一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用。

背景技术：

肺癌是我国乃至世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。国家癌症登记中心最新数据显示：我国每年新发病例约70.5万，发病率为36.28/10万人，死亡病例约56.9万，死亡率为28.81/10万人，严重威胁着国民健康。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌发病的80-85％，包括肺腺癌及鳞癌两大主要病理类型，针对NSCLC发生发展的分子机制进行深入研究是当前肺癌研究关注的热点。

既往的生命科学研究大多着眼于编码基因，近年来，随着后基因组时代技术水平的不断发展，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)已经引起了越来越多的关注。lncRNA是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传水平、转录以及转录后水平等)调控基因的表达，因而最近受到极大关注。越来越多的研究证实，lncRNAs不仅在机体的正常生理功能维持及发育过程中发挥重要的调控作用，其异常表达与疾病的发生发展尤其是肿瘤的恶性进展有着密切联系。恶性肿瘤是目前lncRNAs研究最为活跃的领域之一，越来越多的研究表明lncRNAs可在细胞内形成复杂的表达调控网络，调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移等重要过程，影响多种肿瘤包括肺癌的发生发展。例如lncRNA HOTAIR通过募集和绑定PRC2介导靶基因组蛋白H3K27三甲基化的修饰表观抑制一系列抑癌基因的表达，促进乳腺癌细胞的侵袭转移。在胃癌细胞中HOTAIR也可以“竞争性的吸附”miR-331-3p从而促进HER2表达，促进胃癌发生发展。例如，在肺癌中最先发现的lncRNA MALAT1异常高表达，可在组蛋白修饰、转录等多个水平调控多种癌相关基因促进肺癌恶性进展。

Weinberg等人在Cell上提出肿瘤细胞持续的恶性增殖是其重要表型之一，而且正常细胞转化成肿瘤细胞过程中需要获得一系列表型和能力，包括避免免疫细胞杀伤的表型。且已有证据表明肿瘤细胞要生长必须降低其自身的免疫原性从而避免免疫识别和杀伤。然而关于调控肿瘤细胞获得这种表现过程的机制研究较少，而新近许多研究已表明，lncRNAs可以在各种免疫细胞中调控其免疫生物学的功能。但其在肿瘤细胞中内源性的免疫角色尚不清楚，值得深入研究。

为进一步研究lncRNAs在NSCLC发生发展中的作用，我们首先通过对肺癌与癌旁组织的GEO(Gene Expression Omnibus)数据库和TCGA(The Cancer Genome Atlas)大数据库进行分析，筛选出lncRNA LINC01116。结果发现LINC01116在多份芯片数据中表达上调且倍数高于肺癌阳性参照lncRNA MALAT1和HOTAIR，LINC01116是一种基因间的lncRNA,定位于人类染色体2q31.1，全长1058nt，目前尚无其参与肿瘤发生发展的研究。进一步通过qPCR在190对NSCLC标本中验证发现其表达显著上调。进一步生物信息学分析发现LINC01116启动子区存在高丰度的组蛋白H3K27乙酰化富集，ChIP实验证明H3K27Ac能够激活LINC01116的表达。细胞及动物实验发现敲低LINC01116的表达能显著抑制细胞的增殖能力，并诱导细胞凋亡。敲低LINC01116后转录组测序发现其不仅可以调控增殖凋亡相关基因，意外发现其还主要影响抗肿瘤免疫反应和炎症相关基因。机制研究发现LINC01116在细胞核中可以作为“分子脚手架”同时绑定PRC2和DNMT1，同时在组蛋白甲基化和DNA甲基化水平表观沉默IRF7和CD1D的表达。CD1D作为NKT细胞识别的唯一靶点，共培养实验发现敲低LINC01116能够增强NKT细胞对NSCLC细胞的识别和杀伤能力。而LINC01116在细胞质中可作为“竞争性的内源RNA”“吸附”microRNA-145-5p，促进Survivin表达，从而促进NSCLC细胞生存。综上，我们发现LINC01116在细胞核和细胞质中通过不同的分子机制，共同促进NSCLC细胞免疫逃逸，从而促进NSCLC的恶性增殖，参与NSCLC发生发展，并可能为NSCLC的诊断治疗提供靶点和依据。

技术实现要素：

本发明的目的是提供用于诊断非小细胞肺癌(NSCLC)预后情况或作为治疗非小细胞肺癌药物靶点的lncRNA LINC01116，其基因位于2q31.1，全长1058nt，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，

SEQ ID NO:1：

本发明还涉及识别所述的长非编码RNA的标记物在制备判断非小细胞肺癌治疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：

(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；

(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

优选的，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，

LINC01116 Primer F(SEQ ID NO：2)：5'AACGCTTTTGAATATGGGGAC3',

Primer R(SEQ ID NO：3)：5’-CAATCACAGAGCTCTCCTTGC-3’。

GAPDH Primer F(SEQ ID NO：4)：5'AGCCACATCGCTCAGACAC 3',

Primer R(SEQ ID NO：5)：5'GCCCAATACGACCAAATCC3'。

本发明还涉及包含所述的识别所述的长非编码RNA的标记物的用于判断非小细胞肺癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。

本发明还涉及所述的识别所述的长非编码RNA的标记物或包含所述标记物的试剂或试剂盒在判断非小细胞肺癌的治疗预后情况中的应用。

本发明还涉及所述的长非编码RNA在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用；

本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选判断非小细胞肺癌预后情况的诊断试剂中的应用。

本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。

技术方案

组织标本收集

190对NSCLC组织及癌旁组织标本来自于江苏省肿瘤组织标本库及南京军区总院呼吸科标本库，从2009和2010年开始收集整理，并经过病理科严格鉴定。所有标本一经切除均立即在液氮中冷冻，贮存于-80℃，直到RNA提取。而且本研究经过南京医科大学伦理委员会同意。

