一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法与流程

本发明属于生物医药与疾病免疫领域，更具体地讲，涉及一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法。

背景技术：

自1940年代发现青霉素以来，抗生素的广泛使用让人们摆脱了细菌性感染带来的恐惧。但随着抗生素的长期使用以及滥用，刺激了病原微生物耐药性的产生。耐药性结核杆菌、MRSA等对人类和动物的危害日趋严重，对社会造成了惨重的经济损失。新型抗生素的筛选进展也因为细菌的耐药性而变得愈加困难。

在合成抗生素发展缓慢的情况下，如何克服因抗生素引起的细菌耐药性问题是当前研究的热点。研究发现，有的生物在受到微生物感染后，会迅速产生一些具有抗菌活性的小分子物质——抗菌肽参与机体免疫。随后科学家们又陆续从植物、微生物、两栖动物、昆虫、哺乳动物乃至人体内鉴定出上千种抗菌肽，说明它几乎是所有生命物种都具有的重要免疫分子。这类抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌细胞等生物活性，从氨基酸组成、合成机制和作用机制等方面都与传统的微生物(细菌、真菌和链霉菌等)产生的抗生素完全不同。因此，抗菌肽作为一种生物来源的、核糖体合成的小分子肽，在新型抗菌剂开发领域具有毋庸置疑的潜在优势，逐渐成为生物医药学科的研究热点[1]。人们积极探索抗菌肽的药用价值，希望开发出替代传统抗生素的新型抗菌剂，为解决病原菌对抗生素逐渐产生的耐药性问题提供新途径。

1972年瑞典科学家Boman H.G.领导的研究小组，通过将大肠杆菌注射到惜古比天蚕蛹中，在诱导的天蚕免疫血淋巴中发现并提纯得到了抗菌肽P9A和P9B。通过氨基酸序列测序分析，确定了此类抗菌肽的一级结构，并将之命名为天蚕素(cecropins)，这也是人类发现并得到的第一个抗菌肽。

抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMPs)由10～50个氨基酸构成，是生物先天性非特异性防御系统的重要组成部分。AMPs具有广谱抗菌活性、高效性、稳定性等特点，对细菌、真菌甚至是艾滋病病毒和癌细胞也具有很强的抑制作用。此外，由于它们的作用靶点主要位于微生物的细胞膜上，诱导微生物细胞膜去极化，导致细胞破裂，因此，不易引起微生物抗性突变产生，是替代传统抗生素的有力候选者之一。

目前，人们主要通过三种方法获得目的抗菌肽:(1)生物提取，(2)化学合成，(3)利用基因工程手段表达，它们各有优缺点。

(1)生物提取的抗菌肽

生物体内诱导产生抗菌肽，其缺点是含量低、难度大、效率低、对技术和成本要求高，难以实现规模化生产，且对于一些高等生物和人源抗菌肽的生产来说也不现实。

(2)化学合成的抗菌肽

随着对多肽和蛋白质化学结构的进一步深入研究和多肽合成技术的诞生，人工合成活性肽的方法为抗菌肽的研究提供了很大便利。许多研究结果表明，化学合成的AMPs表现出与天然AMPs相同的生物学活性，但化学合成方法同样面临着成本高昂的问题，限制了抗菌肽的广泛应用。

(3)基因工程表达的抗菌肽

对大量抗菌肽分子结构的分析和比较后人们发现，计算机辅助设计新型抗菌肽并利用基因工程技术制备是新药开发的一个重要手段。抗菌肽分子量小，化学结构简单，抗菌谱广，无抗生素抗性，免疫反应性低，便于合成，这些优点有利于人们利用计算机软件对抗菌机理进行测试分析和修饰改造。

基因工程技术的飞速发展使抗菌肽大规模制备成为可能，但目前也存在着许多问题。通过基因工程技术在细菌中表达抗菌肽分子量小，表达的产物可能对宿主有害，进而对基因的高水平表达造成不良影响。如何有效降低抗菌肽表达产物对宿主菌的毒性，提高表达效率，是抗菌肽利用基因工程表达亟待解决的问题。在宿主菌融合表达中，亲和层析的应用最为广泛。传统的亲和层析是将亲和标签在DNA水平上与目的蛋白序列融合。然后将细胞破碎液通过亲和柱，分离得到目的蛋白。但层析技术所使用的亲和介质昂贵，且常需通过蛋白酶水解作用将亲和标签从融合蛋白上除去。就工业应用而言，亲和标签的去除是蛋白生产过程中花费最昂贵的一步。外源物的添加还可能影响目的蛋白的生物活性。此外，抗菌肽分子量小，容易降解，进一步降低了回收率，使多肽生产的成本大幅提高。因此，亟需我们开发新型的抗菌肽表达纯化体系，为工业化制备抗菌肽奠定基础。

类弹性蛋白(Elastin-like polypeptides,ELPs)是一种从基因水平改编的人造生物聚合物，它是广泛存在于脊椎动物结缔组织中的弹性蛋白(elastins)的衍生物。类弹性蛋白由一个重复的五肽单位Val–Pro–Gly–Xaa–Gly构成，其中Xaa可以是除脯氨酸以外的任意氨基酸。而将功能性目的蛋白N-端或C-端与ELP融合后的体系则被称为ELPylation。

(1)类弹性蛋白(ELPs)的结构与理化性质

ELPs是以Val–Pro–Gly–Xaa–Gly(VPGXG)五肽为单位而组成的聚合体，是弹性蛋白的衍生物。其中，Xaa又叫客残基“guest residue”，它可以是除脯氨酸(Pro)外的其他氨基酸，因为脯氨酸会破坏相变。文献中也是根据第四位氨基酸的种类和出现的次数对ELPs进行分类的。为了使特定ELP的结构标注显得简洁并标准，有人提出了如下的表示形式：[XiYjZk]n

X，Y，Z——每个字母表示出现在五聚体第四位的氨基酸；

i，j，k——表示第四位氨基酸出现在五聚体单位中的比率；

n——表示所给出的ELP五聚体的总个数。

ELPs属于三类热敏生物聚合物中的一种，其性质随环境温度的的变化而改变。水溶性的ELPs具有较低临界溶解温度，即当温度高于所谓的相变温度时，ELPs在温度变化较窄范围内(2～3℃)由可溶状态变为聚沉状态，此过程称为凝聚作用。Meyer将相变温度Tt定义为：当升高溶液温度使ELP发生凝聚致溶液混浊度增加到初始值一半时的温度值为相变温度。当溶液温度低于Tt时，游离的聚合物链呈无序的水合状态(可溶形式)；当溶液温度高于Tt时，聚合物链呈现出更加有序的结构(β-螺旋)，通过疏水相互作用而变得稳定，同时分子内的β-结构也加强了聚合链之间的结合能力。

