一种分离纯化霞水母毒素蛋白的方法与流程

本发明涉及海洋生物技术领域，具体涉及一种分离纯化霞水母毒素蛋白的方法。

背景技术：

水母是一种胶质状的浮游动物，主要包括四大类群：刺胞动物门的水螅水母类、管水母类、钵水母类以及栉水母门的栉水母类。水母种类繁多，分布广泛，世界上已记录的水母种类大约有1000种左右，其中我国海域已知的约有400种。近年来，全球范围水母暴发经常发生，造成众多游泳者、海员等涉海人员被蜇伤，轻者皮肤出现皮疹、红肿、瘙痒，令被蜇伤者痛苦不堪，重者昏厥、休克甚至死亡。而水母之所以能够给人们带来如此大的危害，最主要的原因是：存在于水母触手上的刺丝囊细胞内含有大量的水母毒素。水母毒素主要是蛋白类物质，其中包含多种具有不同生物活性的毒素蛋白，如溶血活性、酶活性、抗氧化活性、致死毒性、心脏血管毒性、肝脏毒性等，而水母毒素作为一类结构新颖的蛋白，为开发新型的海洋药物提供了重要的先导化合物。

但是，到目前为止对水母毒素的研究主要集中在水母毒素粗提取物层面，其主要原因有以下几方面：第一，水母粗毒素中含有许多种蛋白组分，其中某些组分之间的性质非常相近，水母毒素的分离纯化难度大；第二，水母毒素是蛋白类物质，具有热敏感性，容易受到温度等环境因素的影响而致使其活性降低甚至丧失，这就造成在分离纯化过程中很难保持其活性。第三，水母种类的不同，其生理结构以及体内所含的毒素成分和活性也存在较大的差异，这就致使不同种类水母毒素的分离纯化工作难以直接效仿，只能通过繁杂的实验摸索才能获得。所以，水母毒素的分离纯化工作具有很大的难度和创新性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种分离纯化霞水母毒素蛋白的方法。

本发明实现目的的方案如下：

一种分离纯化霞水母毒素蛋白的方法，其特征在于：

1）将霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后2～6℃离心，收集上清液，待用；

2）将上述步骤1）上清液用微孔滤膜过滤，然后用脱盐柱进行脱盐，收集脱盐后溶液，待用；

3）将步骤2）所得脱盐后溶液，而后用含Q Sepharose HP的阴离子交换树脂分离，分离时依次采用Tris-HCl缓冲液和含NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，对各洗脱峰进行活性检测，然后收集活性成分，冷冻干燥待用；

4）将步骤3）得到的冻干的活性成分用蒸馏水溶解，然后采用凝胶过滤色谱Superdex75进行进一步纯化，采用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，活性检测后收集活性成分。

优选的；所述步骤1）霞水母刺丝囊细胞制备方法为：将置于-80～-20℃低温的霞水母触手于2～6℃自溶12～48h，自溶后利用20～60 目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2～6℃下10000～15000g 离心5～20min，收集下层沉淀，2～6℃冷冻干燥即得。

优选的；所述步骤1）将霞水母刺丝囊细胞加入pH7.8，浓度10～30mM 的2～6℃下预冷Tris-HCl缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200～400kw下破碎20～60min中，工作/ 间隙为5s/30s。

优选的；所述步骤2）微孔滤膜孔径为0.22-0.45μm。

优选的；所述步骤2）中将上述步骤1）上清液用微孔滤膜过滤，然后上SephadexG25脱盐柱，洗脱液为pH7.8，10～30mM Tris-HCl流速为2～5mLmin^-1，收集脱盐后样品溶液，待用。

优选的；所述步骤3）中将步骤2）所得脱盐后溶液，而后用含Q Sepharose HP的阴离子交换树脂分离，分离时依次采用pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl缓冲液和含1MNaCl的pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为1～3mLmin^-1。

优选的；所述步骤4）中Tris-HCl缓冲液的pH7.8，浓度为10～30mM，洗脱时流速为0.5～1mLmin^-1。

本发明的优点：

1）本发明提供了一种从霞水母中分离纯化毒素蛋白的方法，为水母毒素蛋白的纯化及深入研究提供了重要方法指导。

2）本发明采用SephadexG25脱盐柱、Q Sepharose HP的阴离子交换柱和Superdex75凝胶柱分离毒素蛋白，具有简便、流速快、分辨率高、分离纯化的毒素蛋白纯度高等特点，最终得到具有较强生物活性的水母毒素蛋白，且该毒素蛋白对草鱼表现出很强的毒性作用，其最低致死量为1.61μg毒素蛋白/g.草鱼。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的SephadexG25脱盐柱进行脱盐的层析图；

图2为本发明实施例2提供的Q Sepharose HP的阴离子交换柱进行纯化的层析图；

图3为本发明实施例2提供的Superdex75凝胶柱进行纯化的层析图。

具体实施方式

霞水母毒素蛋白的提取方法：

1）将1kg 冰冻的霞水母触手于2℃下自溶过夜后，利用20 目的标准分样筛滤去触手残片，然后取上清液并在10000g、4℃下冷冻高速离心20min 并收集下层沉淀，用0.154mol/LNaCl溶液的生理盐水于2℃反复洗涤3 次至上层液澄清，并将刺丝囊细胞沉淀冷冻干燥后，-20℃下冷冻保存备用。

2）取上述霞水母刺丝囊细胞0.5g 和在2℃下预冷的20mLpH7.810mM Tris-HCl缓冲液置于烧杯中，在冰浴下用超声波功率为200kw 下破碎30min 中，工作/ 间隙为5s/30s。破碎完毕后在4℃下，10000g 离心20min，上清液即为霞水母刺丝囊细胞毒素，并用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白为标准，测定上清液中霞水母刺丝囊细胞毒素的蛋白浓度。

