一种检测试剂盒的制作方法

本实用新型涉及环状DNA拷贝数检测，具体涉及一种检测试剂盒。

背景技术：

线粒体是真核细胞内主管能量代谢的细胞器。不同类型细胞内线粒体的数量从几百个到几千个不等。线粒体DNA(mtDNA)是位于线粒体内裸露的双链环状DNA分子，通常每个线粒体含有2～10个拷贝。人类mtDNA全长16.6Kb，含37个基因，分别编码13个蛋白、22个线粒体tRNA和2个线粒体rRNA。线粒体功能的实现依赖于mtDNA基因复制、转录，因而细胞内mtDNA数量变化必然引起线粒体功能的改变。线粒体是氧化磷酸化反应的中心，可产生大量自由基，对mtDNA造成损伤；加之mtDNA缺乏核DNA所具有的组蛋白保护及完备的DNA损伤修复机制，因而比基因组DNA更易受到损伤。损伤的mtDNA通过自噬途径降解，细胞内mtDNA总数量减少，从而影响线粒体功能。

由于线粒体DNA量的变化导致线粒体故障已涉及癌症、神经变性、糖尿病及老化，并在其他几个临床方面也已体现出影响(例如在体细胞或低质量的生殖细胞(卵母细胞)内逆转录病毒药物诱导线粒体的耗竭)。因此，线粒体DNA的定量是至关重要的，不仅要了解病理表型和临床进展，同时也可深入了解的线粒体DNA含量的一般变化。

研究表明，荧光定量PCR(Q-PCR)中每个模板的Ct(Cycle threshold)值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

目前已有的技术方案有mtDNA的全基因高通量测序，观察突变位点，此方法测序周期长，而且需要专业的人员对测序结果进行分析并且需要大量的数据库进行对比。

技术实现要素：

针对以上现有技术问题，本实用新型的目的在于提供一种检测试剂盒，以解决现有技术中导致的上述缺陷。具体技术方案如下：

一种检测试剂盒，包括方盒，泡沫垫以及试剂瓶，其中，所述方盒內置所述泡沫垫，方盒顶部设有盒盖，盒盖下表面设有定位块；所述泡沫垫上开设有四个孔；所述试剂瓶分别为1号试剂瓶、2号试剂瓶、3号试剂瓶、4号试剂瓶，放置于所述四个孔内。

进一步地，所述塑料方盒的内尺寸为100～200mm(L)*20～40mm(W)*50～100mm(H)，所述泡沫板尺寸为100～200mm(L)*20～40mm(W)*25～50mm(H)。

进一步地，所述方盒为塑料方盒。

进一步地，所述试剂瓶均为透明试剂瓶。

进一步地，所述四个试剂瓶均具有瓶盖。

进一步地，所述瓶盖的颜色均不相同。

进一步地，所述瓶盖上均设有圆形标识。

上述线粒体DNA拷贝数检测试剂盒的使用方法，包含如下步骤：

(1)制备单细胞液；

(2)裂解定量细胞；

(3)Q-PCR反应；

(4)制备标准曲线；

(5)线粒体DNA拷贝数的绝对量化。

进一步地，包含如下步骤：

(1)制备单细胞液：通过酶促消化组织得到单细胞液，首先悬浮在1×PBS缓冲液中，使用细胞计数器计数；

(2)裂解定量细胞：转移1000～10000个细胞到200μl薄壁PCR管中，加入等体积的2×蛋白消化液，40℃～60℃孵育6～12小时，接着80℃～95℃热灭活10～30分钟；

(3)Q-PCR反应：将每种样品进行梯度稀释并分别置于各PCR管中，然后加入PCR预混液、染色溶液，置于Q-PCR仪中进行反应；

(4)制备标准曲线：根据Q-PCR结果绘制标准曲线；

(5)线粒体DNA拷贝数的绝对量化：Ct值和标准的初始拷贝数的对数之间的关系应是线性的，相关系数R2>0.99。

与目前现有技术相比，本实用新型试剂盒大小适中，美观。由于本试剂盒需要冷链运输，内置泡沫板一方面可以固定试剂瓶，另一方面有隔热的效果，经济、实用。实验方法简单，易操作，无需很专业的技术要求。适合医院及科研院所单位大范围使用。

附图说明

图1为线粒体DNA拷贝数检测试剂盒示意图

具体实施方式

下面根据附图对本实用新型进行详细描述，其为本实用新型多种实施方式中的一种优选实施例。

图1为线粒体DNA拷贝数检测试剂盒示意图，1号试剂瓶(稀释缓冲液)，2号试剂瓶(蛋白消化液)，3号试剂瓶(PCR预混液)，4号试剂瓶(染色剂溶液)，还包括方盒和泡沫垫5，其中，所述方盒內置所述泡沫垫5，方盒顶部设有盒盖6，盒盖下表面设有定位块7；所述泡沫垫5上开设有四个孔；所述试剂瓶分别为1号试剂瓶1、2号试剂瓶2、3号试剂瓶3、4号试剂瓶4，放置于所述四个孔内。

