一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基的制作方法

本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别是指一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基。
背景技术：
：间充质干细胞包括脐带/胎盘(UC-MSC)、骨髓(BM-MSC)和脂肪来源的间充质干细胞(AD-MSC)具有自我更新的能力，能够大量扩增，也会衰老凋亡，这与胚胎干细胞(ESC)、诱导的多能干细胞(iPS)不一样。其二，AD-MSC具有多向分化潜能，可形成多种终末组织细胞，如神经细胞、视网膜细胞、肝脏细胞、胃肠组织、脂肪组织、肌肉血管、血液、皮肤毛发、骨骼和软骨细胞等。这些特征说明间充质干细胞在一定的培养环境下，能够分化成不同类型的细胞。大量研究表明间充质干细胞是一群异质的干细胞，也就是说它们是一群不同等级不同特征和不同增值分化能力的干细胞，这些问题给间充质干细胞的分离、培养、鉴定和应用带来了相当大的挑战。例如，对于间充质干细胞的培养和鉴定目前还没有统一的方案。有人用DMEM基本培养基，根据添加不同浓度的胎牛血清，发现低浓度血清减缓间充质干细胞丧失增殖分化潜力，进一步的研究表明，不同培养基、有无胎牛血清、不同的pH值、不同的种植密度和不同氧浓度等都会影响间充质干细胞的增值分化和衰老凋亡。所以，如能研制一种无分化扩增抗衰培养基对基础研究和临床应用就显得非常必要和重要。尽管目前已有多种间充质干细胞的培养基，有含动物血清和不含动物血清的，有在DMEM基本培养基中加入不同细胞因子的。目前市场上已有数种商业化的人间充质干细胞无血清培养基，但基本都为国外进口，仅供研究应用，不能用于人体的使用。这些商业化的间充质干细胞无血清培养基的代表，如LifeTechnology的间充质干细胞无血清培养基StemProSFM、Gibco无血清培养基、StemCell无血清培养基，这些无血清培养基存在细胞贴壁差、细胞增殖速率低、价格较高等不足之处。更重要的是不能防止培养细胞的分化和衰老。近年来国内一些公司和单位也纷纷对此研究，其中已有几个在申请间充质干细胞的培养专利。中国专利CN102965337公开了一种分离提取人脂肪间充质干细胞的方法和专用培养基，该培养基以改良Eagle为基础培养基，添加10％的胎牛血清、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸、甲状腺原氨酸。该培养基是不能用于临床用途的AD-MSCs的培养，培养的干细胞易于分化和衰老。中国专利CN105112363公开了一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法，该培养基以DMEM为基础培养基，添加了：L-谷氨酰胺、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白和1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖，能促进细胞的贴壁和增殖，保持第5代良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，但该培养基没能给出6代后乃至10-20代的干细胞形态和特征是否能被保持的数据和证据。其二，有干性基因尤其是OCT4的激活，使原致癌性极低的AD-MSC的风险增大。中国专利CN102433302公开了一种无血清培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，该发明培养基中添加了一种贴壁因子，但细胞贴壁性能乃不够理想。因此，现有技术存在细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想等问题。成体干细胞培养基除了细胞贴壁性差、易分化和异源血清和蛋白等问题外，还存在着易引起成体干细胞衰老和凋亡的问题。至今国内外市场上的商用培养基都没有考虑这个问题，更不用说来解决这一关键问题。技术实现要素：本发明提出一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基，解决了现有技术中用于培养间充质干细胞的无血清培养基易分化、易引起成体干细胞衰老和凋亡的问题。