新的7β‑羟基类固醇脱氢酶基因Y1‑b‑1的制作方法

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及一种新的7β-羟基类固醇脱氢酶基因y1-b-1。

背景技术：

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(hydroxysteroiddehydrogenase，hsdh)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-hsdh联合差向异构转化鹅去氧胆酸(chenodeoxycholicacid，cdca)合成熊去氧胆酸(ursodesoxycholicacid，udca)。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholicacid，tcdca)转化为牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholicacid，tudca)。

hsdh的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道hsdh还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。hsdh所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-hsdh在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，genbank中登记的功能已经确认的7α-hsdh共有5个，它们分别来自于bacteroidesfragilis、clostridiumscindens、clostridiumsordellii、clostridiumabsonum和escherichiacoli；来自clostridiumabsonum和collinsellaaerofaciens的7β-hsdh基因也已经成功被克隆。

酶的活性和热稳定性是决定能否投入工业生产的重要参数，现有的羟基类固醇脱氢酶的活性和稳定性还不能同时满足工业生产的需求，因此，需要进一步寻找和开发新的适用于工业大规模生产的羟基类固醇脱氢酶。

技术实现要素：

本发明提供一种新的7β-羟基类固醇脱氢酶基因，该基因编码的7β-羟基类固醇脱氢酶与现有的撒丁岛梭菌7β-hsdh相比，在37℃条件下具有更好的热稳定性，具有很大的工业应用前景。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种7β-羟基类固醇脱氢酶，其特征在于，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

编码所述7β-羟基类固醇脱氢酶的基因。

所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

一种表达盒，其特征在于，包含任一所述基因。

一种载体，其特征在于，包含任一所述基因或所述表达盒。

一种重组细胞，其特征在于，包含任一所述基因或所述表达盒或所述载体。

制备所述7β-羟基类固醇脱氢酶的方法，其特征在于，在能够成功诱导蛋白表达的条件下培养所述重组细胞并分离得到7β-羟基类固醇脱氢酶。

一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含所述7β-羟基类固醇脱氢酶。

所述催化剂还包括与所述7β-羟基类固醇脱氢酶同时使用时能够提高酶催化效率或增加酶稳定性的其它试剂。

一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其特征在于，使用所述7β-羟基类固醇脱氢酶或所述催化剂与反应底物在15-37℃、ph6.0-11.0条件下进行催化反应。

本发明利用宏基因组测序技术从四川黑熊保护及孵育基地的一头健康黑熊的粪便样品中分离出一种新的7β-羟基类固醇脱氢酶基因，命名为7β-hsdhy1-b-1，其核苷酸序列如seqidno.2所示。该基因编码一种新的7β-羟基类固醇脱氢酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示，能够催化熊去氧胆酸(udca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)的7位羟基的差向异构，使其生成鹅去氧胆酸(cdca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)的中间体7-酮石胆酸(7k-lca)、牛磺7-酮石胆酸(t7k-lca)。

本发明分离的7β-hsdhy1-b-1基因，其表达产物7β-hsdhy1-b-1酶蛋白，与现有的撒丁岛梭菌clostridiumabsonum中的7β-羟基类固醇脱氢酶相比，催化底物udca或tudca的比活力大小相当，但具有更好的热稳定性，特别是在37℃下，本发明分离的7β-羟基类固醇脱氢酶在12小时后还具有40％的活性，而撒丁岛梭菌的7β-羟基类固醇脱氢酶已经全部失活。

本发明提供的载体，可以是克隆载体，包含7β-hsdhy1-b-1基因和质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含7β-hsdhy1-b-1基因以及能够使蛋白成功表达的其它元件。

本发明提供的重组细胞，可以是包含克隆载体的重组细胞，例如e.colidh5α；也可以是包含表达载体的细胞，在适当的条件下培养细胞，例如，加入适量的iptg，16℃诱导7β-hsdhy1-b-1的表达。

本发明提供一种催化剂，其有效成分包括本发明的7β-hsdh。所述催化剂也可以与其它适合的催化剂同时使用，从而提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