包括塑料方盒，所述塑料方盒內置大小合体的泡沫板5，所述泡沫板有四个孔洞，所述孔洞内放置四个试剂瓶，分别为1号试剂瓶1、2号试剂瓶2、3号试剂瓶3、4号试剂瓶4，所述1号试剂瓶1内盛放稀释缓冲液，所述2号试剂瓶2内盛放蛋白消化液，所述3号试剂瓶3内盛放PCR预混液，所述PCR预混液(PCR Master Mix)包含dNTP、PCR缓冲液、MgCl2、ddH2O、Enhancer、引物对、Taq酶，所述4号试剂瓶4内盛放染色剂溶液。

在另一个优选实施例中，

一种线粒体DNA拷贝数检测试剂盒及其应用，包括塑料方盒，所述塑料方盒內置大小合体的泡沫板，所述泡沫板有四个孔洞，所述孔洞内放置四个试剂瓶，分别为1号试剂瓶、2号试剂瓶、3号试剂瓶、4号试剂瓶，所述1号试剂瓶内盛放稀释缓冲液，所述2号试剂瓶内盛放蛋白消化液，所述3号试剂瓶内盛放PCR预混液，所述PCR预混液(PCR Master Mix)包含dNTP、PCR缓冲液、MgCl2、ddH2O、Enhancer、引物对、Taq酶，所述4号试剂瓶内盛放染色剂溶液。

1、所述塑料方盒的内尺寸为100～200mm(L)*20～40mm(W)*50～100mm(H)，所述泡沫板尺寸为100～200mm(L)*20～40mm(W)*25～50mm(H)，所述稀释缓冲液为PBS缓冲液、Hanks缓冲液及其他细胞缓冲液，优选PBS缓冲液，所述蛋白消化液为蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶，优选蛋白酶K，所述染色剂溶液为SYBR Green溶液、Eva Green溶液、LC Green溶液，优选10×SYBR Green工作液。使用方法包含如下步骤：

(1)制备单细胞液：通过酶(实验室常规酶)促消化组织得到单细胞液，首先悬浮在1×PBS缓冲液中，使用细胞计数器计数。

(2)裂解定量细胞：转移1000～10000个细胞到200μl薄壁PCR管中，加入等体积的2×蛋白消化液，40℃～60℃孵育6～12小时，接着80℃～95℃热灭活10～30分钟。

(3)Q-PCR反应：将每种样品进行梯度稀释并分别置于各PCR管中，然后加入PCR预混液、染色溶液，置于Q-PCR仪中进行反应。

(4)制备标准曲线：根据Q-PCR结果绘制标准曲线。

(5)线粒体DNA拷贝数的绝对量化：Ct值和标准的初始拷贝数的对数之间的关系应是线性的，相关系数R2>0.99。相关分析和回归分析可以使用Microsoft Excel来完成。

引物对包含上引物和下引物，根据本试剂盒的具体应用可进行单独设计合成，本试剂盒的应用包含乳腺癌、节直肠癌、衡量卵母细胞及胚胎质量，以上列出部分应用但本试剂盒的应用不限于此。

下述实施案例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，下述实施案例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

优选实施案例为小鼠胚胎组织细胞中线粒体DNA拷贝数的检测：

通过酶促消化小鼠胚胎组织得到细胞液，首先悬浮在1×PBS中，使用细胞计数器计数(例如血球)。转移1000的细胞到200μl薄壁PCR管中，加入等体积的2×裂解缓冲液，55℃孵育12小时，接着95℃热灭活10分钟。Q-PCR反应中应将每种样品连续稀释10¹-10³倍，用来建立标准曲线。

线粒体的绝对量化将通过标准曲线方法来进行。1ng线粒体标准品由1.24×10⁹的双链DNA分子组成。1ng/μl标准10⁷-10²倍稀释液实时PCR扩增范围在1.0×10²至1.0×10⁷拷贝数内。Ct值和标准的初始拷贝数的对数之间的关系应是线性的，相关系数R2>0.99。相关分析和回归分析可以使用Microsoft Excel来完成。

一个364孔PCR板上包括非稀释、连续稀释和标准的样品测量。

1、PCR体系(试剂盒使用前将PCR预混液和染色剂溶液混合)

*可以推断在每个反应中所用的细胞的数目。每个样本个重复。

2、PCR条件

循环阈值数(Ct)由仪器提供的软件来计算，例如ABI7900HT SDS2.3。每个PCR产物的量通过使用Ct值和标准浓度对数计算出的标准曲线的线性回归模型进行校准标准曲线回归方程为y＝–3.458x+41.491,其中y为Ct值,x为模板拷贝数以10为底的对数,相关系数为0.999。结果显示,小鼠胚胎干细胞中mtDNA平均拷贝数/细胞为1 321±228,线粒体的含量比较丰富。反应体系具有较高的检测敏感性,模板浓度在103～108拷贝/μL反应时,反应体系具有良好的重复性和特异性,结果可靠。

本实用新型的应用包含乳腺癌、节直肠癌、衡量卵母细胞及胚胎质量，以上列出部分应用但本试剂盒的应用不限于此。