本发明的技术方案是这样实现的：一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基，包含细胞因子、维生素、化学小分子，其中各组分的含量如下：本发明中细胞因子包括：1)转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，TGF-β)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能，转化生长因子-β可以结合到细胞表面的转化生长因子-β受体结合而激活其受体；2)白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)参与造血调控，在体外可诱导M1细胞的正常分化，抑制胚胎于细胞(ES)的分化等；3)激活素A(ActivinA)属于转化生长因子超家族，在干细胞增殖分化调节等诸多方面发挥作用；4)表皮细胞生长因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)能促进表皮细胞组织内多种细胞的生长分裂，使表皮细胞变得饱满、恢复年轻状态；5)成纤维细胞生长因子2(FibroblastGrowthFactor-basic-2)是最强有力的血管生长因子，促进细胞的增殖和新血管形成，修复损害的内皮细胞；6)类胰岛素生长因子(InsulinGrowthFactors，IGF-1)能促进细胞内氨基酸和葡萄糖输送，促进生长，降血糖，参与糖代谢、蛋白质代谢和脂肪代谢，促进蛋白质合成等；7)肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)具有促进包括干细胞、上皮细胞、内皮细胞、造血细胞等多种类型细胞的生长、迁移和形态发生的作用；8)血小板生长因子(platelet-derivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)促细胞分裂剂，可刺激成纤维细胞和其他多种细胞分裂增殖；9)血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)促进内皮细胞增殖，诱导血管新生；10)干细胞因子(StemCellFactor，SCF)是一种重要的造血生长因子，在骨髓移植、外周血干细胞动员、脐带血干细胞扩增方面具有重要作用；11)埃皮塔隆四肽(Epithalon，Ala-Glu-Asp-Gly)具有激活端粒酶，延长端粒、促进细胞生长的作用。本发明培养基中添加了维生素C，维生素C具有抗氧化，参与细胞间质形成，维护血管、肌肉、骨、牙的正常生理功能；本发明培养基中化学因子包括：1)硫辛酸(alphalipoicacid)是一种存在于线粒体的辅酶，类似维他命，能消除加速老化与致病的自由基.3.黄芪甲苷可显著促进细胞的生长和迁移，促进新生皮肤的血管生成，增加皮肤力学强度；2)黄芪甲苷可显著促进细胞的生长和迁移，促进新生皮肤的血管生成，增加皮肤力学强度；3)人参皂苷(Ginsenoside)显著提高超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力，增强了机体防御毒性氧自由基损伤的能力、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长；4)Rapamycin是新型大环内酯的抗排斥药物能延长酵母菌、线虫、果蝇等无脊椎动物的寿命；5)二甲双弧对肝癌有抑制作用，也是潜在的抗衰老药物；6)亚精胺(spermidine)调控一系列关键的细胞过程，可以延迟衰老，亚精胺之说以能延迟衰老在于促进蛋白质的合成或组织它们的降解；7)SRT1720是一种选择性的SIRT1激活剂，SIRT1通过加强FOXO目的基因的表达改变细胞周期停留或阻滞可抑制细胞死亡诱导机制，促进细胞存活；8)白藜芦醇(Resveratrol)是抗衰老酶的活化剂，通过促进SIRT1依赖性的p53脱乙酰作用增加细胞存活；通过刺激Sir2模拟热量限制，增加DNA稳定性并延长寿命；通过其抗氧化活性，能够有效保护心肌细胞对低氧的耐受，降低丙二醛的浓度并减少细胞的凋亡；9)奥替普拉(Oltipraz)作为一种NRF2激动剂，通过改善间充质干细胞中的氧化还原稳态以提高细胞的基因组稳定性，从而防止干细胞在体内的加速耗竭。