细胞培养

NSCLC细胞系A549，PC9，NCI-H1703，NCI-H1975，NCI-H226，SK-MES-1，NCI-H1650，NCI-H1299以及肺粘膜上皮正常细胞系16HBE均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养在含有10％胎牛血清(10％FBS)的RPMI 1640或DMEM的培养基(GIBCO)，含双抗100U/ml青霉素和100毫克/毫升链霉素(Invitrogen公司)。5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度满时传代。

RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa Prime Script试剂盒(TaKaRa，大连，中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

质粒构建

根据NCBI(gene)查询人LINC01116基因的全长cDNA序列，公司合成LINC01116的全长序列，并插入真核表达载体pCDNA3.1(+)中，构建LINC01116真核过表达载体pCDNA-LINC01116，将上述质粒转化大肠杆菌，摇菌，提取质粒后用于后续实验。

细胞转染

所有用于转染的质粒载体(pCDNA3.1-LINC01116、si-LINC01116和空载体质粒)，均需用去除内毒素的质粒提取试剂盒提取(Qiagen)。目的基因的干扰序列及阴性对照(si-NC)均购自Invitrogen公司(Invitrogen，USA)。A549细胞和NCI-H226细胞融合满了就接种到六孔板里，然后根据说明操作。转染48小时后，收集细胞，用于qRT-PCR或免疫印迹分析。

细胞增殖活性检测

MTT实验，将处理后的细胞按每孔2000-3000个细胞接种于96孔培养板。待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。

克隆形成试验，首先使用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液。将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力)接种于培养皿中(大约600-1000个左右)，使细胞分散均匀。置37℃CO2孵箱中，大概培养2周左右。经常观察换液，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇1-2ml左右，固定10-15min左右。然后去固定液，加适量0.1％结晶紫应用染色液染10～30min，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥。然后将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数，最后比较各组差异，计算克隆形成率。

BrdU实验分析，BrdU实验步骤根据试剂盒提供的说明书按步骤进行(Millipore,Cat.No.2750)。高的OD值代表高的增殖能力。

流式细胞术

凋亡检测，用胰酶消化收集转染48小时后的细胞，随后根据FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭(PI)染色。流式细胞仪检测和分析。

细胞周期检测，根据说明书使用CycleTESTTM PLUS DNA试剂盒(BD)予以PI染色，随后用FACScan分析。

细胞蛋白提取与测定

细胞总蛋白的提取：细胞培养板置于冰上，将转染后的细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。取RIPA细胞裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF及蛋白酶抑制剂cocktail，使PMSF的最终浓度为1mM，混匀加入细胞中。按照6孔板每孔加入100μl左右的体积加入混合好的裂解液。用洁净的细胞刮刀将细胞从培养皿底面刮离，使裂解液和细胞充分接触。冰上放置20min，使细胞裂解充分。待细胞充分裂解后，4℃，12000g离心10min，取上清，即为总蛋白。

BCA试剂盒测蛋白浓度：取0.8ml蛋白标准液加入到一管标准蛋白(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。取适量的25mg/ml的蛋白标准溶液稀释至终浓度为0.5mg/ml。根据样品的数量，按照50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。加适当的体积的样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。用酶标仪测定570nm处的吸光度值，根据标准曲线计算待测蛋白样品的浓度。

免疫印迹分析和抗体

细胞蛋白裂解产物通过10％SDS-PAGE分离开，转移到0.22μm NC膜，用特定的抗体孵育。放射自显影用密度测定法从而被量化。GAPDH抗体被用来作为对照。特异性的目的抗体和GAPDH抗体(1:1000)从CST公司购买。

免疫组化实验

脱蜡：二甲苯3×5min，100％乙醇1×5min，100％乙醇1×1min，95％乙醇2×1min，70％乙醇1×1min，双蒸水浸泡洗去乙醇；烧杯中盛放600ml DW+5.6ml抗原修复液，将玻片架于塑料架上，浸入，置微波炉大火3-5min，沸腾就调成小火，15-20min，时间长些利于抗原更多的暴露；自然冷却后，擦干组织片周围的水，用免疫组化笔划好；PBS+0.03％Tween20(300μl Tween20加入1000ml PBS中)，滴加，冲洗5min，甩去；3％H2O2滴加，15min，甩去；PBS冲洗5min；封闭抗原(用PBS配制5％脱脂牛奶滴加)30min；滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，甩去水分，加入一抗，4℃过夜；滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，3×5min；滴加二抗孵育；滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，2×5min，PBS冲洗1×5min；滴加DAB，流水冲洗5-10min；苏木素染色1min，流水冲洗5min；1％Hcl(用70％酒精配制)浸泡5-15s，流水冲洗10min；70％乙醇2min，80％乙醇2min，95％乙醇2×2min，100％乙醇2×15min，二甲苯3×5min；封片。

组织切片H&E染色

首先用二甲苯脱蜡，然后梯度酒精脱水；二甲苯5min→二甲5min→100％乙醇2min→95％乙醇2min→90％乙醇2min→85％乙醇2min→80％乙醇2min→70％乙醇2min→50％乙醇2min→30％乙醇2min→苏木精染色5min→ddH2O冲洗5min→弱氨水5s→ddH2O 2min→30％乙醇2min→50％乙醇2min→70％乙醇2min→80％乙醇2min→85％乙醇2min→85％乙醇30min→90％乙醇2min→95％乙醇，伊红染色10min→95％乙醇2min→100％乙醇2min→100％乙醇2min→二甲苯5min-二甲苯5min。中性树胶封片，晾干，即可显微镜下观察组织病理改变情况。

G418方法筛选稳转细胞

将细胞稀释到1000个细胞/ml，铺24孔板，在100ug/ml～1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10到14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。质粒转染24h之后才开始加G418筛选，随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3到5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200μg/ml。待细胞单克隆形成后，终止培养将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确；在超净台内，弃去培养皿内的培养液；用镊子夹取一块滤纸块，用0.25％Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20s；将24孔培养板每孔加G418选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸块，置于一个孔的培养基中，涮洗滤纸块数次，以使黏附的细胞脱落下。镜下观察确认细胞已经脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆方法转移同上；将移有克隆细胞的24孔培养板，继续置37℃5％CO2培养箱培养，2-5天；待细胞长满后，0.25％Trypsin消化液消化，并将细胞转移至6孔板继续培养，或转入多瓶中扩增，此后可做进一步鉴定工作。