然而上述过程是可逆的，当环境温度降低时ELP也会从凝聚状态转变成可溶形态。有趣的是，即使将ELP与其他蛋白融合，这种与温度相关的相变可逆性质仍然存在。G和L蛋白与ELP结构域融合，发现其在一定温度范围内仍相变可逆。ELPs的Tt值取决于几个因素。如溶液中ELP的浓度、溶液的离子强度、盐浓度和聚合物的分子质量，此外融合蛋白的性质也对Tt值有一定影响。随着这些参数值的升高，Tt降低。对于一个给定的生物聚合体而言，单体第四位上氨基酸的不同也对Tt值有影响。当这个位置的氨基酸属于疏水基团时，Tt较低；反之为亲水基团时，Tt值升高(影响取决于特殊残基的摩尔比率)。通过改变五肽单位的第四位残基，可设计得到理想的Tt值。如果第四位的氨基酸残基易受到电离作用的影响，那么可以通过改变pH值对Tt值进行调节；而当氨基酸带有能进行化学反应的侧链时，可将其他分子与ELP偶联。

(2)内含肽来源与结构和功能

1990年，Hirata的研究小组与Kane的小组分别在编码酿酒酵母空泡膜H⁺-ATP酶的VMA1基因中发现了一个框内插入片段，并出现在前体mRNA中，随Vmal蛋白一起翻译，而在翻译后被切除。因其与RNA内含子从前体mRNA上剪切下来的过程类似，所以这一自我切除的过程叫做蛋白质的剪接。被切下来的那段多肽命名为内含肽。因此，内含肽是嵌入在宿主蛋白内部的蛋白元件，具有自我剪接(self-splicing)的能力，又叫蛋白剪接元件。发生自我剪接反应时，内含肽从宿主蛋白中自我切除，同时促使两边的外显肽通过侧链连接成一个完整的蛋白并恢复宿主基因的功能。内含肽的切除是一个翻译后的过程，不需要酶或辅因子的辅助。蛋白质的自剪接仅包含四步分子内反应，其中只涉及了内含肽和外显肽的一小部分关键催化残基。自1999年12月以来，已经有100多种内含肽被鉴定并收录于InBase数据库(http://www.neb.com/neb/inteins.html)。

从结构上可将内含肽分为两类：1)在两个剪接区域含有归巢内切酶的大分子内含肽；2)缺失归巢内切酶的mini-内含肽。最近人们又新发现了一种可进行反式-剪接的内含肽。归巢内切酶是存在于特定位点的双链DNA内切酶，它在重组-依赖性的过程中通过侧翼序列促进自身编码区域基因组间的横向迁移，这个过程被叫做“归巢”。通常情况下，归巢内切酶由一个包含内含子或内含肽的开放阅读框编码而来。大分子内含肽是双功能蛋白，内有一个蛋白剪接区和一个中心内切酶区域。Chong等将大分子内含肽中的中心内切酶区域删除，构建了具有高效剪接功能的mini-内含肽，证明内切酶区域不参与蛋白的剪接作用。剪接区被内切酶区分成N-端和C-端两个子域，在N-端子域含A、N2、B和N4氨基酸保守区，而在C-端子域有G和F保守区。这些区域也存在于mini-内含肽中。天然的mini-内含肽和人工构建的mini-内含肽在三维结构上类似。现已知的内含肽在序列上相似性程度低，仅在N-端和C-端序列高度保守。多数内含肽残基以Ser或Cys开头，His-Asn或His-Gln结尾。

内含肽的剪接是一个快速的四步亲和进攻反应，由四个保守的剪接功能残基介导：(1)内含肽N-端第一个残基N-O(丝氨酸,Ser)或N-S酰基(半胱氨酸，Cys)发生转移，在N-外显肽和内含肽功能域之间形成一个(硫)酯键。(2)(硫)酯键受到C-外显肽第一个残基(Cys，Ser或Thr)OH-或SH-群的攻击，使N-外显肽的与C-外显肽第一个残基侧链发生酯交换反应。(3)内含肽C-端保守氨基酸残基Asn发生环化作用使内含肽释放出来，同时两侧的外显肽通过(硫)酯键连接起来。(4)连接两外显肽的(硫)酯键发生重排，S-N或O-N酰基转换形成一个肽键。

(3)内含肽的自切割作用与应用

天然内含肽可在体内发生自我剪接作用(splicing)，而利用基因工程手段对天然内含肽的N-端或C-端保守氨基酸序列进行突变则可控制其只在C-端或N-端进行自切割反应。如果只想在N-端切割，则将天然内含肽的末端残基突变，避免剪接机制的第(3)步发生(同时也终止了第(4)步)。而前两步仍可发生，使酯键自发水解将N-端外显肽从内含肽上切割开。反之，突变内含肽的第一个残基，则剪接机制的(1)(2)(4)步都不发生，而第(3)步仍继续，从而使外显肽从C-端切割下来。利用此特性，可将具有自切割能力的基因工程内含肽与各种蛋白纯化标签融合，介导其蛋白的纯化作用。

经改造的内含肽可分为两类：pH-诱导的C-端自切割内含肽和硫醇-诱导的N-/C-端自切割内含肽。pH-诱导的内含肽只需要调节缓冲液的pH即可诱导切割反应，所以是最经济的体系。其中，New England Biolabs(NEB)公司开发的pTWIN1和pTWIN2质粒中携带的Ssp DnaB内含肽是目前发表最多的pH-诱导自切割内含肽。另一pH-诱导的内含肽是Branki等人通过工程改造、遗传筛选的突变mini-内含肽△I-CM，它来源于Mut RecA，现已成功和非亲和层析标签如ELP、PHB等结合用于蛋白纯化。pH和温度诱导的内含肽缺点是有蛋白可能在被回收和纯化前，在体内发生自我切割。但体内切割程度可通过低温表达(12-15℃)限制到最低。

