTTTAGAATACTTTTAAAATAAACTCAAATTTATAAACTATTGATTTTCAATATTATACAAAACCAAACTTATTAACATTAAACTTATTTCTATTACCTTTAAAATAAACTACTAAAAGACAAATCTACCAATCCTCGGAACTATTTAATAAATAGGAAGTTATATAAAAATAATGAACTTTTAGAATACTTTATTAGTCTTTTTAGCTCCAAAAATGAACTTTTAGAATACTTTTTTTGAACTTTTAGAATACTTTTTTAAACTTGCTTTTTAGTAAGTTCATTTTTTATATATTTGTATTCTAAAAGTGCATTTTATATTCATAACTCTCTATATATGGCAAAAGTAGATAATAAACTAATGTTTCAGTCCTATATTTTTACTACGGCTAAATATGATTTTTCAGTCTATGAAAAGCGTATACTATATAGGCAAATAGAAATAGAACAGGCATTGCTAAATAATGAGGCGTTGAAAGATTGTATCAAAATAGATACTAACCTATGGGGGGATAAAAAATATACAATTCCAATTTCTATGCTGTTAGCTAATGATGAAGATAAAAATTATTATAAAATTAAAAAAGCATTCAAAGACCTAAAATCAAAGAACATTGAGTACGAAGATGAAAAAGAATACGCTTGCTTTGGTGTTATTGATAAGTTTTGGATTGATAAATATGGAAGAAATGTTACTTGGCAATCTGACAAAAGAATTGTTGAAGCGGTAATGGATTTTACAAGAGGATGGAGAAAATATGAATTGAAGATTGCTATGCAGTTTGAGACTATTTATGCAATGCGTTTTTACGAACTGATAGCTAATAAAACCAAACCAATAACATATGAAGTGTCATTTCTTGAAAAAATGTTTCAATTGGAAAATAAGTACAGGAACCCTCAGGGTAATCTTAATATCAGTATGTTTAAACGCCGTGTATTAGACCCCGCTAAAAACGAGTTAGATAAATGTTCTCCATACACTTTTGATTATACTCTTTCAAAGGATAAAAAAATTATTTCTCTAATTCCTATTTTCCAAGAACAATTTGCAGATGAAAGTATGAAGATGATCAAAATAGAAGAGGAAAAAGATATACACTCTGTATTAACTCAAAGAGAAATTGATGTTTTtACAAACGAATTTGGTTTTACACAACAAGGTTTATTAAACAACTATGCCCTATTCAAAGATTGTAAGGCTACACTTCCATCAAACTATTCTTTCTTCCTTTTTCAAGAGATAAGAAAAAGTCGGACTAAGAAAGGAAAAATATCTCCTGCTTATGTGATTGGGATTATAAGAAATATGCTTAAAGATTTCAAAAAAGAACAACAATAGGCTTATGAAAAAATATACAACAAAAGAAATCGCAGAGCTTTTTGGCGTCAGCGAACGGACAATCCAGCGACACATAACGACACTAAGCGACAACATATCAAATACCGACAGAAAGGGCTTTTCAATACCAGAAGACATTGTTTTCTTTCTTGCCGAGCGACACCATTACGACATTTTAGCGACAACGAACGACAACGAACGACAGGATAAAAATGAAGAATTTCCTCATATTGAATACTTCACAGAAGAGGAATACCAAGAGTTTAAAAAAAGGATCACAGAGTACCCTTTTTTGAAAGAGCAAATTAAACTGTCTAATGAACATTTGGATACTCTAAAAACACAAATAGAATATTTCAGACTATCTTACAATAAGCAATTGGATATTCACGAAAAATTAATCGGAGCGTTCCGAGAAAGAAACTTTATTGAAGCTAAAGAAAAGGGGATGGATAAATAGCTCCTAATAATTAAAGAAGTATTAGAAAAAAAATGCTATATAAAAACTTAATCGAGCTCTATACGAGATCTGTTCCAATGCATTGGCTGCAGGTCGACGTCGGCCATATTTCAAAAATTTAACTTAAACCACTGATTTACAAAAATGTTTATTTGCAAAACTATTTTACAAAGATATTACAATAATTTTTCTAGCACAAATTTATTTCTCACCATATCTTTGCCTTGTTCAAGTGAGTGAACAGAGTAACAAACAAAAAAAGAAACAAATTTAAAAAAATTATTTAAAATTCCGCGGGCTAGCAGGCCTGCGCGCTGCTCTAGAACTCGAGCATCATCATCATCATCATTGAACTAGTGGAGTTGCTTCTCTTTTCGGGAGTGGAAAACTGAAAGAACTGGAACGTGCCAACGAAAAACTGCAAGACGAGGTTTCAAAACGGAACACCAATATTGAAAAATTGCAGAGCCAAGTACAGCAGATGCAGAAACAGCATGATACGCAAATCCACAATCTCAGAGAAATGCACAGGCAGGAACTTGACATGAAAGAAAAAGAACTGTCACGGCTCGCCAGAATCATAGACAAGGCTTTCAGGTGGTTTCCGATGTTCAGGGAAATGCTGCGCATGGAAAAGTTTTGTGCCATGCTGGGATTCTCTAAAGAAATGACTGAAAGTCTTATAGTCAAAAAAGAAGCCCTGAAATGTAGCGGTAAAATCTATTCCGAGCAACACAGGCGGAACTTTGATATAAAGGATGATATTTTAAGGGTGGAAAATGACCCTGACGATGAAAGCAGGCTGAACCTGACAATAAACAGGAAGCCGATTGCCGACTGGTTCAGGGAGCAATGGCACAGGCTTAGATATGGAGCAAGAGTGCCGCAACAGGAAGAAAGAAAAAGTAGAGGATTCAAATTATAATAGAAGCAATTTGATTAGTAATCTAAAAGCACTCCGATAACGATTAGAGTGCTTTTAGATTGTTTATCATTAATTATCAAAGCAAGTGCAGTTTAAGATTTTACTGAAGTTTGCATTAATAAAGAATATACTACAGCTGATATATGCGCAACATATTGTGACGCTTGTGATTTATTTCCCTTGAAATCCTTAACAAATACCGCTAAGGTATAACTGATATTATTAGGCAGACATATATAGGCAACATCATTGTGAGCTGCAAGAACACCATTTTCATTAACATAACCTGAACCTGTCTTATGCGCTATAACAACCCCTTCTTTATCAAGAAGTGGAGCTGCTATCCTATCTACACCTGTTTTGCATTCTTTTAACGTATTCTTAATGAAACTTTGTTTCTCATCATCGATAAGACCTTCAGTAAACAAACGATTCATCAACATTGCAGCACCAAGAGGAGATGTATAGTTAGAGTAAGCCTTGTTATGGTCAGCCGACATTTCCTCTTCCGTATAAGCTATCTGAAAACTTGAACGAGGAATGAGTGTGGCTATAAAACTATCTGTTTGAGCGACATTAACCATATCCTTAAACATAAGGTTGCTTGCATTGTTGTCACTCTGAGTAAGAGTATAACGCAGCAAATCTCTCACTGTCAATGATATGACTGGCCCTGAATAATCTTTCAGCATAGGACTCCAAGTCTTTGGGTCAAGTTTATCCCTATTTATATTTACTAAGGTATCAAGTGAAATTCCTTTATTGTCAAAGTCATTACAAAGAGCTAATGCCTGATGAACCTTAAACACACTCATCATAGGATAAACACTCTTATTATTGACCTTAACCGTATCTCTGTT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实施例4：