优选的，还包括增加了ITS添加剂的DMEM/F12基础培养基。ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂。优选的，所述基础培养基的配置方法：将DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀后，再添加1％ITS而成。优选的，所述维生素为维生素A、维生素B、维生素C中的一种或几种。优选的，所述维生素为维生素C。本发明的有益效果：1)本发明提供一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养体系，用于体外大规模培养人间充间质干细胞，且本发明的培养基采用无动物来源的血清，因此可以控制感染风险，这种培养体系中包含多种化学小分子和生物大分子，具有改善细胞的生理代谢和增殖生长潜能，对抗氧化应激反应和清除自由基，防护DNA突变，保护线粒体，减少细胞内的分子垃圾，激活长寿基因和端粒酶的功效。2)间充质干细胞无血清培养基中加入一组细胞因子，它们具有各自的独特效果和协同作用，使细胞的干性、增殖能力和生理代谢活动能维持更好；不含有毒有害物质，对抗细胞衰老和凋亡，所以比含血清的培养基更安全；3)间充质干细胞无血清培养基中加入一组化学小分子，可最大程度的消除自由基对干细胞的损伤，可防止细胞的衰老和病变，最大程度地保持小梭形细胞的形态和功能特征；4)本发明的无分化扩增抗衰老培养基，最大程度地防止干细胞的非定向分化，激活青春基因和端粒酶基因，使细胞能保持正常而旺盛地增值生长并不会致瘤；5)本发明的无分化扩增抗衰老培养基，可大规模扩增使在较短期间内获得临床级(3～6×108-10)的优质干细胞变得可靠易行，最终明显改善培养中间充质干细胞的细胞形态、表面标志、生长状态和关键基因表达；6)本发明的培养基培养10代以上人间充质干细胞仍然能保持其特有的青春活力的表型：短小细梭形、胞体饱满丰盈、形态大小均一、直径不超过20微米，成螺旋样生长，高表达HLA-ABC、CD166、CD44和CD29(阳性率高达99％)，不表达beta-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)和低水平的p12，p21和p65，而Sirt1、nrf2和端粒酶高表达以及增长端粒；7)本发明的特效培养体系成分简单清晰，无批次之间的差异，重复性好；可在短时间获得大量优质的人间充质干细胞，有效改善间充质干细胞生长状态；防止了培养过程中干细胞的分化和衰老，确保了间充质干细胞培养前后生物学特性保持不变；为细胞治疗和美容提供高纯度和高活力的干细胞建立了实用的技术平台。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1.为不同传代的间充质干细胞的光学显微镜下的细胞形态图，其外形特征为小梭形、胞体饱满、大小均一、直径不超过20微米，成螺旋样生长。图2.不同类型培养基对不同培养代数的间充质干细胞中端粒酶活性的影响。Y-轴代表端粒酶的相对活性，X-轴代表不同类型的培养剂。柱的颜色代表不同的培养代数。每种实验重复三次；图3.不同类型培养基对不同培养代数的间充质干细胞中端粒长度的影响。Y-轴代表端粒的相对长度，X-轴代表不同类型的培养基。柱的颜色代表不同的培养代数。每种实验重复三次；图4.不同类型培养基对不同培养代数的间充质干细胞中一些基因的影响。Y-轴代表有关基因的相对表达，X-轴代表不同类型的培养基。柱的颜色代表不同的基因。每种实验重复三次。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例一一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基，包含细胞因子、维生素、化学小分子，其中各组分的含量如下：本发明的培养基还包括增加了ITS添加剂的DMEM/F12基础培养基。ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂，基础培养基的配置方法：将DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀后，再添加1％ITS而成，DMEM/F12培养基由Gibco公司提供，货号为11320-033，ITS为Sigma公司产品，货号I1884。