硫醇-诱导内含肽中报道最多的是来源于酿酒酵母的Sce VMA内含肽，可从商业途径获得，可作为IMPACT Kit与CBD亲和标签联用。N-端的切割反应可用强亲核试剂如2-巯基乙烷、磺酸钠、羟胺、苯硫酚、β-巯基乙醇、DTT或游离的半胱氨酸诱导，其中最常用的是DTT。使用硫醇-诱导内含肽的优点是在体内几乎不发生自切割反应，此外，pH和温度诱导的内含肽对硫醇不敏感，且价格便宜，适于大规模生产。缺点是硫醇诱导可能会破坏目的蛋白的二硫键。

内含肽在生物技术领域具有广泛的应用价值。内含肽的天然剪接活性可用于蛋白和多肽的连接，又叫做内含肽介导的蛋白连接作用(IPL)或者表达蛋白的连接作用(EPL)，在分子生物学和生物技术方法学的应用上已较完善。此外，内含肽也被广泛用于NMR分析中蛋白质的分段标记、蛋白质环化、毒性蛋白的控制表达、蛋白与量子点的共轭、生物分离等方面。在基础研究中，研究人员用内含肽监测体内蛋白与蛋白之间的相互作用，或者用来改变蛋白进入细胞器的位置。生物技术应用中的大多数内含肽都来源于原核微生物，或者是工程改造的酿酒酵母VMA1-内含肽的变体。

Thomas等将甲烷杆菌mini-内含肽(Mth RIR1，intein)应用于蛋白的连接作用。Mini-内含肽含134个氨基酸残基。与内含肽N-端半胱氨酸相邻有一个脯氨酸Pro^-1-Cys¹，在天然状态下，发现其在大肠杆菌中的剪接效率很低。当脯氨酸突变成丙氨酸时，内含肽的剪接(splicing)效率增加。而将内含肽C-端的精氨酸或N-端的半胱氨酸突变为丙氨酸时，突变体会在N-或C-端表现出高效的切割作用(cleavage)。将mini-内含肽C-端/N-端进行突变Asn¹³⁴-Ala/Cys¹-Ala，并与CBD融合，另一端和MBP或T4连接酶融合，形成MBP-intein(N)-CBD和CBD-intein(C)-T4DNA ligase三联体，用大肠杆菌进行表达，破碎细胞后利用CBD提取蛋白，最后将两种三联体蛋白在一定条件下混合，通过两者自身的多肽键反应将MBP和T4ligase连接起来。实验表明此mini-内含肽具有自剪接的能力，且它独特的性质扩展了基于内含肽介导的方法在体外细菌表达大分子融合蛋白连接中的应用。

Wu等利用pH-诱导的△I-CM内含肽对含二硫键的人源抗体片段、麦芽糖结合蛋白和β-半乳糖苷酶进行了表达与纯化。他们将目标蛋白从基因水平上融合到带几丁质结合域的自切割内含肽标签上，通过几丁质-琼脂糖亲和柱层析纯化。纯化后的目标蛋白仍然留在层析柱上，然后在室温下改变pH8.5到pH6.0-6.5，可直接将切割的目的蛋白洗脱下来。实验证实CBD-内含肽纯化方法可得到良好的产率和产品纯度，且产品活性较好。

(4)Titin/Z1Z2-Telethonin复合物蛋白支架及用途

Titin又叫肌联蛋白，是目前发现的单基因编码的最大蛋白，分子量约3-3.7MDa，长约1μm，约占肌节的一半，它是高度弹性的分子，在维持肌肉肌节的完整性方面起着重要作用。Titin普遍存在于心肌和骨骼肌中，被称为第三肌丝，具有复杂的生物力学性质和生物化学功能，是近年来分子生物学和临床医学研究的热点。Titin由300个重复的区域串联组成，主要包括免疫球蛋白(Ig)和纤连蛋白III型区域，PEVK(富含脯氨酸，谷氨酸，缬氨酸和赖氨酸)韧性区以及几个其他独特的区域。研究发现删除包括激酶区域的Titin C-端，会损坏肌原纤维，导致肌肉疾病如肌无力的发生。

Telethonin也被成为TCAP，在人源中由TCAP基因编码，在心肌和骨骼肌的Z-线中表达，其功能是调节肌节的组装、T-小管功能和细胞凋亡。Telethonin包含了167个氨基酸残基，分子量为19KDa。研究发现它与几种疾病的发生有关，包括肌带型营养不良症，肥厚心肌病，扩张型心肌病和特发性心肌病等。Telethonin具有独特的β-折叠结构，从而使其与心脏和骨骼肌的肌联蛋白Titin的Z1Z2域呈反向平行的关系。

研究发现，Titin的N-端是由两个免疫球蛋白区域Z1和Z2组成，而Z1Z2则紧紧地与Telethonin相结合。化学键研究显示，后者与Titin的复合物Z1Z2高度特异性结合，与两者的单体却不产生作用。对Telethonin进行生物化学方面的研究表明，Telethonin与Z1Z2复合物的结合作用是刺激肌肉生长的必要条件。Morten Bertz等研究发现，Titin-Telethonin之间的裂解力高达700pN，远远超过了从Titin测得的其他所有Ig区域。Titin-telethonin复合物完美的将巨肌蛋白牢牢锚定在Z-线上。邹培建等通过X-ray晶体学手段揭示了巨肌蛋白Titin的氨基酸残基如何与Telethonin组装成反向平行的2:1三明治结构。邹通过体内蛋白相互作用试验，和体外的荧光共振能量转移，证实了其独特的结构(如图1)。不仅如此，邹还从此结构中受到启发，设计了以Titin/Z1Z2-Telethonin蛋白质复合物为药物载体作为蛋白质药物研发的平台，称为ZT技术。对Titin/Z1Z2-Telethonin的研究发现，此复合物的大小在56KDa左右，可通过原核宿主表达制备。且来源为人源，免疫原性低，分子之间结合力牢，超级稳定；作为载体，可极大地提高蛋白质、多肽药物的半衰期和稳定性，是潜在的蛋白药物开发载体。

本发明受上述前期基础研究的启发，在基因工程手段制备抗菌肽等一系列活性蛋白多肽的基础上，利用特殊的融合蛋白标签——具有自切割功能的内含肽(intein)、条件性相变的类弹性蛋白(ELPs)和具有多连接点的ZT复合物(Titin/Z1Z2-Telethonin)组合和优化，并将其作为整体应用于制备抗菌肽等生物活性蛋白质中，避免直接表达抗菌肽对宿主造成的毒性问题；避免传统的亲和层析纯化方法，节约成本，利用支架的强结合力，高溶解性和稳定性等优点，为工业化大规模制备抗菌肽等活性蛋白多肽创造了条件。特别是本技术还具有一定的通用性，可广泛应用于多种生物活性蛋白多肽的高效制备和稳定利用，从而大大克服了多肽制备和利用中普遍存在的瓶颈问题。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法。

