一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及日本乙型脑炎病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合、试剂盒及其应用。

背景技术：

乙型脑炎是一种可通过蚊虫媒介传播的人畜共患传染病，其由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起。JEV属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属。猪是乙脑病毒的主要感染动物之一，可与蚊虫形成循环传播模式。感染该病毒可导致妊娠母猪流产和死胎，公猪单侧或两侧性睾丸肿大。此病毒主要造成母猪繁殖障碍，给养猪业的持续高产发展造成巨大的经济损失。

目前核酸方面的检测方法主要为传统PCR、荧光定量PCR以及核酸杂交技术等。定量或者半定量的PCR方法已经有许多的研究报道，往往也显示出不错的效果。但是，在感染早期，病毒感染量较低时，这些方法的检测灵敏度低、检出率低，不能提供及时准确的诊断结果。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合，该核酸组合包括检测日本乙型脑炎病毒的引物和探针，利用微滴数字PCR技术检测出待测样本中低含量的日本乙型脑炎病毒，特异性强。

本发明的第二目的在于提供上述检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合在检测日本乙型脑炎病毒中的应用，提高检测的灵敏性和特异性。

本发明的第三目的在于提供一种检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒，该试剂包括上述核酸组合，该试剂盒可用于检测低日本乙型脑炎病毒含量的待测样本，其具有灵敏性好、特异性强、检测速度快、操作方便等特点。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合，其包括引物对和与引物对相对应的探针，引物对包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示的第一义务和如SEQ ID NO.2所示的第二引物，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记有荧光报告基团，荧光报告基团选自HEX、FAM或VIC中的任意一种，探针的3’端标记有淬灭基团，淬灭基团为BHQ或TAMRA。

上述的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合在检测日本乙型脑炎病毒中的应用。

一种检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒，其包括上述的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合。

本发明实施例提供的一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合、试剂盒及其应用的有益效果是：

本发明的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合，根据日本乙型脑炎病毒全基因组的保守序列进行设计，该核酸组合包括碱基序列如SEQ ID NO.1所示的第一引物、如SEQ ID NO.1所示的第二引物以及碱基序列如SEQ ID NO.3所示的探针。该核酸组合用于日本乙型脑炎病毒的检测具有很好的特异性。将该核酸组合制备成检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒或者用于微滴数字PCR平台上检测日本乙型脑炎病毒，可实现对低日本乙型脑炎病毒含量的样本进行检测，具有灵敏性高、特异性强、检出率高等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例7中不同退火温度的扩增图；

图2为本发明实施例8中qPCR的标准曲线图；

图3为本发明实施例8中qPCR的特异性验证结果图；

图4为本发明实施例8中ddPCR的特异性验证结果图；

图5为本发明实施例9中灵敏性验证结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合、试剂盒及其应用进行具体说明。

微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法。其原理是通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在一定数目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子数目为1或0，然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出(现有的微滴数字PCR仪器基本上都自动相应软件可自动计算出DNA分子数)样本中的DNA分子数。该方法无需内参基因无需制备标准曲线，在微量核酸待测样本的检测中显示出很好的检测效果。

乙型脑炎是一种可通过蚊虫媒介传播的人畜共患传染病，具有有明显的季节性及区域性。乙型脑炎主要流行于东亚、南亚和太平洋地区，每年因日本乙型脑炎病毒感染而死亡的易感人群在亚洲各国均有大量报道，对全球公共卫生安全造成一定威胁。同时，猪作为日本乙型脑炎病毒主要的易感动物，感染该病毒后使得母猪繁殖障碍，对我国养猪业的持续增产造成巨大危害。因此，建立一种高度灵敏，能在早期检测极微病毒量的日本乙型脑炎病毒ddPCR检测技术，不仅对该病的鉴别诊断和预防控制提供支撑，也为我国公共卫生安全和人畜共患病实时监控提供技术参考。

基于此，发明人根据日本乙型脑炎病毒的全基因组的保守序列设计出了可用于ddPCR平台的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合，其包括引物对和与引物对相对应的探针，引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2所示的引物，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记有荧光报告基团，选自HEX、FAM或VIC中的任意一种，探针的3’端标记有淬灭基团BHQ或TAMRA。

具体地，引物对包括SEQ ID NO.1所示的第一引物即上游引物和如SEQ ID NO.2所示的第二引物即下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