实施例二一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基，包含细胞因子、维生素、化学小分子，其中各组分的含量如下：本发明的培养基还包括增加了ITS添加剂的DMEM/F12基础培养基。ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂，基础培养基的配置方法：将DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀后，再添加1％ITS而成，DMEM/F12培养基由Gibco公司提供，货号为11320-033，ITS为Sigma公司产品，货号I1884。实施例三一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基，包含细胞因子、维生素、化学小分子，其中各组分的含量如下：本发明的培养基还包括增加了ITS添加剂的DMEM/F12基础培养基。ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂，基础培养基的配置方法：将DMEM和F12按溶液体积比1∶1的比例混合均匀后，再添加1％ITS而成，DMEM/F12培养基由Gibco公司提供，货号为11320-033，ITS为Sigma公司产品，货号I1884。本发明的多项验证实验1)人脂肪间充质干细胞的大规模无分化扩增不同代的间充质干细胞按5-8×103/cm2的密度接种在本发明实施例二的无血清培养液中作细胞培养扩增。细胞培养的条件是培养条件：37℃恒温、恒湿，5％CO2。在相差倒置显微镜下对不同代的间充质干细胞进行观察和拍照，如图1，结果发现这些不同代的干细胞都具有典型的间充质干细胞的形态学特征如短小细梭形、胞体饱满丰盈、大小形态均一、直径不超过20微米，成螺旋样生长。将第8代的脂肪间充质干细胞按照5000细胞/cm2的密度种植到4个T75细胞培养瓶中，分别加入培养基-1(StemCELL)，培养基-2(StemPro)，培养基-3(本发明实施例二的培养基)和培养基-4(DMEM添加10％FBS)，4个培养基与脂肪间充质干细胞悬液充分混匀后，将4个细胞培养瓶放入到37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养。长到85％汇合度后，按照8000细胞/cm2的密度进行细胞传代；传代和最终收获时，用0.25％的胰酶/EDTA消化1-2min，之后将间充质干细胞吹打下来并用各对应培养基终止消化；将得到的间充质干细胞以200g的速度离心5min，收集间充质干细胞并用10ml的磷酸盐缓存溶液重悬后，再以200g的速度离心5min，得到的间充质细胞用10ml的磷酸盐缓存溶液混匀；将得到的细胞用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。每组测3次，结果取平均值如表1所示。表1在不同培养条件下间充质干细胞的生长、存活和直径的变化培养基-1培养基-2培养基-3培养基-4第1天细胞数40万40万40万40万第14天细胞数1.8×1081.6×1082.5×1081.2×108细胞最大um18.7±2.618.9±2.517.8±1.919.7±2.9细胞存活率95.5％93.9％98.7％90.1％由表1显示脂肪间充质干细胞在培养基-1、培养基-2、培养基-3和培养基-4中传代培养14天后，脐带/脂肪间充质干细胞的细胞数及活率检测结果。比较分析发现本发明的特效培养基对脂肪间充质干细胞的增殖生长明显好于其它三种培养基。能够保持干细胞的高效扩增，为大规模高效扩增间充质干细胞提供了可靠的技术保障。更重要的是，本发明的特效培养基-3能确保细胞的大小无明显的改变，并能使间充质干细胞的直径小于其他同类的培养基，这充分展示了本发明的培养基能大规模地生产优质无分化的间充质干细胞。2)人脐带间充质干细胞的表面标志的维持和鉴定扩增原代以及第4，8，和12代间充质干细胞，继而可用于不同的实验研究和检测.流式细胞术检测显示这些不同代的细胞均能高表达间充质干细胞的表面标记蛋白：如CD29，CD73，CD44，CD166，CD105，CD90，PDGFR和HLA-ABC等，但不表达CD31，CD34，CD45，CD33和CD38等，如表2和3所示。