本发明的第二个目的在于提供利用基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法制备获得的生物活性小肽的应用。

本发明的第三个目的在于提供基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法制备获得的生物活性小肽。

为实现以上目的，本发明公开以下技术方案：一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)ELPs介导的C-intein融合LfcinB重组质粒的构建：构建以大肠杆菌为宿主的牛乳铁素高效融合表达体系，将pET-22b-EI载体插入通过重叠PCR构建的LfcinB，构建pET-22b-EI-LfcinB，利用ELPs可逆相变的特性在C-Inteins介导的蛋白自剪切作用下得到不含外源氨基酸残基的LfcinB；

(2)根据Titin蛋白和Telethonin蛋白的特性，分别与LfcinB串连，构建pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒，以大肠杆菌为宿主制备Titin-LfcinB、Telethonin-LfcinB两种融合抗菌肽，Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB摩尔量比为1-4:1-4的比例将两者单体混合后，制备得到ZT-LfcinB，其中1-4个单体串联或并联稳定利用相耦合在一起，并利用Native SDS-PAGE分析显示组装成功。

作为一个优选方案，Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB的摩尔量比为2:1。

作为一个优选方案，EI-LfcinB的优化表达条件为，当IPTG的诱导浓度为1mM，诱导温度为25℃，诱导表达时间为24h时，目的蛋白可得到最佳表达。

作为一个优选方案，内含肽自剪切所采用的切割缓冲液为预冷的含NaCl(1-3M)cleaving buffer。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法制备获得的生物活性小肽在制备抗菌或抗病毒药物中的应用。

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法制备获得的生物活性小肽。

本发明具体分为以下三个部分：

(1)含可自剪切功能的内含肽、可相变的类弹力蛋白和蛋白支架多肽Titin/Z1Z2-Telethonin的表达载体设计和构建

构建以大肠杆菌为宿主的牛乳铁素高效融合表达体系，利用实验室已有的pET-22b-EI载体，分别插入通过重叠PCR构建的LfcinB，以及基因合成的2LfcinB、4LfcinB两种多拷贝的串联子片段，成功构建pET-22b-EI-LfcinB、pET-22b-EI-2LfcinB、pET-22b-EI-4LfcinB三种表达质粒。对以上三种形式的融合抗菌肽进行表达，利用ELPs可逆相变的特性在C-Inteins介导的蛋白自剪切作用下得到不含外源氨基酸残基的LfcinB。根据Titin蛋白和Telethonin蛋白的特性，分别与LfcinB串连，构建pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒，以大肠杆菌为宿主制备Titin-LfcinB、Telethonin-LfcinB两种融合抗菌肽，通过一定比例进行组装制备ZT-LfcinB融合抗菌肽。

(2)活性小分子多肽的无纯化标签表达和温控相变分离纯化及活性检测

本发明利用ELPs具有温度依赖的相变循环(ITC)特性，可作为蛋白质的纯化工具，替代传统亲和层析技术，节约工艺成本。温度和pH依赖型的C-Inteins内含肽可以介导目的蛋白的自剪切作用使目的蛋白分离，避免了引入蛋白酶或其他试剂所造成的干扰，简化了蛋白分离步骤和成本。以ELPs介导的Intein多肽融合表达方式，使抗菌肽在胞内呈无活性状态，避免了其对宿主细胞的抑制作用；表达产物利用琼脂平板抑菌圈法和MIC测定重组抗菌肽的活性。且步骤简单方便，节约时间以及纯化成本，是工业规模放大的热点。

(3)利用Titin和Telethonin分别与目标多肽串联提高抗菌肽的稳定性利用。通过重叠PCR构建出Titin-LfcinB和Telethonin-LfcinB基因，并成功构建了pET-24a-Titin-LfcinB、pET-24a-Telethonin-LfcinB两种表达质粒。对目的蛋白进行表达后发现，Titin-LfcinB为上清表达，共有244aa，分子量约为26KDa，可使用镍柱亲和层析方法对融合多肽进行分离纯化。对蛋白纯化条件进行探索后发现，最佳咪唑洗脱浓度为400mM，且纯度较高，产率为1.27mg/100ml发酵菌液。Telethonin-LfcinB为包涵体表达，共有156aa，分子量约为17.8KDa。通过包涵体洗涤缓冲液洗涤三次即可得到纯度较高的融合多肽，尿素梯度透析复性后，超滤浓缩，产率为907.9μg/100ml发酵液。按照摩尔质量Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB＝2:1的比例将两者单体混合后，制备得到ZT-LfcinB，Native SDS-PAGE分析显示组装成功。由于Telethonin-LfcinB在组装的过程中非常容易形成沉淀，因此会残留少量Titin-LfcinB融合蛋白单体存在于上清中，这为利用原核宿主表达稳定活性的抗菌肽奠定基础。

本发明的优点在于：本发明提出了一种通过自剪切与蛋白支架相组合的生物活性小肽制备及其利用技术。本发明在基因工程手段制备抗菌肽的基础上，利用类弹力蛋白(Elastin-like polypeptides，ELPs)介导的内涵肽(Intein)自剪切特性，构建以大肠杆菌为宿主的生物活性小肽稳定高效融合表达体系，并将蛋白支架ZT技术运用于抗菌肽的原核表达，对ZT融合表达的生物活性小肽稳定性、多效性和高效利用创制了条件。将表达、纯化和稳定利用相耦合在一起，使整个小肽从构建在表达载体到体外组装成带有稳定支架的药物，是一个整体流程，较好地克服了某些蛋白质及小肽表达生产和利用效率普遍较低的实际问题。这一技术为克服目前以抗菌肽为代表的生物活性小肽在基因工程研究方面存在的表达效率低、稳定性差、对宿主产生毒性、稳定性差、分子量小和利用的半衰期短等缺点提供新的途径和选择。同时该发明具有一定的通用性和实用性，利用该组合技术所制备的生物活性小肽，应用领域不局限于抗菌和抗病毒等感染性疾病，其应用对象不限于人类，还可用于动物。