验证pFY02的稳定性和高效性

首先制备E.coli S17.1感受态细胞，将质粒pFY02转化至E.coli S17.1中，用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆(鉴定oriT+pRA0726 ori片段，约2800bp)，结果如图7。

申请人使用大肠杆菌(供体菌)—鸭疫里默氏杆菌(受体菌)结合转移的方法，将质粒pFY02导入鸭疫里默氏杆菌中，即将E.coli S17.1+pFY02和鸭疫里默氏杆菌RA ATCC11845(BMC genomics.2014；15:479)分别用LB和TSB摇菌至对数生长期，用7000rmp离心10min，去掉上清，用10mM的MgSO₄分别将菌重悬，再次用7000rmp离心10min，去掉上清，用10mM的MgSO₄分别将菌重悬，然后按1OD鸭疫里默氏杆菌和5OD大肠杆菌的比例混合两种菌，用孔径为0.22μm的滤膜过滤细菌，将滤膜贴于血平板(加有脱纤维羊血的LB固体培养基)上，30℃培养10～12h，取出滤膜，用10ml的10mM的MgSO₄洗下滤膜上的菌，取100μl菌液涂于加有50μg/ml卡那霉素和1μg/ml头孢西丁的血平板上，37℃培养过夜，第二天即可看到长出的单菌落。分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定(鉴定oriT+pRA0726 ori片段，约2800bp)，结果如图8。将鉴定为阳性的菌传十代，用PCR的方法鉴定质粒的稳定性，结果如图9。可以看出质粒能稳定的存在于鸭疫里默氏杆菌中。与普通的穿梭质粒pLMF01(Genbank:KU963002)相比，进行结合转移效率提高了很多(图10)。