裸鼠肺转移模型实验

购买4周龄雄性裸鼠BALB/c小鼠，备用；培养A549细胞，培养A549细胞，分别转染sh-LINC01116载体和空载体；G418筛选稳转细胞，胰酶消化，PBS洗两遍，重新悬浮在无血清培养基中，并计数。细胞均取2×106个细胞悬浮在0.1ml无血清培养基或PBS中，注射细胞后自瘤体出现开始，每三天观察1次瘤体的形成情况，并测量瘤体的体积；瘤体形成第16天后处死裸鼠，取标本，测量标本的重量和体积，肿瘤体积计算公式是：length×width2×0.5，其中L是肿瘤的最大长度，W是肿瘤的最大宽度；以上所有的实验程序都是按着NIH1996年版的动物实验指导来执行的。用全价颗粒饲料喂养小鼠，自由饮高压灭菌水，室温(22±2)℃，湿度50～60％，通风良好，12:12h光照/黑暗周期。所有实验经过南京医科大学动物保护和伦理委员会(IACUC)批准。

亚细胞结构定位

根据使用说明书使用PARIS试剂盒(Life Technologies，USA)分离肺癌细胞的细胞核和细胞质。使用qPCR方法检测LINC01116、GAPDH和U6在细胞质和细胞核中的分布。GAPDH为细胞质参照，U6为细胞核参照。以总RNA百分比呈现LINC01116、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的表达情况。

转录组测序实验

将细胞种植于六孔板中，待细胞长至80％左右后给于10ul的lip2000si-LINC01116和si-NC处理，48h后用Trizol处理收集细胞，送样，由北京基因检测机构实施，选用Illumina进行随后的实验，得到并处理相应的数据。

生物信息学预测目的蛋白与lncRNAs结合

在(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/references.php)网站在线预测各个目的蛋白与LINC01116结合的可能性。主要是通过查询目的蛋白的氨基酸序列与LINC01116的核酸序列结合能力的预测。通过运用BioGPS(http://biogps.org/#goto＝welcome)来分析LINC01116在各种正常组织中的表达。

RNA 免疫印迹(RIP)

裂解A549和NCI-H226细胞供内源性PRC2复合物免疫印迹实验使用。将细胞上清与包被分别识别EZH2、DNMT1、SNRNP70和对照IgG的蛋白A/G琼脂糖磁珠在4℃孵育6个小时。随后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分钟以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

染色质免疫共沉淀(CHIP)

使用4％多聚甲醛固A549和NCI-H226细胞，孵育10分钟以产生DNA-蛋白交联。超声裂解细胞以产生200-300bp的染色体碎片，随后用EZH2和DNMT1特异性抗体和对照IgG抗体孵育沉淀。恢复染色质DNA，随后使用qPCR检测分析。

荧光素酶报告基因实验

合成野生型和突变型的序列(包括LINC01116的序列，Survivin的3UTR)，插入到荧光素酶载体中，将上述质粒转化大肠杆菌，摇菌、培养、挑选单克隆菌培养，提取质粒后测序。构建好的质粒与renilla荧光素酶质粒共同转染NSCLC细胞，经过相应的组别处理后，48小时后采用promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒，具体步骤如下：将24孔板中细胞用试剂盒中的裂解液100微升将细胞刮落，室温放置15分钟，转移入1.5ml离心管中放入-80冰箱待测；取细胞裂解上清20ul，加100ul含有Firefly荧光素酶底物的LARⅡ缓冲液，涡旋震荡混匀，于荧光素酶检测及其上读值，此值为Firefly荧光素酶活性值再加入100ul含有renilla荧光素酶底物的Stop缓冲液，涡旋震荡混匀，于荧光素酶检测仪上读值，此值为renilla荧光素酶活性值。荧光素酶相对活性＝Firefly荧光素酶活性值/renilla荧光素酶活性值。

RNA pull down实验

在体外，LINC01116转录本通过T7RNA聚合酶(Ambion Life)转录,然后利用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)和DNase 1(Qiagen)处理。纯化的RNA利用生物素标记RNA组合(Ambion Life)进行生物素标记。阳性的对照、阴性的对照和生物素化的rna在A549细胞裂解液中混合和孵化。然后,磁珠被添加到每个结合反应,混合物在室温下孵育。最后,清洗磁珠,筛选了蛋白质通过免疫印迹分析检测。

数据处理

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验，相关性分析用线性回归模型分析，NSCLC病人预后用生存函数分析。P值标示于图中，P<0.05，P<0.01为差异显著，具有统计学意义。

附图说明

图1.生物信息学分析发现LINC01116在肺癌中显著性高表达

1A、1B：GEO(Gene Expression Omnibus)数据库分析，LINC01116在肺癌中显著性上调；

1C：多数据集在线分析平台——lncRNAtor，在线分析发现LINC01116在肺癌中显著上调

图2.LINC01116在NSCLC组织中表达明显上调且与病人预后相关

2A：LINC01116在NSCLC组织中较正常组织明显表达上调；

2B-C：NSCLC患者的病理资料分析，LINC0116的表达水平与病人的TNM分期及肿瘤的大小呈正相关；

2D：Kaplan-Meier生存函数分析，高表达的LINC01116提示NSCLC病人的不良预后

图3.组蛋白H3K27乙酰化激活LINC01116的表达上调

3A：对5对腺癌和鳞癌组织进行ChIP实验发现：与癌旁组织相比，在癌组织中LINC01116的启动子区存在了更高丰度的H3K27乙酰化的富集

图4.LINC01116调控细胞增殖活力

4A：与正常肺粘膜上皮细胞(16HBE)相比，LINC01116在各种NSCLC细胞中表达明显上调

4B：NSCLC细胞中干扰LINC01116和过表达LINC01116，干扰序列si-LINC01116 1#和si-LINC01116 2#，以下功能缺失性实验选择1#和2#干扰序列