附图说明

图1为Titin/Z1Z2-Telethonin复合物示意图。

图2为pET-22b-EI-LfcinB重组质粒图谱。

图3为ET-22b-EI-2LfcinB重组转化子菌落PCR，M:500DL Marker；1-6：单菌落菌液PCR；7：阴性对照。

图4为pET-22b-EI-4LfcinB重组转化子菌落PCR验证，M:500DL Marker；1-9：单菌落菌液PCR；10：阴性对照。

图5为pET-22b-EI-4LfcinB重组质粒构建示意图。

图6为ITC技术纯化EI-LfcinB蛋白12％SDS-PAGE，M:蛋白marker；1：细胞破碎后沉淀；2：第一次ITC后上清；3：加入预冷cleaving buffer后离心沉淀；4:第二次ITC后沉淀EI-LfcinB。

图7为重组LfcinB蛋白Tricine-SDS-PAGE，M：蛋白marker；1：重组LfcinB。

图8为IPTG诱导浓度优化SDS-PAGE，M:低分子量蛋白marker；1：0.2mM IPTG；2：0.4mM IPTG；3：0.6mM IPTG；4：0.8mM IPTG；5：1.0mM IPTG。

图9为IPTG诱导温度优化SDS-PAGE，M:低分子量marker；1：37℃；2：30℃；3：25℃；4：20℃；5：16℃。

图10为IPTG诱导时间优化SDS-PAGE，M：低分子量蛋白marker；1：诱导6h；2：诱导18h；3：诱导24h；4：诱导32h；5：诱导48h。

图11为ITC技术纯化EI-2LfcinB/EI-4LfcinB蛋白12％SDS-PAGE，M：蛋白marker；1/1’：诱导前细胞裂解液；2/2’：诱导后细胞裂解液；3/3’：第一次ITC沉淀。

图12为加入重组LfcinB后细菌生长曲线测定，A.金黄色葡萄球菌生长曲线；B.大肠杆菌生长曲线。

图13为重组LfcinB的抑菌活性检测，a.LfcinB抗金黄色葡萄球菌抑菌圈。1：重组LfcinB浓度112μg/ml；2：重组LfcinB浓度56μg/ml；3：重组LfcinB浓度28μg/ml；4：重组LfcinB浓度14μg/ml；5：阳性对照AMP 10μg/ml。b.LfcinB抗大肠杆菌抑菌圈。1：重组LfcinB浓度112μg/ml；2：重组LfcinB浓度56μg/ml；3：重组LfcinB浓度28μg/ml；4：重组LfcinB浓度14μg/ml；5：阳性对照AMP 10μg/ml。

图14重组LfcinB的MIC测定，A.LfcinB对金黄色葡萄球菌的MIC；B.LfcinB对大肠杆菌的MIC。

图15 Titin-LfcinB基因PCR扩增，M:DL2000DNA maker；1:Titin-LfcinB第一次PCR；2:Titin-LfcinB第二次PCR。

图16 pET-24a-Titin-LfcinB重组质粒图谱。

图17 Telethonin-LfcinB基因PCR扩增，M:DL2000DNA maker；1:Telethonin第一次PCR；2:Telethonin第二次PCR。

图18转化子菌液PCR扩增结果，M:2000bp Marker；1-7:单克隆转化子。

图19 pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒图谱。

图20 Bradford法测定蛋白浓度标准曲线。

图21 Titin-LfcinB蛋白15％SDS-PAGE，M：蛋白maker；1：诱导前；2：导后菌液；3：破碎液离心上清；4：离心沉淀；5：镍柱流穿液；6：400mM咪唑流穿液；7：400mM咪唑洗脱液；8：超滤后浓缩液。

图22 Telethonin-LfcinB蛋白15％SDS-PAGE，M：蛋白maker；1：诱导后菌液；2：10000rpm离心上清；3：第一次包涵体洗涤液；4：第二次包涵体洗涤液；5：包涵体变性溶解溶液。

图23 ZT-LfcinB蛋白15％Native SDS-PAGE，M：蛋白maker；1：ZT-LfcinB 4℃组合48h；2：Telethonin-LfcinB；3：超滤浓缩Titin-LfcinB。

图24 ZT-LfcinB的抑菌活性检测，ZT-LfcinB抗大肠杆菌抑菌圈。1：实验组ZT-LfcinB 500μg/ml；2：阳性对照AMP 5μg/ml；3：阳性对照AMP 10μg/ml ZT-LfcinB抗金黄色葡萄球菌抑菌圈。1-3：实验组ZT-LfcinB 500μg/ml；4：阴性对照组ddH2O；5：阳性对照AMP 5μg/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中的定量试验，均设置三次或三次以上重复实验，结果取平均值。

实施例1.ELPs介导的C-intein融合LfcinB重组质粒的构建

利用实验室已有的pET-22b-EI-mCherry质粒，通过限制性内切酶将原有的mCherry基因切除，替换上PCR扩增或全基因合成的lfcinb、2lfcinb和4lfcinb基因，构建了pET-22b-EI-LfcinB、ET-22b-EI-2LfcinB、pET-22b-EI-4LfcinB三种重组表达质粒。核酸电泳验证和测序结果显示，重组质粒构建成功。

3LfcinB基因序列:由于LfcinB的长度只有75bp，25个氨基酸残基，其氨基酸序列为FKCRRWQW RMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：1)，因此可以直接设计两个较长引物，利用重叠PCR得到目的基因。其引物设计如下:

LfcinB-F：

CAGCGTGTACACAACATGTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGBsrGI(SEQ ID NO：2)

LfcinB-R：

CCCAAGCTTTTACCATGGAAAGGCACGACGCACACAGGTGATAGACGHindIII(SEQ ID NO：3)

2LfcinB氨基酸序列和基因序列

氨基酸序列：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：4)

基因序列：

TGTACACAACTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTTAAAAGCTT(SEQ ID NO：5)

4LfcinB氨基酸序列和基因序列:氨基酸序列：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)-FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)-FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NNNNN(linker)-FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(SEQ ID NO：6)

基因序列：

TGTACACAACTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTTAACAACAACAACAATTTCAAATGCCGTCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCTCCGTCTATCACCTGTGTGCGTCGTGCCTTT TAAAAGCTT(SEQ ID NO：7)

