一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基及其应用和成脂分化方法与流程

本发明涉及医学领域，具体的说是涉及一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基及其应用和成脂分化方法。

背景技术：

骨骼肌肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)是成年动物或人肌肉组织中特有的间充质干细胞。作为中胚层起源的一种成体间充质干细胞具有自我更新能力和多项分化的潜能，可在体外分化为血细胞、骨细胞、内皮细胞、神经细胞等系的细胞。骨骼肌干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，骨骼肌干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。

MDSCs具有潜在多向分化的干细胞特性，它不仅可以分化为肌肉组织细胞，还可以横向分化为其他谱系的细胞。在地塞米松和胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤等诱导下分化为脂肪细胞。脂肪细胞作为美容修复软组织缺损具有可塑性强、可适应不同缺损形状的优势。MDSCs的成脂诱导潜能，可使其成为美容修复软组织缺损的干细胞来源。

目前尚未有专门针对骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的相关内容，中国专利CN104830757A公开了一种间充质干细胞成脂诱导分化培养基，其以DMEM/F12为基础培养基，其中包含FBS、谷氨酰胺、抗生素、吲哚美辛、胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和盐酸法舒地尔；中国专利CN105462917A公开了一种牙周膜干细胞成脂分化诱导液，其同样以DMEM/F12为基础培养基，其中包含FBS、PRP、吲哚美辛、胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)；虽然上述的诱导培养基都是可以诱导间充质干细胞成脂分化，但是不同来源的干细胞之间由于微环境的差异，需要自己适宜的诱导分化环境，而现有的这些培养基在成脂分化率方面较低，并不是适合骨骼肌肌源性干细胞成脂分化。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基及其应用和成脂分化方法，使得所述培养基能够显著提升骨骼肌肌源性干细胞成脂分化率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基，在基础培养基中包含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、吡格列酮和FBS。

针对现有间充质干细胞成脂分化培养基在诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化时分化率较低的问题，本发明调整培养基组分，加入了吡格列酮替换现有培养基中的盐酸法舒地尔、谷氨酰胺以及PRP等组分，达到了较高成脂分化率。

其中，作为优选，所述培养基在基础培养基中包含0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5-15μM吡格列酮、体积分数10％的FBS。

同时，在本发明具体实施方式中培养基可选择如下任意一项：

(1)在基础培养基中包含0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、体积分数10％的FBS；

(2)在基础培养基中包含0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、体积分数10％的FBS；

(3)在基础培养基中包含0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、体积分数10％的FBS；

作为优选，所述基础培养基为高糖DMEM培养基。

由于本发明培养基能够显著提高骨骼肌肌源性干细胞成脂分化率，故本发明提出了所述培养基在诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化和/或制备诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化培养基中的应用。

此外，本发明还提供了一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的方法，将骨骼肌肌源性干细胞接种至本发明所述培养基中诱导分化。

其中，所述诱导分化为在5％二氧化碳、37℃下诱导分化21天；所述骨骼肌肌源性干细胞的接种密度优选为2×10⁴cells/mL；

所述骨骼肌肌源性干细胞可按照本领域常规方法提取获得，在本发明中是按照如下方法制备：

将肌肉组织剪成碎块并清洗，然后加入2倍的体积的混合酶，包括2.4u/mL Dispase II、1％I型胶原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混匀后置37℃恒温摇床中消化60min左右，直到试管中的肌肉碎块消化为肌糜，肉眼看不到肌块；消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清；加入2～3倍体积的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀后置37℃恒温摇床中消化15min，消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清；加入PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清；加入3倍肌糜体积的PBS反复吹打后经200目滤网过滤，收集的滤液1000r/min离心5min，弃上清；含20％FBS的DMEM/F12重悬细胞，采用差速贴壁分离技术对MDSCs进行分离，然后进行正常培养、传代。

所述差速贴壁分离技术具体如下：

将细胞悬液接种于25ml培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，期间根据细胞的生长情况进行换液。PP6培养3天后换液，以后每2-3天换液，倒置显微镜下观察记录细胞生长以及形成集落后每日扩增情况，待细胞生长融合至70-80％后传代培养。