4C：MTT实验，敲低LINC01116能显著抑制细胞的增殖活力，过表达LINC01116后能够促进细胞的增殖活力；克隆形成实验，敲低LINC01116能显著抑制细胞的克隆形成能力，过表达LINC01116能明显促进细胞的克隆形成能力

4D：BrdU实验，敲低LINC01116能显著抑制细胞的增殖能力，过表达LINC01116后能够促进细胞的增殖能力

图5.LINC01116调控细胞周期凋亡

5A：敲低LINC01116能显著阻滞细胞周期的进程与G1-G0期，过表达LINC01116后能够促进细胞的周期的进程；

5B：敲低LINC01116之后能够明显诱导A549和NCI-H226细胞的凋亡。

图6.敲低LINC01116表达抑制NSCLC细胞活体内成瘤

6A：与对照组相比，shLINC01116敲低组的小鼠瘤体形成能力明显减弱；

6B：瘤体检测，shLINC01116敲低组小鼠的瘤体的平均重量明显低于对照组；

6C：瘤体免疫组化检测，shLINC01116封闭组小鼠的瘤体组织中的Ki-67的表达水平明显低于对照组。

图7.LINC01116可能通过影响NSCLC细胞的免疫反应从而调控细胞增殖

7A：A549细胞中敲低LINC01116后进行了转录组高通量测序；

7B：基因本体(GO)分析，发现LINC01116不仅参与肺癌细胞增殖、凋亡等生物学过程，同时发现其还主要影响肿瘤细胞免疫反应；

7C：A549和NCI-H226细胞中敲低和过表达LINC01116后，通过qPCR对测序结果进行了验证，主要选取一些跟增殖、凋亡及免疫反应相关的基因

图8.LINC01116在细胞核中能够作为“分子脚手架”同时绑定PRC2和DNMT1

8A：在A549和NCI-H226细胞中通过RIP验证发现LINC01116与PRC2有很高的绑定丰度；

细胞核质分离实验，LINC01116在细胞核和细胞质中均有分布，细胞核中相对较多点

8B：生物信息学网站在线预测了一系列跟甲基化相关(包括组蛋白甲基化和DNA甲基化)的蛋白与LINC01116的结合能力；

8C：RIP实验证实，只有DNMT1能够与LINC01116结合

8D：RNA pull down实验反方向证实LINC01116能够同时绑定EZH2和DNMT1

图9 LINC01116可同时在组蛋白甲基化和DNA甲基化水平调控基因的表达

9A：在A549和NCI-H226中敲低EZH2和DNMT1表达后，检测了一系列受LINC01116调控的靶基因的表达

9B：ChIP实验证实敲低LINC01116后能够减弱EZH2和DNMT1在受EZH2/DNMT1影响基因中的一部分基因的启动子区的绑定丰度，及H3K27三甲基化的富集丰度

9C：BSP实验证实，敲低LINC01116能够降低IRF7，CD1D，p57Kip2启动子区的DNA甲基化程度

图10 LINC01116表观抑制CD1D和IRF7的表达，促进NSCLC的免疫逃逸

10A：从人外周血中分离得到了NKT细胞

10B：流式抗体标记实验，敲低LINC01116/EZH2/DNMT1之后能够明显上调CD1D阳性表达的细胞数

10C-D：NSCLC与NKT细胞共培养杀伤实验证明，在敲低LINC01116/EZH2/DNMT1后，在体内外都能够明显增强NKT细胞对NSCLC细胞的杀伤能力

10E：GSEA分析敲低LINC01116之后IRF7的靶基因和Ⅰ型干扰素信号通路相关的基因被富集

10F：qPCR检测NSCLC组织中IRF7的表达，结果发现IRF7在癌组织中表达明显下调；

相关性分析表明LINC01116表达与IRF7表达呈负相关；

低表达的IRF7提示病人的不良预后，免疫组化也显示IRF7低表达

10G：拯救实验发现过表达LINC01116能够抑制非常明显地抑制IRF7的表达，

而共转染si-EZH2/si-DNMT1之后能够明显逆转这种抑制作用

10H：MTT实验，在A549和NCI-H226中过表达IRF7之后能够显著抑制细胞的增殖活力，

且过表达IRF7能够明显逆转LINC01116促细胞增殖的能力

图11 LINC01116能够影响Survivin的表达并与表达呈正相关

11A：在A549和NCI-H226中，Western Blot检测Survivin蛋白的表达，敲低LINC01116之后，Survivin明显下调；过表达LINC01116之后，Survivin明显上调

11B：qPCR检测100对NSCLC组织，Survivin在癌组织中表达明显上调；

相关性分析发现LINC01116表达与Survivin表达呈正相关；

高表达Survivin提示病人的不良预后；

免疫组化也显示Survivin低表达

图12 LINC01116在细胞质中通过“吸附”miR-145-5p从而促进Survivin的表达

12A：荧光素酶报告实验，发现敲低LINC01116之后并不影响Survivin启动子区的活性

12B：在A549和NCI-H226细胞中，敲低LINC01116，miR-145-5p的表达出现明显上调；过表达LINC0111，miR-145-5p的表达下调；

转染miR-145-5p mimics过表达miR-145-5p之后，LINC01116和Survivin的mRNA水平表达都明显下调；且过表达miR-145-5p后Survivin的蛋白水平也明显下调

12C：过表达miR-145-5p能够明显抑制包含LINC01116和Survivin的3’UTR的荧光素酶活性，过表达miR-145-5p并不能影响包含突变的LINC01116和突变的Survivin的3’UTR的荧光素酶活性

12D：敲低LINC01116能够直接抑制Survivin的3’UTR的荧光素酶活性

图13 LINC01116促进Survivin的表达，抑制NSCLC细胞凋亡，从而促进NSCLC细胞生存

13A：拯救实验，共转染过表达LINC01116和miR-145-5p后，miR-145-5p能够明显逆转LINC01116对于Survivin的表达促进作用

13B：MTT实验，敲低Survivin和过表达miR-145-5p都能够明显抑制A549的增殖活力，且共转染发现敲低Survivin能明显逆转LINC01116的增殖促进能力