表1.引物

pET-22b-EI-LfcinB重组质粒的构建

LfcinB重叠PCR扩增：设计LfcinB-F和LfcinB-R两个长引物，C-端有20bp重叠序列，通过退火将两引物通过重叠部分结合起来，延伸得到LfcinB基因全长。电泳结果显示，在80-100bp处出现条带，与预期结果相符，扩增成功。

pET-22b-EI-2LfcinB重组质粒的构建：将全基因合成的含有2LfcinB的质粒pUC57-2LfcinB转入大肠杆菌DH5α感受态进行培养，挑取单克隆转化子扩增，提取质粒。用相应的限制性内切酶BsrGI和HindIII双酶切，通过3％琼脂糖凝胶电泳得到2LfcinB的目的基因单一条带，随后通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因片段，与线性化的质粒pET-22b-EI进行过夜连接。连接产物转化感受态DH5α，铺平板培养后，挑取单克隆子进行菌液PCR，随后进行3％琼脂糖凝胶电泳。结果如图3所示。挑取1-2号菌液送睿迪生物技术公司测序显示，目的基因2LfcinB已正确连接到载体上，pET-22b-EI-2LfcinB重组质粒构建成功。

pET-22b-EI-4LfcinB重组质粒的构建：将全集因合成的含有4LfcinB的质粒pUC57-4LfcinB转入大肠杆菌DH5α感受态进行培养。挑取单克隆转化子扩增，提取质粒，用相应的限制性内切酶BsrGI和HindIII双酶切。通过2％琼脂糖凝胶电泳得到4LfcinB的目的基因单一条带，随后通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因，与线性化的质粒pET-22b-EI进行过夜连接。连接产物转感受态细胞DH5α，铺平板培养后，挑取单克隆子进行菌液PCR，随后进行2％琼脂糖凝胶电泳。结果如图4所示。

挑取5-9号菌液送睿迪生物技术公司测序显示，目的基因4LfcinB已正确连接到载体上，pET-22b-EI-4LfcinB重组质粒构建成功。图5为构建成功的重组质粒谱。

实施例2.EI-LfcinB的表达和纯化

EI-LfcinB的表达：在对目的蛋白的表达条件进行摸索后，发现EI-LfcinB、EI-2LfcinB、EI-4LfcinB三种重组蛋白中只有EI-LfcinB得到了有效的表达，而EI-2LfcinB、EI-4LfcinB导入到两种不同的表达宿主中都不能得到表达。因此，只对EI-LfcinB的表达条件进行了摸索，并成功纯化出了LfcinB抗菌肽。EI-LfcinB的表达与纯化结果如图6所示。

由图6可看出EI-LfcinB在E.coli BL21(DE3)中得到了表达，通过两次ITC循环可以得到融合蛋白EI-LfcinB，大小在67KD左右。但是这种方法也存在一些不足，由图可看到通过ITC纯化后的融合蛋白中仍有少量杂蛋白存在。

重组LfcinB的纯化：将得到的融合蛋白EI-LfcinB在自剪切缓冲液中22℃水浴16h，收集上清，Tricine-SDS-PAGE结果显示获得了纯度>95％的重组LfcinB抗菌肽。双缩脲法测定重组LfcinB的浓度为2mg/100ml发酵液。

虽然使用EI标签进行两次ITC后没有得到较纯的融合蛋白，目的蛋白下方仍会出现杂带，但由图7可知，在进行Intein自剪切反应后，通过ITC可以将杂带完全除去。而目的多肽LfcinB分子量很小，则可以留在上清中。由此可得到高纯度的重组抗菌肽。

实施例4.EI-LfcinB诱导表达条件的优化与纯化

为了提高EI-LfcinB的产量，我们对pET-22b-EI-LfcinB/E.coli BL21(DE3)的表达条件进行了探索和优化，结果如下所示。

(1)EI-LfcinB加入IPTG浓度优化

设计了五个实验组，恒温摇床中37℃，200rpm培养2-3h，待OD₆₀₀达到约0.5后分别向每组试管中加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mM的IPTG，转至20℃诱导表达24h。直接收集菌体进行SDS-PAGE，结果图8显示当IPTG的诱导浓度为1.0mM时，EI-LfcinB的表达量最高。

(2)EI-LfcinB加入IPTG诱导表达温度优化

设计了五个实验组，恒温摇床中37℃，200rpm培养2-3h，待OD₆₀₀达到约0.5后加入终浓度为1.0mM的IPTG，然后将5支试管分别放入37℃、30℃、25℃、20℃、16℃诱导表达24h。直接收集菌体进行SDS-PAGE，结果图9显示当温度在25℃时，EI-LfcinB的表达量最高。

(3)EI-LfcinB表达时间优化

设计了五个实验组，恒温摇床中37℃，200rpm培养2-3h，待OD₆₀₀达到约0.5后加入终浓度为1.0mM的IPTG，然后将5支试管置于25℃诱导表达6h、18h、24h、32h、48h。直接收集菌体进行SDS-PAGE，结果图10显示当表达时间为24h时，EI-LfcinB的表达量最高。

综上所述，对EI-LfcinB的表达条件进行优化后可知，当IPTG的诱导浓度为1mM，诱导温度为25℃，诱导表达时间为24h时，目的蛋白可得到最佳表达。

(4)EI-2LfcinB和EI-4LfcinB的表达纯化

由SDS-PAGE结果分析图11可知，虽然EI-2LfcinB和EI-4LfcinB的重组质粒构建成功，但并不能表达出正确大小的融合蛋白。经过自剪切反应16h后，对离心上清进行Tricine-SDS-PAGE，并未得到任何多肽电泳条带。

实施例5.重组LfcinB的抑菌活性检测

(1)金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长曲线测定

由图12可知，加入了64μg/ml重组LfcinB的实验组比对照组菌体生长更加缓慢，说明实验制备的重组LfcinB对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有一定的抑菌活性。且LfcinB对革兰氏阳性菌的抑菌活性强于对革兰氏阴性菌的作用。

(2)琼脂扩散法测定LfcinB抑菌活性

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌测定了制备的重组LfcinB抗菌肽的抑菌活性，并进行了三组重复实验。

图13a为琼脂扩散法测定LfcinB对金黄色葡萄球菌的抑菌活性结果。图13b为琼脂扩散法测定LfcinB对大肠杆菌的抑菌活性结果。标注的1-4分别表示牛津杯中加入了200ml终浓度为112μg/ml、56μg/ml、28μg/ml、14μg/ml的LfcinB作用18h后的抑菌圈；5表示加入了200ml终浓度为10μg/ml的AMP阳性对照。琼脂扩散法检测结果显示，重组LfcinB抗菌肽对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有杀菌作用。实验结果显示，112μg/ml的LfcinB对金黄色葡萄球菌可以平均产生14mm直径的抑菌圈，对大肠杆菌可以产生约10mm直径的抑菌圈。随着LfcinB使用量的减少，抑菌圈直径也逐渐减少。

(3)微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)