本发明的7β-hsdhy1-b-1，在15-37℃、ph6.0-11.0的反应条件下能够催化tudcac7β-羟基的羰基不对称还原反应。

附图说明

图1.本发明分离的7β-hsdh基因与撒丁岛梭菌7β-hsdh基因的序列比对结果；

其中，1为现有的撒丁岛梭菌7β-hsdh基因的核苷酸序列，2为本发明分离的7β-hsdh基因的核苷酸序列。

图2.本发明分离的7β-hsdh基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图3.本发明7β-hsdhy1-b-1酶蛋白的sds-page电泳图。

图4.撒丁岛梭菌7β-hsdh酶蛋白的sds-page电泳图。

图5.本发明7β-hsdhy1-b-1的酶稳定性实验结果；

其中，横坐标为测定时间，纵坐标为相对酶活。

图6.撒丁岛梭菌7β-hsdh的酶稳定性实验结果；

其中，横坐标为测定时间，纵坐标为相对酶活。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

生物材料：

e.colidh5α，e.colibl21细胞为本实验室保存，可商购获得。

实验试剂：

粪便dna基因组提取试剂盒，购买自德国qiagen公司，货号：51604；

琼脂糖凝胶回收试剂盒，购买自omega，货号：d2500-01；

pcr一步定向克隆试剂盒，购买自左岸蛋白科技有限公司，货号：nr001；

载体pgex-6p-1，购于上海生工公司；

质粒提取试剂盒omegaplasmidminikiti，购买自omega公司，货号：d6943；

lysisbuffer(裂解缓冲液)，配制而得，10mmph7.3的pbs含有pmsf0.1mm、亮肽素leupeptin0.5mg/ml；

glutathionesepharose4b，购买自gehealthcare，货号：10223836；

prescissionprotease，购买自genscript公司，货号：z02799-100；

bca试剂盒，购买自beyotime公司，货号：p0006；

tcdca，购买自百灵威科技公司，货号：330776。

dna提取所使用的黑熊粪便，本实验室有冻存。

以下实施例中未特别说明的生物化学试剂，均为本领域常规试剂，可根据本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级即可。

实施例1.新7β-hsdh基因的分离

1.基因的发现

使用灭菌处理的药匙，采取了四川黑熊保护及孵育基地的一头健康黑熊的粪便样品，并干冰保存运回实验室。使用qiagen粪便dna基因组提取试剂盒提取了该头黑熊粪便的总dna，交由上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。用现有的撒丁岛梭菌7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hsdh)编码基因序列(genebank号no.aet80684)与宏基因组测序数据进行对比，发现了一种新的7β-hsdh基因，命名为7β-hsdhy1-b-1，其核苷酸序列如seqidno.2所示。序列比对结果表明，这种新的7β-hsdh基因与现有的撒丁岛梭菌7β-hsdh基因序列的一致性为56.40％(图1)。

2.基因的分离

(1)引物设计：对测序获得的7β-hsdhy1-b-1基因序列设计引物，得到的引物核苷酸序列如下：

y1-b-1-f：atgaatatgaatttaagagaaaaatatggag

y1-b-1-r：ttatttctcatagaaagaccccatatat

(2)pcr扩增：以黑熊粪便的总dna为模板，采用步骤(1)获得的引物，按照下列pcr体系和程序进行扩增。

pcr体系：

5xfastpfu缓冲液........................2μl

2.5mmdntps..........................2μl

y1-b-1-f(5μm)..........................2μl

y1-b-1-r(5μm)............................2μl

模板dna...........................20ng

fastpfu聚合酶.......................1μl

补ddh2o至...............................20μl

pcr程序：

a.94℃预变性3min，5个循环；

b.94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，27个循环；

c.72℃延伸10min。

(3)琼脂糖凝胶电泳：使用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，结果如图2所示，出现大小约为800bp的条带。

(4)切胶回收：在紫外灯下切取目的条带，使用omega琼脂糖凝胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书中的操作步骤回收目的基因片段。