质粒pFY02可以用于缺失基因的功能回补验证

我们选择鸭疫里默氏杆菌tonB2缺失株(PloS one 10,e0127506,(2015)来验证穿梭质粒pFY02的基因回补能力。根据鸭疫里默氏杆菌tonB2基因序列(NCBI中的序号为RA0C_1209)设计两条PCR引物P1和P2，上游引物P1：AAGGCCTTATGTCAGATGAAAATTTAGG，如SEQ ID NO.8所示；下游引物P2：GCTCTAGAGCTTAATACTCAAAATTCATTGCCAC，如SEQ ID NO.9所示。以RA ATCC11845(BMC genomics.2014；15:479)菌株为模板，P1和P2为引物用PCR扩增tonB2基因序列，扩增程序为：98℃30S，(98℃10S，55℃30S，72℃50S)×30个循环，72℃7min，22℃∞。用DNA纯化回收试剂盒回收PCR产物tonB2，用限制性内切酶StuI和XbaI酶切质粒pFY02和tonB2片段，用DNA纯化回收试剂盒回收长片段酶切产物。用DNA连接试剂盒连接载体片段pFY02与基因片段tonB2，并制备E.coli DH5α感受态细胞，将连接产物转化至E.coli DH5α，用加有100μg/ml氨苄西林的LB固体培养基培养细菌，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定出阳性克隆(鉴定tonB2片段，约850bp)，结果如图14。用LB液体培养基扩大培养阳性克隆菌株，用质粒小提试剂盒提取质粒，即pFY02::tonB2构建成功。

将构建好的质粒pFY02::tonB2用结合转移的方法(如上所述)导入RA ATCC tonB2缺失株中，分离长出的单菌落，用PCR的方法鉴定(鉴定tonB2片段，约850bp)，结果如图15。即重组质粒pFY02::tonB2成功转移至RA ATCC tonB2缺失株中。

在3个均加有20mLTSB的离心管中分别加入过夜培养的RA ATCC野生株、tonB2缺失株及tonB2回补株，并控制初始OD为0.1，放入37℃摇床培养，每隔2个小时测一次OD，结果如图16所示。结果显示，与野生株相比，缺失株生长明显受损，然而回补株可以恢复缺失株的生长。

以上实验可证明穿梭质粒可以用于鸭疫里默氏杆菌基因敲除株的回补。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种用于大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌的高效穿梭质粒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 7590

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pFY02

<400> 1

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 60

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 120

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 180

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 240

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 300

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 360

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 420

ttcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atatcgacat ccgccctcac cgccaggaac 480

gcaaccgcag cctcatcacg ccggcgcttc ttggccgcgc gggattcaac ccactcggcc 540

agctcgtcgg tgtagctctt tggcatcgtc tctcgcctgt cccctcagtt cagtaatttc 600

ctgcatttgc ctgtttccag tcggtagata ttccacaaaa cagcagggaa gcagcgcttt 660

tccgctgcat aaccctgctt cggggtcatt atagcgattt tttcggtata tccatccttt 720

ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg gtgtatccaa 780

cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg ttccttcttc 840

actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg aggctggccg 900

gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa gccaaccagg 960

aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc gattgaggaa 1020

aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc tggccgtcgg ccagggctac 1080

aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat caatggcgac 1140

ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg cacggcgcgg 1200

ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg actctaggca tgcctattta 1260