具体操作如下：取原代，第4，8和12代细胞用0.25％的胰酶/EDTA消化1-2分钟后移入2ml离心管，800rmp离心5分钟，去除上清；每管加入2mlPBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；加入1ml的PBS重悬细胞，计数，再加入PBS调整细胞数为1×106个/ml；将细胞悬液分成多管，每管500μl，选其中一管作为流式对照组；按组分别加入带有FITC标记的CD29、CD44、CD73、CD166等流式抗体，4℃避光孵育30分钟，800rmp离心5分钟去除上清；加入1mlPBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；加入500μlPBS重悬细胞；上流式细胞仪检测样品。表2本发明的特效培养基能完好地维持干细胞的膜表面阳性生物学特征阳性标志物原代第4代第8代第12代CD2999.399.699.599.3CD4499.199.499.199.2CD7398.799.199.198.3CD9099.099.298.698.7HLA-ABC99.599.399.299.0CD16699.299.799.099.2PDGFR96.496.696.897.1表3本发明的特效培养基能完好地维持干细胞的膜表面阴性生物学特征阴性标志物原代第4代第8代第12代CD330.30.50.60.4CD341.70.60.80.7CD380.70.40.60.5CD311.20.70.80.6CD410.50.80.40.5表2和表3指出经流式细胞术检测，使用本发明的特效培养基培养的原代到12代的脐带来源间充质干细胞的有关阳性标志物如CD29、CD44、CD166、CD73等能保持高表达不变，同时也能维持原有的阴性标志如CD34、CD33、CD31、和CD41等。表明特效培养基和上述的培养条件确实能够在促进干细胞扩增的同时，防止和减少间充质干细胞的分化和表形改变等问题。3)人脂肪间充质干细胞的端粒酶活性和端粒长度的测定为进一步检测和确认本发明的特效培养基能够防止和延缓干细胞在体外培养过程中发生衰老和凋亡，我们采用beta-半乳糖苷酶基因、衰老有关的基因来检测这些不同代细胞是否出现衰老情况。用TRAP/ELISA方法检测细胞中端粒酶的活性并用流式荧光原位杂交法检测端粒的长度。端粒酶活性检测是将端粒酶介导的衍生产物进行PCR扩增，并与后序的ELISA法结合在一起。(1)延伸/扩增：第一步：端粒酶将端粒重复序列(TTAGGG)加到带有生物素标记的P1-TA引物的3’末端。第二步：利用引物P1-TS和T2通过PCR扩增这些延伸出的产物，产生出的PCR产物带有特异的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物。(2)ELISA测定：PCR产物变性后与Dig标记的端粒特异的重复检测探针杂交。终产物可经生物素标记的探针固定到亲和素包被的微量滴定板上。固定的PCR产物可用与过氧化物酶交联的抗地高辛复合物(anti-Dig-POD)检出。最后，经过分解底物TMB形成一种有色的反应物，再用酶标仪进行检测。具体操作：每次实验独立制作3个TRAP检测对照组。(1)端粒酶阳性细胞对照组(试剂盒提供)；(2)TSR8PCR/ELISA阳性对照组(试剂盒提供)；(3)阴性对照组。同时每个样品包含2个组：提取物组和提取物热处理组(10uL提取液85℃孵育10min)。具体操作：105-106细胞加200pL的lxCHAPS裂解液，冰上裂解细胞30min，40℃13000xg离心25min，取上清液。每个PCR管50uL反应液；2uL样本液，10uL的5×TRAP反应混合液，2UTaq多聚酶，去离子水38uL。PCR循环40次：94℃30s.55℃30s。ELISA检测端粒酶活性：250uL封闭液37℃封闭30min后，100uL封闭液+5uLTRAP反应产物混匀，37C孵育1h。洗液冲洗5次。加100uL的终止液振荡。在酶标仪450nm和690nm读取数值。吸光度A＝A450-A690。△A＝A(提取物组)-A(提取物热处理组)。数据分析：在△A(阴性对照组)＜0.20、△A(PCR/ELISA阳性对照组)＞0.80、△A(提取物热处理对照组)＜0.25的情况下△A＞0.15为端粒酶阳性。流式荧光原位杂交法(Flow-Fish)检测端粒长度的变化。