13C：流式分析，敲低Survivin能够明显促进A549细胞凋亡；

敲低Survivin之后同时过表达LINC01116能够明显逆转敲低Survivin的凋亡促进作用

图14假设模型：由LINC01116介导的可以通过不同的方法形成一个肿瘤免疫逃逸的表型，从而促进NSCLC细胞生存

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

干扰序列如下：

SEQ ID NO:6

si-LINC01116 1# CCGCUCAGUUCAAUAUUUCAAGUGA

UCACUUGAAAUAUUGAACUGAGCGG

SEQ ID NO:7

si-LINC01116 2# AGAAGACAACUGAAUUGCUUCUAAG

CUUAGAAGCAAUUCAGUUGUCUUCU

SEQ ID NO:8

si-EZH2 GAGGUUCAGACGAGCUGAUUU

AAAUCAGCUCGUCUGAACCUC

SEQ ID NO:9

si-DNMT1 GGAAGAAGAGUUACUAUAAUUU

AAAUUAUAGUAACUCUUCUUCC

SEQ ID NO:10

shLINC01116

CACCGCCGCTCAGTTCAATATTTCAAGTGATTCAAGAGATCACTTGAAATATTGAACTGAGCGGTTTTTTG

SEQ ID NO:11

shEZH2

CACCGAGGTTCAGACGAGCTGATTTCAAGAGAATCAGCTCGTCTGAACCTCTTTTTTG

SEQ ID NO:12

shSUZ12

CACCGGAAGAAGAGTTACTATAATTTCAAGAGAATTATAGTAACTCTTCTTCCTTTTTTG

实施例1 检测LINC01116在组织和细胞中的表达情况

取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×10⁷细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入1μl溴化乙锭(EB，10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TAE缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1：4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。

Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：

实时定量PCR

NSCLC组织及癌旁组织标本，NSCLC细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。逆转录反应体系如下：

反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，

QPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：

反应条件：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^{^(-△Ct)}，△Ct＝Ct gene-Ct control。

LINC01116的引物如下：

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-AACGCTTTTGAATATGGGGAC-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-CAATCACAGAGCTCTCCTTGC-3’。

结果表明，LINC01116在NSCLC组织表达较正常组织上调(图1)。我们利用实时定量PCR技术检测了190对NSCLC组织/癌旁组织中LINC01116的表达水平。结果显示与癌旁组织相比，在90.5％(172/190)的NSCLC组织中LINC01116的表达组织明显下调(图2A)。

实施例2 表达上调的LINC01116与NSCLC患者不良预后有显著相关

进一步通过对190例NSCLC病人的病理资料分析LINC01116的表达水平与病人的病理特征之间的相关性，结果显示LINC01116的表达水平与病人的TNM分期及肿瘤的大小呈正相关(图2B和2C)。但LINC01116的表达水平与NSCLC病人的性别、年龄、吸烟史、病理分型等无相关性(表1)。

为了进一步分析LINC01116表达与NSCLC病人预后之间的关系，我们根据LINC01116表达将190例病人按照中位数分为两组，LINC01116高表达组(n＝95)和低表达组(n＝95)。Kaplan-Meier生存函数用于分析两组病人的LINC01116表达水平与NSCLC病人预后的相关性。结果显示高表达的LINC01116提示NSCLC病人的不良预后(图2D)。单因素分析结果显示病理级别，TNM分期和LINC01116的表达水平可以作为NSCLC病人的预后指标,而其他因素如性别、年龄等无统计学意义。而多因素相关分析发现LINC01116表达水平，病理级别和TNM分期都可以作为NSCLC独立的预后指标(表2)。

Table 1:The clinic-pathological factors of 190NSCLC patients

*chi-square test

*p＜0.05

**p＜0.01

Table2

Univariate and multivariate analysis of clinic pathologic factors for overall survival in 190 patients with NSCLC

＊HR hazard ratio

＊＊p＜0.01

实施例3 组蛋白H3K27乙酰化激活LINC01116的表达上调

为了探索LINC01116的高表达的调控机制，首先，我们通过利用UCSC(Genome Bioinformatics Site)(http：//genome.ucsc.edu/)对LINC01116的启动子区进行分析发现在肿瘤细胞中其启动子区存在高丰度的H3K27乙酰化富集。因为我们推测在NSCLC中H3K27乙酰化可能激活了LINC01116的表达。通过对5对腺癌和鳞癌组织进行ChIP实验发现：与癌旁组织相比，在癌组织中LINC01116的启动子区存在了更高丰度的H3K27乙酰化的富集(图3A)。因此，组蛋白H3K27乙酰化激活LINC01116的表达上调。

实施例4 LINC01116调控细胞增殖活力

为了研究LINC01116在NSCLC细胞中的生物学功能，我们首先检测了其在各种细胞系中的表达。结果发现与正常肺粘膜上皮细胞(16HBE)相比，LINC01116在各种NSCLC细胞中表达明显上调(图4A)。我们选择了相对表达较高的一株腺癌细胞株A549和一株鳞癌细胞株NCI-H226，在两株细胞中转染LINC01116的干扰序列和真核表达质粒，qPCR结果显示，与对照相比，转染LINC01116干扰序列后，LINC01116的表达明显下调，转染真核表达质粒后，A549和NCI-H226细胞中LINC01116的表达显著上调(图4B)。进一步MTT实验检测结果显示，A549和NCI-H226细胞中敲低LINC01116能显著抑制细胞的增殖活力，过表达LINC01116后能够促进细胞的增殖活力；克隆实验结果表明A549和NCI-H226敲低LINC01116能显著抑制细胞的克隆形成能力，过表达LINC01116能明显促进细胞的克隆形成能力(图4C)。BrdU实验发现A549和NCI-H226细胞中敲低LINC01116能显著抑制细胞的增殖能力，过表达LINC01116后能够促进细胞的增殖能力(图4D)。