ggcattagcc ctctttttaa cctgacttaa aaaataatta aatcataaga tattaaatat 1320

caagtgatta tgatttacta tgctatacat aatatcaccc agtgttagaa aattcttgct 1380

atgctttttg tttgtttttt ttcattcgtg aacttttaga atacttttaa aataaactca 1440

aatttataaa ctattgattt tcaatattat acaaaaccaa acttattaac attaaactta 1500

tttctattac ctttaaaata aactactaaa agacaaatct accaatcctc ggaactattt 1560

aataaatagg aagttatata aaaataatga acttttagaa tactttatta gtctttttag 1620

ctccaaaaat gaacttttag aatacttttt ttgaactttt agaatacttt tttaaacttg 1680

ctttttagta agttcatttt ttatatattt gtattctaaa agtgcatttt atattcataa 1740

ctctctatat atggcaaaag tagataataa actaatgttt cagtcctata tttttactac 1800

ggctaaatat gatttttcag tctatgaaaa gcgtatacta tataggcaaa tagaaataga 1860

acaggcattg ctaaataatg aggcgttgaa agattgtatc aaaatagata ctaacctatg 1920

gggggataaa aaatatacaa ttccaatttc tatgctgtta gctaatgatg aagataaaaa 1980

ttattataaa attaaaaaag cattcaaaga cctaaaatca aagaacattg agtacgaaga 2040

tgaaaaagaa tacgcttgct ttggtgttat tgataagttt tggattgata aatatggaag 2100

aaatgttact tggcaatctg acaaaagaat tgttgaagcg gtaatggatt ttacaagagg 2160

atggagaaaa tatgaattga agattgctat gcagtttgag actatttatg caatgcgttt 2220

ttacgaactg atagctaata aaaccaaacc aataacatat gaagtgtcat ttcttgaaaa 2280

aatgtttcaa ttggaaaata agtacaggaa ccctcagggt aatcttaata tcagtatgtt 2340

taaacgccgt gtattagacc ccgctaaaaa cgagttagat aaatgttctc catacacttt 2400

tgattatact ctttcaaagg ataaaaaaat tatttctcta attcctattt tccaagaaca 2460

atttgcagat gaaagtatga agatgatcaa aatagaagag gaaaaagata tacactctgt 2520

attaactcaa agagaaattg atgtttttac aaacgaattt ggttttacac aacaaggttt 2580

attaaacaac tatgccctat tcaaagattg taaggctaca cttccatcaa actattcttt 2640

cttccttttt caagagataa gaaaaagtcg gactaagaaa ggaaaaatat ctcctgctta 2700

tgtgattggg attataagaa atatgcttaa agatttcaaa aaagaacaac aataggctta 2760

tgaaaaaata tacaacaaaa gaaatcgcag agctttttgg cgtcagcgaa cggacaatcc 2820

agcgacacat aacgacacta agcgacaaca tatcaaatac cgacagaaag ggcttttcaa 2880

taccagaaga cattgttttc tttcttgccg agcgacacca ttacgacatt ttagcgacaa 2940

cgaacgacaa cgaacgacag gataaaaatg aagaatttcc tcatattgaa tacttcacag 3000

aagaggaata ccaagagttt aaaaaaagga tcacagagta cccttttttg aaagagcaaa 3060

ttaaactgtc taatgaacat ttggatactc taaaaacaca aatagaatat ttcagactat 3120

cttacaataa gcaattggat attcacgaaa aattaatcgg agcgttccga gaaagaaact 3180

ttattgaagc taaagaaaag gggatggata aatagctcct aataattaaa gaagtattag 3240

aaaaaaaatg ctatataaaa acttaatcga gctctatacg agatctgttc caatgcattg 3300

gctgcaggtc gacgtcggcc atatttcaaa aatttaactt aaaccactga tttacaaaaa 3360

tgtttatttg caaaactatt ttacaaagat attacaataa tttttctagc acaaatttat 3420

ttctcaccat atctttgcct tgttcaagtg agtgaacaga gtaacaaaca aaaaaagaaa 3480

caaatttaaa aaaattattt aaaattccgc gggctagcag gcctgcgcgc tgctctagaa 3540

ctcgagcatc atcatcatca tcattgaact agtggagttg cttctctttt cgggagtgga 3600

aaactgaaag aactggaacg tgccaacgaa aaactgcaag acgaggtttc aaaacggaac 3660

accaatattg aaaaattgca gagccaagta cagcagatgc agaaacagca tgatacgcaa 3720

atccacaatc tcagagaaat gcacaggcag gaacttgaca tgaaagaaaa agaactgtca 3780

cggctcgcca gaatcataga caaggctttc aggtggtttc cgatgttcag ggaaatgctg 3840

cgcatggaaa agttttgtgc catgctggga ttctctaaag aaatgactga aagtcttata 3900

gtcaaaaaag aagccctgaa atgtagcggt aaaatctatt ccgagcaaca caggcggaac 3960

tttgatataa aggatgatat tttaagggtg gaaaatgacc ctgacgatga aagcaggctg 4020

aacctgacaa taaacaggaa gccgattgcc gactggttca gggagcaatg gcacaggctt 4080

agatatggag caagagtgcc gcaacaggaa gaaagaaaaa gtagaggatt caaattataa 4140

tagaagcaat ttgattagta atctaaaagc actccgataa cgattagagt gcttttagat 4200

tgtttatcat taattatcaa agcaagtgca gtttaagatt ttactgaagt ttgcattaat 4260

aaagaatata ctacagctga tatatgcgca acatattgtg acgcttgtga tttatttccc 4320

ttgaaatcct taacaaatac cgctaaggta taactgatat tattaggcag acatatatag 4380

gcaacatcat tgtgagctgc aagaacacca ttttcattaa cataacctga acctgtctta 4440

tgcgctataa caaccccttc tttatcaaga agtggagctg ctatcctatc tacacctgtt 4500

ttgcattctt ttaacgtatt cttaatgaaa ctttgtttct catcatcgat aagaccttca 4560

gtaaacaaac gattcatcaa cattgcagca ccaagaggag atgtatagtt agagtaagcc 4620

ttgttatggt cagccgacat ttcctcttcc gtataagcta tctgaaaact tgaacgagga 4680