通过上述核酸组合，可实现对日本乙型脑炎病毒的检测，其具很好的特异性。

本发明提供了检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒，其包括上述任一种的核酸组合。

该试剂盒可用于在ddPCR平台上检测待测样本中是否含有日本乙型脑炎病毒，该试剂盒在ddPCR平台上的运用，与现有技术的检测方法相比，尤其适用于对低日本乙型脑炎病毒含量的待测样本的检测，具有灵敏性好、特异性强、检出率高的特点。

优选地，本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒还可以包括在进行ddPCR时配套的PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一种或多种等成分。

本发明提供了上述的任意一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合在检测日本乙型脑炎病毒中的应用。该检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合其不仅可在ddPCR平台进行应用，还可以通过荧光定量PCR、普通PCR等方式来实现对检测日本乙型脑炎病毒的检测，只要采用本发明提供的核酸组合用于检测日本乙型脑炎病毒即属于本发明的保护范围。

将本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合应用于日本乙型脑炎病毒的检测包括以下操作步骤：

(1)配制PCR反应体系

往PCR体系中加入上述的引物对和与引物对相对应的探针，以进行PCR，实现对待测样本中日本乙型脑炎病毒的高灵敏性检测。其中，PCR体系包括PCR反应混合液和待测样本的DNA模板。PCR反应混合液可通过市面购买，也可自行配制，PCR反应混合液主要包括PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶等成分。

优选地，引物对在PCR体系中的终浓度分别为0.88-0.92μM。更优选地，引物对在PCR体系中的终浓度分别为0.9μM。

优选地，探针在PCR体系中的终浓度为0.23-0.27μM。更优选地，引物对在PCR体系中的终浓度为0.25μM。

(2)微滴生成

将PCR体系与微滴生成油混合形成微滴，并进行微滴数字PCR。

优选地，微滴生成油与PCR体系的体积比为6.8-7.2:2。更优选地，微滴生成油与PCR体系的体积比为7:2。

优选地，微滴生成后，对其进行封闭处理，封闭处理的程序为：温度178-182℃，时间8-12s；更优选地，封闭处理程序为：温度180℃，时间10s。封闭处理即是对反应容器进行封闭，防止在反应过程中液体蒸发。

当然，本发明在其他的实施例中，也可以采用将PCR反应体系分散到ddPCR反应芯片上的方式形成微滴，并不限于采用微滴生成油包裹的方式。

(3)在预设条件进行微滴数字PCR反应

优选地，进行微滴数字PCR的预设条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，50-60℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

(4)检测

在微滴分析仪器上检测相应的荧光信号，得到检测结果。

综上，本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法具有很高的灵敏性和很强的特异性，能够有效地对低日本乙型脑炎病毒含量的待测样本进行检测，检出率高，克服了现有检测方法中对低日本乙型脑炎病毒含量的待测样本的检测灵敏度不高的缺陷，为日本乙型脑炎病毒的检测提供了更多的科学依据和支撑。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合，其包括引物对和探针。该引物对和探针根据日本乙型脑炎病毒全基因组的保守序列进行设计得到，可用于检测出待测样本中是否含有日本乙型脑炎病毒。

具体地，引物对的上游引物为：

5’-TGGACCACAACACTTGGAACAT-3’(其碱基序列如SEQ ID NO.1所示)。

引物对的下游引物为：

5’-CACAGTCGTCTCCGCTGATC-3’(其碱基序列如SEQ ID NO.2所示)。

探针为：

HEX-5’-CTTTGAGAATGGAGAGGAGAGAGTGA-3’-BHQ(其碱基序列如SEQ ID NO.3所示)。

综上，本实施例提供的核酸组合可通过采用微滴数字PCR技术，检测出待测样本中是否含有日本乙型脑炎病毒，实现对日本乙型脑炎病毒的快速检测，提高检测的灵敏度。

应当理解的是，在其他的实施例中，本发明提供核酸组合中的探针的5’端标记的荧光报告基团可以是FAM或VIC，3’端的淬灭基团可以是TAMRA。

实施例2

本实施例提供了检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒，该试剂盒包括实施例1提供的核酸组合。该试剂盒可用于在微滴数字PCR平台上检测待测样本中是否含有日本乙型脑炎病毒。本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，能够检测出样本中的极微量的病毒。

应当理解的是，在其他的实施例中，本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒还可以包括在进行微滴数字PCR时配套的PCR反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶中的一种或多种等成分。