实施例5 LINC01116调控细胞周期凋亡

将转染过的细胞按每孔一定的细胞接种于6孔板培养板，待细胞贴壁后，细胞同步化培养12h后，弃去原有培养基，给予相应处理特定时间。用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心收集细胞，PBS冲洗细胞2遍。用预冷的75％乙醇重悬细胞，并于-20℃固定过夜。离心弃去上清液，PBS洗细胞2遍。每个样本取450μl PBS重悬细胞，加入50μL的碘化丙锭(PI,0.5mg/ml)，混匀后置于37℃水浴箱30min。离心弃去上清液，PBS重悬细胞，上流式细胞仪(BD公司，型号：FACS Calibur)测量细胞周期分布并分析结果。

将转染过的细胞按每孔一定的细胞接种于6孔板培养板，待细胞贴壁后，弃去原有培养基，给予不同处理相应时间。用不含EDTA的胰酶消化细胞，4℃，1500rpm离心5min。弃上清液，加入预冷的PBS洗2次。小心吸尽细胞沉淀上残留的PBS，涡旋振荡30s，使细胞成均匀悬浮液。加入200μl含钙离子的结合缓冲液，再加入10μl Annexin V-FITC荧光探针，轻轻振荡混匀，冰上避光孵育30min。加入5μl的碘化丙锭(PI)于细胞液中，涡旋振荡混匀，冰上避光孵育5min。加入400μl结合缓冲液，涡旋振荡混匀后，用300目尼龙网过滤，上流式细胞仪利用FL1和FL3双通道波长检测并分析。

我们想进一步确定LINC01116调控细胞增殖是不是通过影响了NSCLC细胞的周期和凋亡能力。流式细胞术分析发现在A549和NCI-H226细胞中敲低LINC01116能显著阻滞细胞周期的进程与G1-G0期，过表达LINC01116后能够促进细胞的周期的进程(图5A)。凋亡分析发现敲低LINC01116之后能够明显诱导A549和NCI-H226细胞的凋亡(图5B)。

实施例6 敲低LINC01116表达抑制NSCLC细胞活体内成瘤

4周龄雄性裸鼠BALB/c小鼠，购自南京大学模式动物中心；培养A549细胞，分别LINC01116的小干扰质粒sh-LINC01116或空载体；细胞转染后48小时，胰酶消化，PBS洗两遍，重新悬浮在无血清培养基中，并计数。2组细胞均取1×107个细胞悬浮在0.1ml无血清DMEM培养基中，尾静脉注射建立实验性肺成瘤模型。注射细胞20天后处死裸鼠，取肺部组织标本，观察肉眼可见的瘤体大小，并拍照。以上所有的实验程序都是按着NIH1996年版的动物实验指导来执行的。用全价颗粒饲料喂养小鼠，自由饮水，室温(22±2)℃，湿度50～60％，通风良好，12:12h光照/黑暗周期。所有实验均经过南京医科大学动物保护和伦理委员会(IACUC)批准。

取小鼠肺组织用预冷的PBS冲洗后浸泡于4％多聚甲醛固定16h以上；组织水化：自甲醛中取出标本，放在特制铁筐中，并用自来水持续轻微冲淋2h；组织脱水：30％酒精中浸泡5min；50％酒精中浸泡10min；70％酒精中浸泡20min；80％酒精中浸泡30min；90％酒精中浸泡30min；95％酒精Ⅰ中浸泡30min；95％酒精Ⅱ中浸泡30min；100％酒精Ⅰ中浸泡10-20min；100％酒精Ⅱ中浸泡20-40min；(具体时间随组织块时期及大小而异，胚胎组织及小组织块时间要短)。组织透明：酒精/二甲苯1:1中，浸泡30分钟；二甲苯Ⅰ中浸泡20-30min；二甲苯Ⅱ中浸泡20-30min；石蜡/二甲苯1:1中浸泡30min；石蜡1中浸泡60min；石蜡2中浸泡60min；石蜡3中浸泡30min。石蜡包埋：将模具按需要摆放在干净的玻璃板上，倒入融化完全的石蜡液，马上把组织块从石蜡3中镊出，浸入模块中，室温下14h后待蜡干透。

处理载玻片，载玻片酸缸浸泡过夜、洗涤剂、去离子水依次清洗，架于铁架上烘干晾凉待用配制明胶处理液：0.75％gelatine(明胶)，0.005％chrome ablum(硫酸铬钾)将架于铁架上待处理玻片在溶液中浸泡1min，将玻片放37℃温箱，过夜。用特制烙铁铜片融化蜡块一面，并将蜡液滴在蜡浸过的特制木块表面，迅速将蜡块粘于木块上，将木块固定在石蜡切片机上连续切片(5μm连续切片，用于相临切片免疫组织化学检测；5μm切片，用于免疫荧光组织化学检测)；用沾水毛笔粘取需要的切片，顺其卷折方向浸入盛有清水的不锈钢盆中，蜡片即自然舒展，然后将明胶处理过的载玻片浸入水中，令舒展开的蜡片部分自然贴上，用毛笔帮助轻轻将将切片卷折处刷开，小心的铺于玻片上；将载玻片到事先已预热好的展片机热水(50℃左右)中浸一下(不能久，蜡片会化)，蜡片即自然充分舒展铺于玻片上；将载玻片放于46℃左右(不能超过50℃)的烤片机中过夜。次日收集玻片即可。

二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯5min→二甲5min→100％乙醇2min→95％乙醇2min→90％乙醇2min→85％乙醇2min→80％乙醇2min→70％乙醇2min→50％乙醇2min→30％乙醇2min→苏木精染色5min→ddH2O冲洗5min→弱氨水5s→ddH2O 2min→30％乙醇2min→50％乙醇2min→70％乙醇2min→80％乙醇2min→85％乙醇2min→85％乙醇30min→90％乙醇2min→95％乙醇，伊红染色10min→95％乙醇2min→100％乙醇2min→100％乙醇2min→二甲苯5min-二甲苯5min。中性树胶封片，晾干，即可显微镜下观察组织病理改变情况