实施例1

1）SephadexG25脱盐柱进行脱盐：

①上样前样品的预处理：将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4℃下采用0.22μm滤膜过滤，收集过滤液待用；

②上样和洗脱：将上述处理好的样品上SephadexG25脱盐柱(2.6×10cm)，洗脱液为pH7.8，10mM Tris-HCl流速为2mLmin^-1，收集脱盐后样品溶液。

2）Q Sepharose HP的阴离子交换柱纯化：

取上述脱盐后样品上Q Sepharose HP的阴离子交换柱（1.6×10cm）进行纯化，依次采用pH7.8 10mM Tris-HCl缓冲液和含1MNaCl的 pH7.8 10mMTris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速1mLmin^-1，对各洗脱峰进行毒性检测，收集活性成分。

3）Superdex75凝胶柱纯化

①取上述纯化获得的活性组分上Superdex75凝胶柱(1.6×60cm)进行纯化，采用pH7.8 10mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.5mLmin^-1，对各洗脱峰进行毒性检测，收集活性成分。

②毒性检测：实验组是用微量注射器向草鱼（0.6±0.02g）尾部分别注射5μL的各出峰处洗脱液，然后观察草鱼的行为及生存状况，同时分别向草鱼尾部注射5μL pH7.8 10mM Tris-HCl缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组均用5条草鱼平行实验，注射量为1.61μg毒素蛋白/g.草鱼时，实验组草鱼出现死亡现象，其中毒素蛋白浓度的测定方法采用Bradford 法，利用BSA 做标准曲线。

实施例2

1）SephadexG25脱盐柱进行脱盐：

①上样前样品的预处理：将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4℃下采用0.45μm滤膜过滤，收集过滤液待用；

②上样和洗脱：将上述处理好的样品上SephadexG25脱盐柱(2.6×10cm)，洗脱液为pH7.8，20mM Tris-HCl流速为3mLmin^-1，收集脱盐后样品溶液（参见图1），图1中实线（—）是紫外280nm的吸收，阴影部分代表霞水母毒素蛋白；虚线（----）是电导率，代表盐组分，通过图1可明显看出，霞水母毒素蛋白和盐已实现完全分离，说明脱盐效果很好。

2）Q Sepharose HP的阴离子交换柱纯化

取上述脱盐后样品上Q Sepharose HP的阴离子交换柱（1.6×10cm）进行纯化，依次采用pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液和含1MNaCl的 pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速2mLmin^-1，对各洗脱峰进行毒性检测，收集活性成分（参见图2），图2中实线（—）是紫外280nm的吸收，阴影部分代表通过毒性检测分析得到的具有较强毒性的霞水母毒素蛋白，通过图2可明显看出，Q Sepharose HP的阴离子交换柱对霞水母毒素蛋白与其他多数蛋白已实现分离，达到了较好的纯化效果。

3）Superdex75凝胶柱纯化

①取上述纯化获得的活性组分上Superdex75凝胶柱(1.6×60cm)进行纯化，采用pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为0.8mLmin^-1，对各洗脱峰进行毒性检测，收集活性成分（参见图3），图3中实线（—）是紫外280nm的吸收，阴影部分代表通过毒性检测分析得到的具有较强毒性的霞水母毒素蛋白，通过图3可明显看出，Superdex75凝胶柱已对霞水母毒素蛋白与其他蛋白已实现分离，达到了最终纯化效果。

②毒性检测：实验组是用微量注射器向草鱼（0.6±0.02g）尾部分别注射10μL的各出峰处洗脱液，然后观察草鱼的行为及生存状况，同时分别向草鱼尾部注射10μL pH7.8 20mM Tris-HCl缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组均用5条草鱼平行实验，注射量为3.22μg毒素蛋白/g.草鱼时，实验组3条草鱼死亡，其中毒素蛋白浓度的测定方法采用Bradford 法，利用BSA 做标准曲线。

实施例3

1）SephadexG25脱盐柱进行脱盐：

①上样前样品的预处理：将提取到的霞水母刺丝囊毒素于4℃下采用0.45μm滤膜过滤，收集过滤液待用；

②上样和洗脱：将上述处理好的样品上SephadexG25脱盐柱(2.6×10cm)，洗脱液为pH7.8，30mM Tris-HCl流速为5mLmin^-1，收集脱盐后样品溶液。

2）Q Sepharose HP的阴离子交换柱纯化

取上述脱盐后样品上Q Sepharose HP阴离子交换柱（1.6×10cm）进行纯化，依次采用pH7.8 30mM Tris-HCl缓冲液和含1MNaCl的 pH7.8 30mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速3mLmin^-1，对各洗脱峰进行毒性检测，收集活性成分。

3）Superdex75凝胶柱纯化

①取上述纯化获得的活性组分上Superdex75凝胶柱(1.6×60cm)进行纯化，采用pH7.8 30mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为1mLmin^-1，对各洗脱峰进行毒性检测，收集活性成分。

②毒性检测：实验组是用微量注射器向草鱼（0.6±0.02g）尾部分别注射20μL的各出峰处洗脱液，然后观察草鱼的行为及生存状况，同时分别向草鱼尾部注射20μL pH7.8 30mM Tris-HCl缓冲液作为空白对照。其中实验组和对照组均用5条草鱼平行实验，注射量为4.83μg毒素蛋白/g.草鱼时，实验组草鱼全部死亡，其中毒素蛋白浓度的测定方法采用Bradford 法，利用BSA 做标准曲线。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。