实施例3

本实施例提供了应用上述核酸组合检测日本乙型脑炎病毒的方法，具体如下。

1.配制ddPCR反应体系20μL：ddPCR缓冲液10μL，上、下游引物终浓度各为0.9μM，探针终浓度为0.25μM，待测样本的DNA模板2μL，双蒸H₂O补足至20μL。

上、下游引物以及探针的碱基序列同实施例1。

2.生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反应体系方式形成微滴，微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比7:2。在本实施例中，将PCR反应体系20μL加入微滴生成卡中间一排，微滴生成油(droplet generation oil)70μL加入微滴生成卡最底一排，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪(QX100微滴式数字PCR系统、美国伯乐公司)，自动生成微滴。

3.封闭ddPCR体系：吸取生成的微滴40μL加入96孔反应板内，用预热好的热封仪(PX1PCR热封仪、美国伯乐公司)对96孔反应板进行封膜，封膜程序为：温度180℃，时间10s。

4.按如下ddPCR反应条件进行反应：95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

5.检测：在微滴分析仪(QX100微滴式数字PCR系统、美国伯乐公司)的HEX通道检测HEX荧光信号。根据荧光信号值，检测出待测样本中的日本乙型脑炎病毒的浓度。

实施例4

本实施例提供了应用上述核酸组合检测日本乙型脑炎病毒的方法，其与实施例3中提供的方法大致相同，其区别在于：本实施例提供的检测日本乙型脑炎病毒的方法的ddPCR反应体系中上、下游引物终浓度各为0.92μM；ddPCR反应体系中探针终浓度为0.23μM；微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比为6.8:2；封膜程序为：温度182℃，时间8s。

实施例5

本实施例提供了应用上述核酸组合检测日本乙型脑炎病毒的方法，其与实施例3中提供的方法大致相同，其区别在于：本实施例提供的检测日本乙型脑炎病毒的方法的ddPCR反应体系中上、下游引物终浓度各为0.88μM；ddPCR反应体系中探针终浓度为0.27μM；微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比为7.2:2；封膜程序为：温度178℃，时间12s。

实施例6

本实施例提供了应用上述核酸组合检测日本乙型脑炎病毒的方法，其与实施例3中提供的方法大致相同，其区别在于：本实施例提供的检测日本乙型脑炎病毒的方法的ddPCR反应体系中上、下游引物终浓度各为0.9μM；ddPCR反应体系中探针终浓度为0.25μM；微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比为7:2；封膜程序为：温度178℃，时间8s。

实施例7

本实施例提供了应用上述核酸组合对日本乙型脑炎病毒进行ddPCR扩增的扩增退火温度的优化。

本实施例中采用实施例3中的方法分别在60℃、59.2℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃的退火温度下进行PCR扩增，比较不同温度下的扩增效率。结果如图1所示。

由图1(1-8分别代表：退火温度分别为60℃、59.2℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃、阴性对照)可知，退火温度在60℃、59.2℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃下均能扩增，并且扩增效率差异不明显，阴性对照没有荧光信号。

实施例8

对实施例1提供的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合进行特异性验证。

1利用qPCR方法检测上述核酸组合的扩增效率：

以浓度依次为10⁴copies/μL、10⁵copies/μL、10⁶copies/μL、10⁷copies/μL、10⁸copies/μL的PMD-19T-JEV重组质粒为模板，用qPCR方法进行扩增，绘制标准曲线。

(JEV cDNA质粒模板PMD-19T-JEV的制备方法可参考：利用JEV特异性引物对病毒核酸RNA进行RT-PCR扩增，扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，对扩增片段进行纯化回收，纯化后的DNA与载体PMD-19T在16℃连接过夜，并转化至感受态细胞DH5a中，在含100ng/mL的氨苄青霉素的营养琼脂培养基上37℃培养16-24h，筛选阳性克隆子进行测序鉴定。按照质粒提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取PMD-19T-JEV重组质粒，利用超微量核酸蛋白测定仪(Nanodrop 2000)测定重组质粒浓度，置于-70℃保存备用。)

1.1配制qPCR反应体系20μL：2×qPCR反冲液10μL，上游引物和下游引物终浓度各为0.4μM，探针终浓度为0.6μM，待测样本的DNA模板2μL，双蒸水H₂O补足20μL。

上、下游引物以及探针的碱基序列同实施例1。

1.2按如下qPCR反应条件进行反应：94℃预变性3min；94℃变性10s，58℃退火30s，72℃30s(收集荧光信号)，40个循环。结果如图2所示。

由图2(图2-A为qPCR的扩增曲线，图2-B为qPCR的标准曲线)可知，日本乙型脑炎病毒qPCR的扩增效率E＝95.7％，标准曲线的相关系数R²＝0.999，标准曲线线性关系良好。