为了进一步验证LINC01116对NSCLC细胞瘤体形成能力的影响，我们首先构建了LINC01116的小干扰质粒sh-LINC01116，然后通过G418的方法筛选了稳转细胞株，皮下注射4周龄大的雄性BALB/c裸鼠，待4天后瘤体形成后，每2天记录一次不同组的小鼠的瘤体大小，瘤体形成16天后处死小鼠，取瘤体，拍照记录及量取瘤体的大小，并称其重量统计两组差异。统计结果显示，与对照组相比，LINC01116敲低组的小鼠瘤体形成能力明显减弱(图6A)；同时瘤体检测结果显示，LINC01116敲低组小鼠的瘤体的平均重量明显低于对照组(图6B)。将瘤体进行免疫组化检测结果显示LINC01116封闭组小鼠的瘤体组织中的Ki-67的表达水平明显低于对照组小鼠组织中的表达水平(图6C)。

实施例7 LINC01116可能通过影响NSCLC细胞的免疫反应从而调控细胞增殖

转录组测序实验

在A549细胞中敲低LINC01116 48h后，分别在对照组和干扰组细胞中加入500ulTrizol，放置10min；加入100μL氯仿，剧烈震动15s，室温静置5min，4℃、12,000g离心10min，将上清转移到一新的1.5ml离心管中；(不用振荡器涡旋，手握用力摇动)。加入等体积的氯仿，剧烈震动15s，室温静置5min，4℃、12,000g离心10min，将上清转移到一新的1.5mL离心管中；(不用振荡器涡旋，手握用力摇动)。加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min以上，4℃、12,000g离心20min，弃除上清。加入1ml预冷的75％乙醇，将沉淀弹起，洗涤沉淀，4℃、12,000g离心5min，弃除上清。重复上一步(加入1mL预冷的75％乙醇，将沉淀弹起，洗涤沉淀，4℃、12000g离心5min，弃除上清)。微离心，吸除剩余的乙醇，室温干燥10min。加入30-50μl RNase-Free水，溶解RNA，-80℃保存。

RNA的质检：

打开Agilent 2200机器，打开软件；装入相应的R6K Agilent ScreenTape，排枪装入16个Loading枪头；取出一个8联管，按顺序分别加入4μL R6K Sample Buffer与1μLRNA样品；混匀后离心收集混合液，72℃3min，冰上2min；离心收集管壁溶液，然后放入Agilent 2200样品板上；点击Start开始质检。

文库构建：

转录组RNA片段化：poly(A)RNA的获取；RNA片段化；片段RNA纯化构建文库：RNA加接头；反转录；cDNA纯化；cDNA扩增；扩增产物纯化。文库质检：打开Agilent 2200机器，打开软件；装入相应的D6K Agilent ScreenTape，排枪装入16个Loading枪头；取出一个8连管，在第一管中加入3μLD1K Ladder，在剩余的管中分别加入3μLD1K Sample Buffer和1μL cDNA样品，涡旋混匀5s；离心收集管壁溶液，然后放入Agilent 2200样品板上；点击Start开始质检。

测序模板准备：

文库的稀释；乳滴PCR；珠子的清洗；阳性珠子的富集

上机测序：

清洗测序仪；测序仪初始化；芯片上样。

为了进一步探讨LINC01116促进肺癌恶性进展的分子机制，我们首先在A549细胞中敲低LINC01116后进行了转录组高通量测序(图7A)。结果发现差异两倍以上的mRNA共有942个基因，对测序结果进行基因本体(GO)分析，发现LINC01116不仅参与肺癌细胞增殖、凋亡等生物学过程，同时意外发现其还主要影响肿瘤细胞免疫反应(图7B)，包括Ⅰ型干扰素介导的信号通路,免疫识别,抗原提呈等过程。这里面包括与干扰素信号通路密切相关的基因，包括IRF7，IRF9，IFI6，IFI16，IFI44，IFIT1，IFIH1，OAS1，RIG-1，ISG15，MX1，MX2和GBP1等。CD1D，NKT细胞识别杀伤的唯一靶点，也被诱导。增殖指标Survivin,PCNA被抑制。随后在A549和NCI-H226细胞株中敲低和过表达LINC01116后，通过实时定量PCR对测序结果进行了验证,主要选取一些跟增殖,凋亡及免疫反应相关的基因(图7C和7D)。

实施例8 LINC01116在细胞核中能够作为“分子脚手架”同时绑定PRC2和DNMT1

为深入探讨LINC01116调控肺癌细胞增殖和免疫反应的分子机制，我们首先检索文献发现：LINC01116，也被命名为LINC-MTX2，长度为1058nt,首次被Khalil等人报道。他们通过RIP-Chip技术在多种细胞系中鉴定出大约≈20％的LncRNAs能够绑定PRC2蛋白复合体，其中包括LINC01116。但是对于LINC01116的功能角色尚无研究报道。PRC2是一种起重要调控作用的表观抑制复合物，主要组分包括EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)，SUZ12(Suppressor of zeste 12 homolog)等，主要机制是通过组蛋白甲基化抑制靶基因的转录。EZH2是PRC2的核心催化亚基，在使靶基因沉默的过程中，EZH2主通过介导靶基因启动子区H3组蛋白赖氨酸27位点三甲基化(H3K27me3)。而且EZH2在肿瘤中的异常高表达参与了多种肿瘤的发生发展。Khalil等人在人正常足成纤维细胞中通过RIP验证其LINC01116能否与PRC2结合，结果却是阴性的。接下来我们在A549和NCI-H226细胞中通过RIP验证发现LINC01116与PRC2有很高的绑定丰度(图8A)。进一步细胞核质分离实验发现LINC01116在细胞核和细胞质中均有分布，细胞核中相对较多点(图8A)。而既往的研究表明组蛋白甲基化和DNA甲基化是可以协同作用抑制基因表达。而近来研究表明了lncRNAs是可以作为“分子脚手架”同时绑定多个蛋白分子而发挥调控功能。基于此，我们假设LINC01116也可能作为“分子脚手架”绑定多个蛋白介导甲基化的调控。为验证这一假设，首先我们通过生物信息学网站在线预测了一系列跟甲基化相关(包括组蛋白甲基化和DNA甲基化)的蛋白与LINC01116的结合能力，主要包括WDR5(H3K4me3)，LSD1(H3K4me3)，SETDB1(H3K9me3)，SUV39H1(H3K9me3)，DNMT1，DNMT3a，and DNMT3b(http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/references.php)。结果显示，LINC01116均可能与这几种甲基化修饰酶结合(图8B)。接着通过RIP实验证实了这一系列蛋白与LINC01116能否结合，结果显示，只有DNMT1能够与LINC01116结合(图8C)。然后进一步通过RNA pull down实验反方向证实LINC01116能够同时绑定EZH2和DNMT1(图8D)。为了进一步研究LINC01116与EZH2，DNMT1结合的具体序列区域，通过一系列缺失定位实验，体外转录技术获得不同区域的LINC01116的RNA片段(200nt为一段)，然后进行RNA pull down实验，LINC01116的1-200nt的核苷酸片段可以绑定EZH2，而800-1058nt的区域是绑定DNMT1的有效区域(图8E)。EZH2和DNMT1在LINC01116上存在不同的绑定区域序列表明LINC01116可作为一个“分子桥梁”来同时绑定EZH2和DNMT1。通过蛋白的Co-IP实验证实，EZH2可以和DNMT1直接结合，并且敲低LINC01116之后能够明显减弱这种绑定关系(图8F)。以上这些实验证实LINC01116在细胞核中能够作为“分子脚手架”同时绑定PRC2和DNMT1。