实施例2.7β-hsdhy1-b-1基因的表达

1.载体构建：

使用于左岸蛋白科技有限公司购买的pcr一步定向克隆试剂盒，按照试剂盒说明书中的操作步骤，将7β-hsdhy1-b-1基因的序列全长连接在载体pgex-6p-1上。

2.转化e.colidh5α感受态细胞

1)感受态细胞e.colidh5α放置冰上融化。

2)将步骤1所得的连接体系加入融化的e.colidh5α感受态中，冰上30min。

3)42℃热处理90s。

4)冰上静置2min。

5)加入lb培养基600μl，摇床温度37℃，摇床摇速150rpm，时间45min。

6)吸取200μl菌液，涂布于氨苄亲霉素(amp⁺)抗性lb平板培养基上。

7)37℃过夜培养。

3.阳性克隆鉴定：

(1)挑选白色单菌落，接种于lb/amp⁺的液体培养基中，200rpm、37℃培养8小时，8000rpm离心5min获取菌体。

(2)使用omegaplasmidminikiti质粒提取试剂盒，按照说明书中的操作步骤提取质粒。

(3)使用克隆引物y1-b-1-f和y1-b-1-r，按照实施例1步骤(2)中的pcr体系和程序进行pcr验证，确定基因片段成功插入pgex-6p-1载体中。

(4)将鉴定正确的重组质粒送上海生工公司测序，将测序结果比对正确的重组质粒pgex-6p-1/7β-hsdhy1-b-1作为表达载体。

4.7β-hsdhy1-b-1基因的表达

(1)质粒转化e.colibl21细胞

a.-80℃中取出e.colibl21感受态细胞冰上放置。

b.加入2μl表达载体pgex-6p-1/7β-hsdhy1-b-1，冰上放置30min。

c.42℃热处理90s。

d.冰上放置2min。

e.复苏，加入600μllb培养基，于37℃，150rpm摇床培养45min。

f.吸取200μl菌液，涂布于amp⁺lb平板培养基上。

g.37℃培养过夜。

(2)蛋白表达与纯化

a.将菌种接种入无菌lb液体培养基中，氨苄青霉素终浓度为50μg/ml，37℃，180rpm摇床培养。

b.待菌液od600≈0.8时，加入终浓度为0.2mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，16℃诱导过夜(12h)。8000rpm，5min收集菌体。

c.按1l培养体系加30mllysisbuffer的比例重悬菌体，超声破菌至澄清。12000rpm离心20min。取上清。

d.将上清与glutathionesepharose4b结合，填料使用的比例为每升培养体系使用5ml填料，4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬。

e.结合完毕后，500rpm，5min沉淀填料。填料用4℃预冷pbs冲洗3-5个柱体积，去除杂蛋白。

f.加入prescissionprotease酶切缓冲液，加入prescissionprotease酶。

g.4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出。

h.将所得样品进行sds-page，鉴定其分子量大小及纯度，使用bca试剂盒测定纯化蛋白的浓度。

结果如图3所示，获得的7β-hsdhy1-b-1酶蛋白纯度很高，呈单一条带。以相同的方法对撒丁岛梭菌7β-hsdh进行蛋白表达，结果如图4所示，也获得了单一条带的撒丁岛梭菌7β-hsdh。

实施例3.7β-hsdhy1-b-1基因的功能鉴定

1.酶活测定

步骤：室温条件下，向比色皿中加入158ul50mmtris-hcl(ph＝8.0)溶液，20ul50mm的nadp⁺溶液，再向其中加入2ul实施例2步骤4获得的7β-hsdhy1-b-1酶蛋白溶液，最后加入20ul50mm的udca或tudca的dmso溶液，充分吹打混匀。混匀后立即置于分光光度计中调零。开始计时，每分钟读取一次340nm处光吸收的变化值。

与此同时，按照上述相同的方法测定撒丁岛梭菌7β-hsdh的酶活。

结果表明，本发明分离得到的7β-hsdhy1-b-1基因的产物为7β-羟基类固醇脱氢酶，能够催化熊去氧胆酸(udca)、牛磺熊去氧胆酸(tudca)的7位羟基的差向异构，使其生成鹅去氧胆酸(cdca)、牛磺鹅去氧胆酸(tcdca)的中间体7-酮石胆酸(7k-lca)、牛磺7-酮石胆酸(t7k-lca)。该酶对udca、tudca的比活力如表1所示。