2利用qPCR方法验证上述核酸组合的特异性：分别以猪日本乙型脑炎病毒(JEV，SA14-14-2株)疫苗、猪伪狂犬病毒(PRV，Bartha-K61,HB-98株)疫苗、猪圆环病毒2型(PCV2，LG,ZJ/C株)疫苗、猪瘟病毒(CSFV，兔化弱毒株)疫苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，R98、CH-1a、CH-1R株)疫苗、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV，JXA1-R、HUN4株)疫苗为待测样本，检测上述核酸组合的特异性。

2.1配制qPCR反应体系20μL：2×qPCR反冲液10μL，上游引物和下游引物终浓度各为0.4μM，探针终浓度为0.6μM，标准品(JEV cDNA质粒模板)2μL，双蒸水H₂O补足20μL。

2.2按如下qPCR反应条件进行反应：94℃预变性3min；94℃变性10s，58℃退火30s，72℃30s(收集荧光信号)，40个循环。结果如图3所示和表1所示。

由图3和表1可知，以PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的DNA/cDNA为模板的反应孔中均没有检测出荧光信号，而以JEV cDNA质粒为模板的反应孔中检测到荧光信号。由此表明，以JEV cDNA质粒为模板的反应孔中有扩增，上述核酸组合对日本乙型脑炎病毒具有很好的特异性。

3利用ddPCR方法检测上述核酸组合的特异性：分别以猪日本乙型脑炎病毒(JEV，SA14-14-2株)疫苗、猪伪狂犬病毒(PRV，Bartha-K61,HB-98株)疫苗、猪圆环病毒2型(PCV2，LG,ZJ/C株)疫苗、猪瘟病毒(CSFV，兔化弱毒株)疫苗、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，R98、CH-1a、CH-1R株)疫苗、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV，JXA1-R、HUN4株)疫苗为待测样本，检测上述核酸组合的特异性。

3.1配制ddPCR反应体系20μL：ddPCR缓冲液10μL，上、下游引物终浓度各为0.9μM，探针终浓度为0.25μM，待测样本的DNA模板2μL，双蒸H₂O补足至20μL。

上、下游引物以及探针的碱基序列同实施例1。

3.2生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反应体系方式形成微滴，微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比7:2。在本实施例中，将PCR反应体系20μL加入微滴生成卡中间一排，微滴生成油70μL加入微滴生成卡最底一排，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪(QX100微滴式数字PCR系统、美国伯乐公司)，自动生成微滴。

3.3封闭ddPCR体系：吸取生成的微滴40μL加入96孔反应板内，用预热好的热封仪(PX1PCR热封仪、美国伯乐公司)对96孔反应板进行封膜，封膜程序为：温度180℃，时间10s。

3.4按如下ddPCR反应条件进行反应：95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

3.5检测：在微滴分析仪(QX100微滴式数字PCR系统、美国伯乐公司)的HEX通道检测HEX荧光信号。根据荧光信号值，检测出待测样本中的日本乙型脑炎病毒的浓度。结果如图4所示和表1所示。

由图4和表1可知，以PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的DNA/cDNA为模板的反应孔中均没有检测出荧光信号，而以JEV cDNA质粒为模板的反应孔中检测到荧光信号。由此表明，以JEV cDNA质粒为模板的反应孔中有扩增，在ddPCR检测平台上，上述核酸组合对日本乙型脑炎病毒具有很好的特异性。

利用qPCR和ddPCR分别检测JEV、PRV、PCV2、CSFV、PRRSV、HP-PRRSV的结果如表1所示。

表1特异性检测结果

注：“+”表示检测到荧光信号，“－”表示未检测到荧光信号。

综上，本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合以及试剂盒对日本乙型脑炎病毒的检测具有很好的特异性。

实施例9

本实施例提供了应用上述核酸组合检测日本乙型脑炎病毒的灵敏性的验证。

本实施中主要通过将检测日本乙型脑炎病毒的qPCR方法与ddPCR方法进行对比，以评价上述核酸组合在两种方法中检测日本乙型脑炎病毒的灵敏性。以终浓度为10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL、10^-1copies/μL的PMD-19T-JEV重组质粒为模板，分别以qPCR和ddPCR两种方法进行PCR扩增。具体地：