传代方法可参照如下：

MDSCs原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×10⁴cells/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。

按照本发明所述成脂分化方法对骨骼肌肌源性干细胞进行分化，最终份成脂分化率在55％以上，最高可达到84％左右，而作为对照的现有诱导分化方法的分化率均未超过40％，两者相比具有显著性差异。同时，检测成脂细胞标志性基因PPARγ-2、LPL表达水平，结果显示，本发明方法分化的成脂细胞PPARγ-2、LPL表达水平远高于对照方法分化的成脂细胞。

由以上技术方案可知，本发明优化诱导分化培养基组分，以吡格列酮替换现有间充质干细胞中的常用组分，实现了骨骼肌肌源性干细胞成脂分化率的显著提高效果。

附图说明

图1所示为MDSCs P2代40倍形态图；

图2所示为MDSCs P2代100倍形态图；

图3所示为对照组1油红O染色图；

图4所示为对照组2油红O染色图；

图5所示为对照组3油红O染色图；

图6所示为对照组4油红O染色图；

图7所示为实验组1油红O染色图；

图8所示为实验组2油红O染色图；

图9所示为实验组3油红O染色图；

图10所示为各组成脂分化率柱形图；

图11所示为各组PPARγ-2表达水平柱形图；

图12所示为各组LPL表达水平柱形图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基及其应用和成脂分化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明产品和应用已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的培养基和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种诱导骨骼肌肌源性干细胞成脂分化的培养基及其应用和成脂分化方法做进一步说明。

实施例1：MDSCs原代分离和纯化、传代培养及鉴定

1、取材

取成人正常颞肌标本(取自于开颅手术患者，患者知情并自愿，标本采集通过正规医院进行，并且不影响患者身体健康)，用含双抗的PBS缓冲液冲洗后转入无菌培养皿中，用眼科剪剪成1mm³左右大小的碎块，然后移入50mL离心管中，PBS缓冲液吹打冲洗3次，静置1分钟后弃上层液及漂浮组织。

2、酶解

向上述获得的肌肉碎块加入2倍的体积的混合酶，包括2.4u/mL Dispase II、1％I型胶原酶，2.5mmol/L CaCl₂，混匀后置37℃恒温摇床中消化60min左右，直到试管中的肌肉碎块消化为肌糜，肉眼看不到肌块。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入2～3倍体积的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀后置37℃恒温摇床中消化15min，消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清。加入约3倍肌糜体积的PBS反复吹打后经200目滤网过滤，收集的滤液1000r/min离心5min，弃上清。生长培养基(含20％FBS的DMEM/F12)重悬细胞。

3、分离与纯化

采用差速贴壁分离技术对MDSCs进行分离。将细胞悬液接种于25ml培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，期间根据细胞的生长情况进行换液。PP6培养3天后换液，以后每2-3天换液，倒置显微镜下观察记录细胞生长以及形成集落后每日扩增情况，待细胞生长融合至70-80％后传代培养。

4、MDSCs的传代培养

MDSCs原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×10⁴cells/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。

5、MDSCs的鉴定

细胞爬片制作：将无菌盖玻片放置于6孔培养板中，对数生长期细胞制备成细胞悬液，按5×10⁴cells/mL密度接种于6孔培养板中，每孔2mL，生长培养基为含20％FBS的DMEM/F12，培养24-48小时，使细胞生长于盖玻片上。

Desmin、Sca-1免疫细胞化学染色:将放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加一抗兔抗人结蛋白(Desmin)抗体(1:200稀释)、兔抗人Sca-1抗体(1:100稀释)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在镜下观察，以胞膜和/或胞浆内出现棕黄色颗粒判定为阳性，将阳性的细胞用于后续诱导分化试验(MDSCs P2代形态图见图1和图2)。

实施例2：本发明所述成脂分化的方法

1、培养基

(1)在高糖DMEM培养基中包含0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、体积分数10％的FBS；

(2)在高糖DMEM培养基中包含0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、体积分数10％的FBS；

(3)在高糖DMEM培养基中包含0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、体积分数10％的FBS；