纯化后的重组LfcinB抗菌肽的浓度为2mg/ml，将其用无菌MH培养基两倍连续稀释后，与等体积的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌培养液混合培养，进行MIC测定。实验结果图14显示，重组LfcinB对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC分别在56μg/ml和112μg/ml。

表2.重组LfcinB的MIC

实施例6.ZT-LfcinB融合抗菌肽在大肠杆菌中的构建

(1)引物设计

表3.Titin引物

表4.Telethonin引物

(2)Z-LfcinB的重叠PCR扩增

表5.Z-LfcinB PCR反应体系(F2-R2)

表6.Z-LfcinB反应条件(F2-R2)

用PCR纯化试剂盒对产物进行回收。

表7.Z-LfcinB PCR反应体系(F1-R1)

表8.Z-LfcinB反应条件(F1-R1)

(3)T-LfcinB的重叠PCR扩增

表9.T-LfcinB PCR反应体系(F2-R2)

表10.T-LfcinB反应条件(F2-R2)

用PCR纯化试剂盒对产物进行回收。

表11.T-LfcinB PCR反应体系(F1-R1)

表12.T-LfcinB反应条件(F1-R1)

(4)目的片段的回收和表达载体的双酶切鉴定

pET-24a-Titin/Telethonin质粒线性化

表13.双酶切体系

37℃水浴反应1h，加入10×DNA loading buffer终止反应，并加入适量Gelred。

(5)目的基因Titin-LfcinB双酶切

表14.双酶切体系

37℃水浴反应1h，加入10×DNA loading buffer终止反应，并加入适量Gelred。

(6)目的基因Telethonin-LfcinB双酶切

表15.双酶切体系

37℃水浴反应1h，加入10×DNA loading buffer终止反应，并加入适量Gelred。

(7)目的片段和表达载体的连接

分别将目的片段和载体进行琼脂糖凝胶电泳，并进行胶回收，进行酶切产物连接。

表16.酶切产物连接体系

(8)pET-24a-Titin-LfcinB重组质粒的构建

Titin-LfcinB重叠PCR扩增，通过两次PCR，将LfcinB基因拼接到Titin的3’-端。图15电泳结果显示，在500-750bp处出现条带，与预期结果相符，扩增成功。

(9)pET-24a-Titin-LfcinB重组质粒的构建

将上述PCR纯化回收得到的Titin-LfcinB目的片段和线性化的质粒pET-24a进行过夜连接，转化感受态DH5α，铺平板培养后，挑取单克隆子进行菌液PCR验证，随后进行3％琼脂糖凝胶电泳。菌落PCR结果显示，在1000bp左右出现条带，与预期的长度一致。挑取1、3、4号菌液送睿迪生物技术公司测序显示，目的基因Titin-LfcinB已正确连接到载体上，pET-24a-Titin-LfcinB重组质粒的构建成功。图16为构建成功的重组质粒图。

(10)pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒的构建

Telethonin-LfcinB重叠PCR扩增，通过两次PCR，将LfcinB基因拼接到Telethonin的3’-端。电泳结果显示，在500bp处出现条带，与预期结果相符，扩增成功。结果如图17所示。

pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒的构建。

将上述PCR纯化回收得到的Telethonin-LfcinB目的片段和线性化的质粒pET-24a进行过夜连接，转化感受态DH5α，铺平板培养后，挑取单克隆子进行菌液PCR验证，随后进行3％琼脂糖凝胶电泳。结果如图18所示。

菌落PCR结果显示，在750bp左右出现条带，与预期的长度一致。挑取3、4、5号菌液送睿迪生物技术公司测序显示，目的基因Telethonin-LfcinB已正确连接到载体上，pET-24a-Telethonin-LfcinB重组质粒的构建成功。

实施例7.ZT-LfcinB融合抗菌肽表达、纯化与活性测定

(1)目的蛋白的表达

①挑取BL21转化子单菌落接种于含Kan⁺(50μg/ml)的5ml LB培养基中，37℃，200rpm，过夜培养；

②取培养过夜的菌液按1:100的比例加入到含Kan⁺(50μg/ml)的100ml LB培养基的锥形瓶中，37℃，200rpm振荡培养约2.5h，至OD₆₀₀达到0.5左右；

③加入IPTG至终浓度为1mM,37℃，200rpm诱导6h；

④收集培养液，4℃，12000rpm离心10min，弃上清收集菌体；

⑤加入15ml PBS重悬菌体，4℃，12000rpm离心10min，弃上清收集菌体，4℃保存备用；

⑥加入10ml预冷的PBS重悬菌体，4℃高压匀浆破碎细胞。

(2)目的蛋白的纯化

1.上清表达的Titin-LfcinB的Ni-NTA纯化

①将破碎后的菌液4℃，12,000rpm离心15min，收集上清；

②组装Ni柱，用5×柱体积的ddH₂O洗去20％的乙醇，除尽空气；

③用10×柱体积的PBS缓冲液进行柱平衡；

④缓慢加入蛋白样品，上清使用前先用0.22μm的滤膜过滤；

⑤用5×柱体积的NTA梯度20，60，100，200，300，400，600Buffer缓慢洗脱，收集各梯度流穿液，SDS-PAGE分析最佳洗脱条件；

⑥用10×柱体积的NTA-600洗脱柱子；

⑦用10×柱体积的ddH₂O清洗柱子；

⑧加入20％乙醇溶液，4℃保存；

⑨将纯化洗脱的蛋白质进行透析并超滤浓缩，-20℃保存。

2.包涵体表达的Telethonin-LfcinB的纯化

①将破碎后的菌液4℃，10,000rpm离心15min，收集沉淀；

②加入包涵体洗涤液重悬沉淀，冰浴下200rpm转子搅拌10min，4℃，8000rpm离心15min，弃上清；

③重复三次；

④加入包涵体变性缓冲液10ml，冰浴下200rpm转子搅拌30min，4℃，8000rpm离心15min，取上清；

⑤将上清进行超滤浓缩，-20℃保存；

⑥各步骤均留样进行SDS-PAGE。

3.Bradford法测定纯化后的蛋白浓度

a.BSA标准曲线的绘制

①将0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(100μg/ml)分别加入到试管中，加入补足ddH₂O到1ml；

②向各试管中加入5ml考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5-10min；

③用分光光度计测定595nm处的吸光值，并记录读数；以不含BSA的样品的光吸收值作为空白对照；绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。标准曲线如图20所示。