atgagtgtgg ctataaaact atctgtttga gcgacattaa ccatatcctt aaacataagg 4740

ttgcttgcat tgttgtcact ctgagtaaga gtataacgca gcaaatctct cactgtcaat 4800

gatatgactg gccctgaata atctttcagc ataggactcc aagtctttgg gtcaagttta 4860

tccctattta tatttactaa ggtatcaagt gaaattcctt tattgtcaaa gtcattacaa 4920

agagctaatg cctgatgaac cttaaacaca ctcatcatag gataaacact cttattattg 4980

accttaaccg tatctctgtt attaacaata accgccacac caatttcgcc aggacaagct 5040

gagacaattt gagaaatgct atcagtcaaa acatttgtta aaggaggatt tgcgctatct 5100

tttgtcgctg atttatggaa caatgaaaat accaagatga aaatgcaaac taaagctata 5160

ctcaaaacta cgatttgttt ttttctgttt ttttccatgt tttatattat ttatatttgt 5220

ttgacgagaa tatctttatt tgccgacaaa ggtacataac taaagtttcc cacccaaata 5280

aatagataga aaaataacag tttgtcgaat tttctttgta aattagtaat cgctaaagaa 5340

ctgattttgg ggatccccgg gtaccgagct cgaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 5400

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg 5460

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc 5520

tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 5580

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc 5640

gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 5700

acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 5760

cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 5820

taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 5880

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 5940

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 6000

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 6060

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 6120

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 6180

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 6240

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 6300

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 6360

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 6420

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 6480

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 6540

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 6600

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 6660

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 6720

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 6780

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 6840

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 6900

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 6960

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 7020

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 7080

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 7140

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 7200

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 7260

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 7320

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 7380

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 7440

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 7500

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 7560

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 7590

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oriT上游引物

<400> 2

cccaagcttc gcctgatgcg gtattttctc c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> oriT下游引物

<400> 3

acatgcatgc ctagagtcga tcttcgccag c 31

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRA0726 ori上游引物

<400> 4

acatgcatgc ctatttaggc attagccctc 30

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pRA0726 ori下游引物

<400> 5

aaaactgcag ccaatgcatt ggaacagatc tcgtatagag ctcg 44

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> High EXP上游引物

<400> 6

acgcgtcgac gtcggccata tttcaaaaat ttaacttaaa cc 42

<210> 7

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> High EXP下游引物

<400> 7

tgctctagag cagcgcgcag gcctgctagc ccgcggaatt ttaaataatt tttttaaatt 60

tg 62

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tonB2上游引物

<400> 8

aaggccttat gtcagatgaa aatttagg 28

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> tonB2下游引物

<400> 9

gctctagagc ttaatactca aaattcattg ccac 34