表1.本发明7β-hsdhy1-b-1与撒丁岛梭菌7β-hsdh的比活力比较

比活力(u/mg)定义：在上述反应条件下，每毫克蛋白所含的酶活力单位数。

表1数据显示，本发明7β-hsdhy1-b-1酶蛋白对udca、tudca的比活力与撒丁岛梭菌7β-hsdh相当。

2.酶稳定性实验：

按照下列步骤，同时测定本发明7β-hsdhy1-b-1酶蛋白和撒丁岛梭菌7β-hsdh酶蛋白的稳定性。

(1)将新制的酶液分为三份，分别置于4℃、25℃和37℃的干浴恒温器中。

(2)每隔4个小时测定一次酶活，酶活测定方法同前。

(3)测定到48个小时的酶活后，实验结束。以酶活最高值为100％，折算相对酶活。

结果表明，本发明7β-hsdhy1-b-1在37℃条件下的热稳定性明显优于撒丁岛梭菌7β-hsdh，在12小时后本发明7β-hsdhy1-b-1还具有40％的活性，而撒丁岛梭菌的7β-hsdh已经全部失活。

sequencelisting

<110>重庆大学

<120>新的7β-羟基类固醇脱氢酶基因y1-b-1

<130>p1632011-cqd-cq-txh

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<212>prt

<213>artificialsequence

<220>

<223>本发明7β-羟基类固醇脱氢酶y1-b-1的氨基酸序列

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metasnmetasnleuargglulystyrglyglutrpglyileileleu

151015

glyalathrgluglyvalglylysalaphecysglulysilealaala

202530

glyglymetasnvalvalmetvalglyargarggluglumetleulys

354045

aspleuglyarggluileserasnlystyrglyvalgluhisleuval

505560

ilelysalaaspphealaaspproserservalasplysilepheglu

65707580

glnthrlysgluleuaspmetglyphemetsertyrvalalacysphe

859095

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100105110

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serleuthrglyileserserserprotyrasnalaglntyrglyala

145150155160

glylyssertyrileleulysleuthrglualavalalacysgluala

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180185190

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195200205

valmetlysseralaleuthrproglualacysvalaspglualaphe

210215220

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225230235240

lysasnvalhisasntrplysalaasnhisthralaaspglutyrile

245250255

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260265

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<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>本发明7β-羟基类固醇脱氢酶基因y1-b-1的核苷酸序列

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atgaatatgaatttaagagaaaaatatggagaatggggaattatattaggtgctactgaa60

ggtgtaggaaaagccttttgtgaaaaaatcgctgctggtggaatgaatgtagtaatggta120

ggcagaagagaggagatgttaaaggacttaggtagagaaataagtaataaatatggagtt180

gaacatttagtaataaaggcagattttgcagatccatcatctgtggacaagatatttgag240

caaactaaggaattagatatgggattcatgtcttatgttgcttgcttccatacatttggt300

aagttacaagatacgccttgggaaaaacatgagcaaatgataaatgtaaatgttattaca360

ttttttaaatgtttttatcattatatgggtatatttgcaaagcaagatagaggggctatt420

ataaatgtatcatctcttactggaataagtagttcaccttataatgctcaatatggtgca480

ggaaaatcatatatattaaagttaacagaagcagttgcttgtgaagctgctaagacaaat540

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cctggtggaccagctggagaagcagtaatgaaatcagcattaactccagaggcatgtgtt660

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aaaaatgtacacaactggaaagctaatcatacagctgatgagtatataacatatatgggg780

tctttctatgagaaataa798

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<223>pcr扩增本发明7β-hsdh基因y1-b-1的正向引物

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<212>dna

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<220>

<223>pcr扩增本发明7β-hsdh基因y1-b-1的反向引物

<400>4

ttatttctcatagaaagaccccatatat28