表17.标准曲线表

(3)ZT-LfcinB自组装

测定纯化并浓缩后的融合抗菌肽浓度，按照Titin-LfcinB：Telethonin-LfcinB＝2:1的比例进行混合，并在透析的条件下进行48h自组装。超滤浓缩组装后的ZT-LfcinB。

(4)ZT-LfcinB融合抗菌肽活性测定

1.琼脂扩散法测定ZT-LfcinB抑菌活性

①按0.8％的比例向蒸馏水中加入琼脂粉末，121℃高温灭菌，取约7ml平铺于无菌的平板中，凝固待用；

②用接种环挑取单个待检菌落，接种于5ml的MH肉汤培养基中，37℃，200rpm，3-6h使其OD₆₀₀＝0.6；

③按比例取0.5ml上述菌液至50ml含1％琼脂的LB培养基中使菌量保持在2-7×10⁵CFU/ml。无菌条件下用约15ml的量均匀铺于培养皿上，完全凝固后待用；

④向完全凝固的琼脂平板上放入牛津杯，将纯化后的重组ZT-LfcinB用0.22μm滤膜过滤，取200μl加入相应的牛津杯中，37℃静置培养16-24h，测定抑菌圈大小。本实验以AMP作阳性对照，ddH₂O作阴性对照。

⑤重复上述实验三次。

(5)ZT-LfcinB融合抗菌肽的纯化

Titin-LfcinB的纯化：Titin-LfcinB融合抗菌肽为上清表达，因其N-端带有6×His组氨酸标签，遂采用镍柱亲和层析的方法分离纯化。细菌破碎后离心取上清，用0.22μm滤膜过滤，缓慢加入镍柱中，并用咪唑梯度洗脱，图21结果SDS-PAGE分析可知，当咪唑浓度为400mM时洗脱条件最佳，纯度可达95％以上。通过超滤管离心浓缩后，Brad-ford测定蛋白浓度为1.27mg/100ml发酵菌液。

(6)Telethonin-LfcinB的纯化

Telethonin-LfcinB融合抗菌肽为包涵体表达，遂采用包涵体洗涤的方法分离纯化。细菌破碎后离心取沉淀，加入包涵体洗涤缓冲液洗涤三次，加入含8M尿素的变性缓冲液充分溶解融合抗菌肽，并通过尿素梯度透析24h缓慢复性。超滤离心浓缩后，由SDS-PAGE分析可知，包涵体洗涤缓冲液洗涤三次后可完全除去膜蛋白等杂质，纯度可达95％以上。Brad-ford测定蛋白浓度为907.9μg/100ml发酵菌液。

(7)ZT-LfcinB融合抗菌肽

图22和图23显示，将分别超滤浓缩后的Titin-LfcinB和Telethonin-LfcinB融合多肽按照摩尔量2:1的比例混合，4℃下静置组装48h，12,000rpm离心后取上清，Native SDS-PAGE显示，形成了ZT-LfcinB融合多肽。我们发现，由于Telethonin-LfcinB在组装的过程中非常容易形成沉淀，因此会残留少量Titin-LfcinB融合蛋白单体存在于上清中。超滤管离心浓缩后，Brad-ford测定蛋白浓度为2mg/ml。

(8)琼脂扩散法测定ZT-LfcinB融合抗菌肽活性

以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为指示菌测定了制备的ZT-LfcinB融合抗菌肽的MIC，并进行了三组重复实验。图24a为琼脂扩散法测定ZT-LfcinB对大肠杆菌的抑菌活性结果。图中标注的1表示牛津杯中加入了200ml浓度为500μg/ml的ZT-LfcinB作用18h后的抑菌圈；2和3分别表示牛津杯中加入了200ml浓度为5μg/ml和10μg/ml AMP产生的抑菌圈。图24b为琼脂扩散法测定ZT-LfcinB对金黄色葡萄球菌的抑菌活性结果。标注的1-3表示牛津杯中加入了200ml浓度为500μg/ml的ZT-LfcinB作用18h后的抑菌圈；4表示200ml的ddH₂O阴性对照组，5表示加入的200ml 5μg/ml AMP产生的抑菌圈。由图24可知，当ZT-LfcinB的浓度高达500μg/ml时对这两种试验菌仍然没有肉眼可见的抑菌作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种基于组合自剪切与蛋白支架的生物活性小肽制备方法

<130> /

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

20 25

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cagcgtgtac acaacatgtt caaatgccgt cgttggcagt ggcgtatgaa aaaactgggt 60

gctc 64

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cccaagcttt taccatggaa aggcacgacg cacacaggtg atagacggag cacccagttt 60

tttcata 67

<210> 4

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys

20 25 30

Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile

35 40 45

Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

50 55

<210> 5

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgtacacaac ttcaaatgcc gtcgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc 60

tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca 120

gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc tatcacctgt gtgcgtcgtg ccttttaaaa 180

gctt 184

<210> 6

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys

20 25 30

Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile

35 40 45

Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys Cys Arg

50 55 60

Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys

65 70 75 80

Val Arg Arg Ala Phe Asn Asn Asn Asn Asn Phe Lys Cys Arg Arg Trp

85 90 95

Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg

100 105 110

Arg Ala Phe

115

<210> 7

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tgtacacaac ttcaaatgcc gtcgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc 60

tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca 120

gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa 180

caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc 240

tatcacctgt gtgcgtcgtg cctttaacaa caacaacaat ttcaaatgcc gtcgttggca 300

gtggcgtatg aaaaaactgg gtgctccgtc tatcacctgt gtgcgtcgtg ccttttaaaa 360

gctt 364

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

taatacactc actataggg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgctagttat tgctcagcgg 20

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cagcgtgtac acaacatgtt caaatgccgt c 31

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ggaattccat atgcatcatc atcaccacca tagcagca 38

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

catatgcatc atcatcacca ccatagcagc atgaccaccc aggcaccga 49

<210> 13

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ccgctcgagt taaaaggcac gacgcacaca ggtgatagac ggagcaccca gttttttcat 60

acgccactgc caacgacggc atttgaaag 89

<210> 14

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tgccaacgac ggcatttgaa agaaccacca ccaccagaac caccaccacc agaaccacca 60

ccaccgccct gcaccagcag ctcgg 85

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ggaattccat atgaaacatc accatcacca tcacccca 38

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aaacatcacc atcaccatca cccca 25

<210> 17

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

tgccaacgac ggcatttgaa agaaccacca ccaccagaac caccaccacc agaaccacca 60

ccacccggca gtacccgctg gtagg 85