2、诱导分化方法

取第3代MDSCs，按2×10⁴cells/mL密度接种于6孔培养板内，培养至细胞达到80％融合以上时，采用实施例3中各组成脂诱导液，诱导分化培养21d后对细胞进行油红O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表达检测。

实施例3：成脂分化对比试验

为了验证本发明成脂分化诱导的效果，同时设置4组对照组和3组实验组，对实验组和对照组进行油红O染色及成脂基因PPARγ-2和LPL表达检测。

对照组1为阴性对照组，为常规培养组，使用的培养液为：含体积分数10％FBS的高糖DMEM培养液。

对照组2为阳性对照组，为常规间充质干细胞成脂诱导配方，使用的成脂诱导液为0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。

对照组3为阳性对照组，参考CN105462917A中使用的成脂诱导液，配方为：0.1mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、体积分数5％PRP、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。

对照组4为阳性对照组，参考CN104830757A使用的成脂诱导液，配方为：1μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、100nM胰岛素、200μM吲哚美辛、10nM地塞米松、0.1μM盐酸法舒地尔、体积分数1％谷氨酰胺、体积分数1％抗生素、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。

实验组1中使用的成脂诱导液为：0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、5μM吡格列酮、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。

实验组2中使用的成脂诱导液为：0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、10μM吡格列酮、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。

实验组3中使用的成脂诱导液为：0.1mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/L胰岛素、0.1mM吲哚美辛、1μM地塞米松、15μM吡格列酮、体积分数10％FBS，余量为高糖DMEM培养液。

1、油红O染色

取第3代MDSCs，按2×10⁴cells/mL密度接种于6孔培养板内，培养至细胞达到80％融合以上时，采用上述各组成脂诱导液，诱导分化培养21d对细胞进行油红O染色。染色的具体方法为：

弃培养液，用PBS清洗细胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定15-20min；吸弃多聚甲醛，PBS清洗3次；加入油红O染色液，室温染色15-20min。结束后吸弃残液，用37℃预热的去离子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置显微镜下观察并采集图像，各组细胞染色效果如图3-9。有染色结果可以大致看出，在本发明培养基诱导下，成脂细胞数量相对于对照组数量较多。

同时，对油红O染色的细胞进行计数，计算出各组的分化率进行比较。倒置显微镜100倍放大视野下，每孔随机记数3个视野，计算分化细胞占细胞总数的比例，每次平行计数3个孔，计算平均数。

诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。

各组诱导分化率结果如表1所示，对应柱形图如图10所示。

表1诱导分化率结果

注：*，※表示P﹤0.01。

结果显示培养21d后，对照组1为阴性对照组，不含诱导因子，不对细胞进行成脂分化诱导，因此没有着色，成脂分化率为零。实验组1、3与各对照组均有显著性差异(P﹤0.01，*)；实验组2与其他各组均有显著性差异(P﹤0.01，※)；实验组2中的成脂分化率均值为84.06±1.52％，是常规诱导分化组(对照组2)的2.65倍，是CN105462917A和CN104830757A中使用的两种配方的2倍以上。说明本发明所示的成脂分化诱导液对MDSCs成脂分化诱导的效果最好。

2、PPARγ-2和LPL的表达检测

按照实验组或对照组方法对MDSCs进行培养或成脂分化诱导，连续诱导培养14d和21d后对细胞进行PPARγ-2和LPL的表达检测。

按TRIzol试剂盒说明书进行细胞总RNA提取；M-MLV反转录试剂盒获得cDNA。按SYBR Green定量PCR试剂盒说明书对PPARγ-2、LPL表达水平进行检测。以GAPDH作为内参基因。以2^-△△Ct法进行定量分析。结果如图11和12所示。

实验结果表明，细胞诱导培养14d、21d后，在同一时间点，各诱导组与未诱导组(阴性对照组)比较，成脂细胞标志性基因PPARγ-2、LPL表达水平均有极显著性差异(*，P﹤0.01)，实验组1、3与各对照组比较，均有极显著性差异(※，p﹤0.01)，实验组2与其他各诱导组均有极显著性差异(**，p﹤0.01)。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。