分别取上述4种不同培养基，培养基-1(StemCELL)，培养基-2(StemPro)，培养基-3(本发明实施例二的培养基)和培养基-4(DMEM添加10％FBS)，培养至第10代，生长状态良好的5×106细胞悬液，置于1.5mLEP管中，离心去培养介质，将细胞重新悬浮于100pL杂交液中、加入FITC-(C3TA2)PNA探针。阴性对照组以相同体积的三蒸水代替FITC-(C3TA2)3PNA探针。将样品变性后暗处室温杂交2h。之后，细胞用洗液1洗两次，洗液2洗一次。洗液1含70％去离子甲酰胺、10mmol/LTris-HCI、0.1％BSA和Tween-200洗液2为含0.1％液2洗一次。洗液2为含0.1％BSA和Tween-20的PBS。将细胞重悬于300uL含碘化丙锭(PI)的磷酸缓冲液中，于40℃下放置过夜，于FACSort流式细胞仪上，由FL-2通道测定PI荧光强度，FL-1通道测定端粒FITC线形范围内的荧光强度。为进行数据分析，细胞控制为单一二倍体细胞。端粒平均荧光强度表示与FITC-(C3TA2)3PNA探针杂交细胞的平均荧光强度减去阴性对照组细胞的平均荧光的差值。端粒长度与端粒平均荧光强度成正比，所以用端粒平均荧光强度检测端粒长度变化。如图2、图3所示，结果分析：图2的TRAP-ELISA检测法指出空白对照组未见端粒酶的表达，培养基-1、培养基-2和培养基-3可见弱到非常弱的端粒酶的表达，这种弱表达随着培养代数的增加变得更弱，甚至停止。相反，本发明的特效培养基-3可明显诱导端粒酶的表达，并有随着时间延长而加强的趋势。同样，流式荧光原位杂交法(Flow-Fish)检测结果也表明本发明的特效培养基-3可明显诱导端粒变长。而其它培养条件不能诱导端粒长度的增加。这些研究分析表明本发明的特效培养基-3确实可以解决间充质干细胞在长期传代培养中发生衰老和活力下降等质量问题。4)人脂肪间充质干细胞中衰老基因的测定一些研究已经报道当细胞衰老时，会检测到数种基因的高表达如β-半苷酶、p16、p21、p65、INK4和p53等，这些基因的高表达能诱导细胞的衰老或/和凋亡。相反，一些长寿基因(如sirt基因家簇和nrf2等)的表达可使细胞获得对抗衰老或/和凋亡，使细胞能更好的存活和生长。具体操作：RT-PCR方法检测一些与衰老有关基因的mRNAs表达水平。利用Trizol提取各组间充质干细胞总RNA，并测定RNA浓度。按实验室常规方法进行逆转录和定量PCR。分别取2×106各组间充质干细胞，置于1.5mL离心管中；加人1mLTrizol，冰浴充分匀浆，室温静置5min；12000r/min，4℃离心10min，将上清转移到新的离心管中。每管中加入200ul氯仿，涡旋仪剧烈涡旋30s，冰盒放置3min；12000r/min离心15min，取上层无色的水相；加人200ul异丙醇，反复颠倒混匀，室温静置20min；12000r/min离心10min，保留沉淀；加入预冷的1mL75％的乙醇，涡旋仪振荡混匀；4℃下以7500.r/min离心5min，小心去除上清，将RNA沉淀置于超净台通风干燥处理10min；每管中加入30ul去离子水溶解RNA沉淀，-70℃冻存备用。采用M-MLV逆转录酶反转录mRNA后，进行Real.timePCR检测，所有操作均按试剂说明书进行。RT-PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，36个循环，72℃终延伸7min。应用2-ΔΔCT法计算不同mRNA在各组间充之干细胞中的表达，GAPDH为内参对照，实验重复3次。结果分析：如图4所示，比较了培养基-3和培养基-4对传代4和传代12的间充质干细胞中5种不同基因表达的影响。结果显示培养基-4可诱导4种与衰老有关的基因即β-半乳糖苷酶、p16，p21和p65的表达在传代4间充质干细胞中轻微升高，而在传代12代的干细胞中明显升高。同时引起抗衰老基因sirt1和nrf2的表达降低。与其相反，本发明的培养基-3并不诱导传代4和传代12间充质干细胞中与衰老有关的基因的高表达(见图4)，但却能引起长寿基因sirtl和nrf2的显著高表达。这充分展示了本发明的培养基-3具有抗衰老和维持细胞于正常状态的潜能，能够避免含血清培养基可能引起干细胞分化、衰老和凋亡等诸多问题。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3