实施例9 LINC01116可同时在组蛋白甲基化和DNA甲基化水平调控基因的表达

随后，为了检测LINC01116是否与EZH2，DNMT1对靶基因具有共调控的作用，我们在A549和NCI-H226中敲低EZH2和DNMT1表达后，检测了一系列受LINC01116调控的靶基因的表达。结果发现大部分基因，都可以被诱导表达(图9A)。而且通过查阅文献发现，这些基因在肿瘤中的低表达很多都与其启动子区的超甲基化有关。进一步通过ChIP实验证实敲低LINC01116后能够减弱EZH2和DNMT1在受EZH2/DNMT1影响基因中的一部分基因的启动子区的绑定丰度，及H3K27三甲基化的富集丰度(图9B)。且通过BSP实验证实敲低LINC01116能够降低IRF7，CD1D，p57Kip2启动子区的DNA甲基化程度，这三个基因启动子区都存在大量的CpG岛(图9C)。

结论

综上所述，在细胞核中，LINCO1116通过表观抑制IRF7和CD1D的表达而避免NKT细胞的识别和杀伤，从而促进细胞增殖。在细胞质中，LINC01116通过“吸附”miR-145-5p而促进Survivin的表达，导致NSCLC凋亡抵抗而促进细胞生存(图14)。因此，LINC01116通过降低肺癌细胞的免疫原性，部分解释了肺癌细胞形成免疫逃逸的亚型，可能成为NSCLC的诊断和治疗靶点，为临床提供依据。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 一种长非编码RNA及其在诊断/治疗非小细胞肺癌中的应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1058

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggaaatga cccgaactgc cagcctgcgc ctttgcagcc ggccctcgct ttgctgaaga 60

cgagcagctc ccaccaaagt cttgcctccc cttaccccga aagccccgct cagttcaata 120

tttcaagtga aaatctgcct gttcgaaaag aaaatattca caaatgagca gtgtattaga 180

agacaactga attgcttcta agaatgggtc tcactctgcc atcacccagg ctggagtgtg 240

gtggcaccat catggctcac tgcagccttg aactcctgag ctcaagtcat cctcccacct 300

cagccttccg agtagctgga actgcaggtg tgagccacca tgcctggctg atttgtcttt 360

ttaaattttt tatagagacc gagtctcaac tatattgtcc aggctggaaa agaacttctt 420

tccctccaag tgataacctt ttccagacaa gtcagcttaa aaactgaccc aaaggccctg 480

aagtacacag ttttcttgga gaaagaaaaa aataagtgaa aaggacttgc tgacttgcta 540

attcattttg gggcctgtgg gtaacatcag aatggcaaag cacttggggc ttttttctaa 600

tttgtatttt tttaatcttc tgagaaatga cttttatatg ccaagattca ttccatgatt 660

agtttttatg accaagttat gaacgctttt gaatatgggg acctagaata gaaatgctaa 720

cctacctgca aggagagctc tgtgattggc atccccatca tgctgtaact gacacaaaat 780

aaacttaggg taattgccgc atagtgtaac tttaatgtgt gagcatactg taacatctga 840

caagcttctt gatctagatc agcaatgtgt aacccattca ttgttgtcac tctcaacaag 900

gccttatggt caaacatcat cactctcact aaagagatag tttactgaaa tatactgaga 960

ttttgaaact ggagtcaaga ggtagcacac tgttttatgt tgatccattt aatggtcctt 1020

gacagccaat aaaaagacac tggaagaata cgtgaatg 1058

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacgcttttg aatatgggga c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caatcacaga gctctccttg c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agccacatcg ctcagacac 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcccaatacg accaaatcc 19

<210> 6

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgcucaguu caauauuuca agugaucacu ugaaauauug aacugagcgg 50

<210> 7

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

agaagacaac ugaauugcuu cuaagcuuag aagcaauuca guugucuucu 50

<210> 8

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

gagguucaga cgagcugauu uaaaucagcu cgucugaacc uc 42

<210> 9

<211> 44

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggaagaagag uuacuauaau uuaaauuaua guaacucuuc uucc 44

<210> 10

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caccgccgct cagttcaata tttcaagtga ttcaagagat cacttgaaat attgaactga 60

gcggtttttt g 71

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caccgaggtt cagacgagct gatttcaaga gaatcagctc gtctgaacct cttttttg 58

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caccggaaga agagttacta taatttcaag agaattatag taactcttct tccttttttg 60