1 qPCR方法按照如下步骤进行：

1.1配制qPCR反应体系20μL：2×qPCR缓冲液10μL，上游引物和下游引物终浓度各0.4μM，探针终浓度为0.6μM，PMD-19T-JEV重组质粒2μL，双蒸水H₂O补足20μL。

上、下游引物以及探针的碱基序列同实施例1。

1.2按如下qPCR反应条件进行反应：94℃预变性3min；94℃变性10s，58℃退火30s，72℃30s(收集荧光信号)，40个循环。结果如图5-A所示。

2 ddPCR方法按照如下步骤进行：

2.1配制ddPCR反应体系20μL：ddPCR缓冲液10μL，上、下游引物终浓度各为0.9μM，探针终浓度为0.25μM，PMD-19T-JEV重组质粒2μL，双蒸H₂O补足至20μL。

上、下游引物以及探针的碱基序列同实施例1。

2.2生成微滴：采用微滴生成油包裹ddPCR反应体系方式形成微滴，微滴生成油与ddPCR反应体系的体积比7:2。在本实施例中，将PCR反应体系20μL加入微滴生成卡中间一排，微滴生成油70μL加入微滴生成卡最底一排，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪(QX100微滴式数字PCR系统、美国伯乐公司)，自动生成微滴。

2.3封闭ddPCR体系：吸取生成的微滴40μL加入96孔反应板内，用预热好的热封仪(PX1PCR热封仪、美国伯乐公司)对96孔反应板进行封膜，封膜程序为：温度180℃，时间10s。

2.4按如下ddPCR反应条件进行反应：95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火1min，40个循环；98℃10min，4℃停止反应。

2.5检测：在微滴分析仪(QX100微滴式数字PCR系统、美国伯乐公司)的HEX通道检测HEX荧光信号。根据荧光信号值，检测出待测样本中的日本乙型脑炎病毒的浓度。结果如图5-B所示。

由图5(图5-A为qPCR的灵敏性验证结果；图5-B为ddPCR的灵敏性验证结果，其中1-7中分别代表扩增模板拷贝数分别为10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL、10^-1copies/μL。)可知，qPCR的最低检出浓度为10²copies/μL，ddPCR的最低检出浓度为10⁰copies/μL。由此说明ddPCR检测方法的最低检出浓度比qPCR高出两个数量级。进一步说明，本发明中提供的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合应用于ddPCR检测方法对日本乙型脑炎病毒的检测具有很高的灵敏性。

实施例10

本实施例中提供了检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合分别结合qPCR和ddPCR检测平台检测实际样本。

qPCR的检测方法同实施例8；

ddPCR的检测方法同实施例8；

对57份疑似患病猪的样品进行ddPCR检测，同时用qPCR对样品进行平行检测，并对两者的检测结果进行比较。57份样品中包括：31份内脏样品、18份精液样品、6份流产胎样品、2份脑组织样品。检测结果如表2所示。

表2.样品信息及检测结果

注：SAU:Sichuan Agricultural University(四川农业大学)；阳性总检出率＝(检出阳性样品总数/57)×100％。

由表2可知，在57份实际样品中，qPCR检出阳性样品总数为23个，阳性检出率为40.4％；ddPCR检出阳性样品总数为31个，阳性检出率为54.4％。ddPCR的阳性检出率高于qPCR的阳性检出率，由此表明：本发明提供的核酸组合可应用于qPCR和ddPCR检测平台，实现对日本乙型脑炎病毒的检测，并且ddPCR可以弥补qPCR的不足，可对荧光定量PCR检测结果可疑的样品进行进一步确证。

综上所述，本发明提供的检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合，根据日本乙型脑炎病毒全基因组的保守序列进行设计，该核酸组合包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1-2所示的引物对和碱基序列如SEQ ID NO.3所示的探针。该核酸组合用于日本乙型脑炎病毒的检测具有很好的特异性。将还核酸组合制备成检测日本乙型脑炎病毒的试剂盒或者用于微滴数字PCR平台上检测日本乙型脑炎病毒，可实现对低日本乙型脑炎病毒含量的样本进行检测，具有灵敏性高、特异性强、检出率高等特点。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心 、成都大学

<120> 一种检测日本乙型脑炎病毒的核酸组合、试剂盒及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggaccacaa cacttggaac at 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacagtcgtc tccgctgatc 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctttgagaat ggagaggaga gagtga 26