一种裸鼹鼠睾丸间质细胞分离纯化及培养方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，是一种裸鼹鼠睾丸间质细胞分离、纯化及培养方法。

背景技术：

睾丸间质细胞(Leydig cell)分布于睾丸生精小管之间的疏松结缔组织中，占所有睾丸组织内细胞数量的2％～4％，其主要功能是合成和分泌睾酮，其分泌的睾酮占血浆睾酮总量的95％(Dobashi M，Fujisawa M，Yamazaki T，et a1.Inhibition of steroidogenesis in Leydig cells by exogenous nitric oxide Occurs independently of steroidogenic acute regulatory protein(star)mRNA[J].Arch Androl，2001，47(3)：203-209.)。鉴于睾丸间质细胞所具有的重要作用，建立一套稳定的分离、纯化和原代培养间质质细胞的方法，并保持该细胞分泌睾酮的活性，对于进一步开展睾丸间质细胞相关功能的研究具有重要意义。

裸鼹鼠是一种原产于东非部分地区的真社会性啮齿类动物，其生殖能力可以在长达30年的寿命中保持恒定不变，群落中动物数量可以达到300个以上(Braude S.Dispersal and new colony formation in wild naked molerats:evidence against inbreeding as the system of mating[J].Behav Ecol.2000(11):7-12.)。无论在野外自然生长还是在实验室驯养条件下，裸鼹鼠的生殖能力仅限定于一只专司繁殖的雌鼠和3-5个参与繁育的雄鼠，其余雄鼠均丧失生殖能力(Jarvis J.Eusociality in a mammal:cooperative breeding in naked mole-rat colonies[J].Science.1981,4494(212):571-573.)。虽然裸鼹鼠群落中的雄性个体都具备完整的生殖系统结构，但是血清学激素水平检测发现无生殖能力的雄性裸鼹鼠体内睾酮等(Jarvis J,Alexander R.The Biology of the Naked Mole-Rat[Z].Princeton Univ,1991275-336.)水平较低，精子数量、形态和运动能力显著低于可育个体，这一表型与男性不育患者的症状完全吻合。裸鼹鼠群体内部雄性个体之间天然存在生殖能力的巨大差别使其成为研究人类不孕不育疾病的理想模型。但是目前国际上的研究仅限于表型研究，尚未对裸鼹鼠体内睾酮水平低下的机制展开研究，这其中生物学机制的一旦被阐明，将在临床医学领域有着广阔的应用前景，尤其对男性不育性疾病的预防和治疗借鉴意义重大。

关于间质细胞的原代培养，目前国内外一般都采用Klinefelter等(Klinefeher GR，Hall PF，Ewing LL.Effect of luteinizing hormone deprivation in situ on steroidogenesis of rat Leydig cells purified by a muhistep procedure[J].Biol Reprod，1987，36(3)：769—783.)介绍的方法，但由于该方法对实验条件要求苛刻，一般实验室难以达到。而目前更没有查阅到关于裸鼹鼠睾丸间质细胞的体外培养方法研究。主要原因在于：1)裸鼹鼠是一种变温动物，其体细胞离体培养的温度有待摸索，并且其不恒定的机体代谢速率导致其体细胞体外培养基区别于普通的大鼠或小鼠；2)裸鼹鼠睾丸与附睾在功能上存在一定程度的重合，睾丸在产生精子的同时还作为储存精子的场所，所以为间质细胞的分离带来了一定的难度；3)裸鼹鼠睾丸内间质成分比例高，间质细胞分离方法不同于其他啮齿类动物；4)裸鼹鼠已经适应了外界低氧的环境，所以其体细胞离体培养环境中的氧气浓度区别于常氧环境中生活的动物，并且需要摸索。

本实验室通过改良，采用酶消化和Percoll连续密度梯度法分离纯化裸鼹鼠睾丸间质细胞，并采用抗胆固醇侧链裂解酶抗体(P450SCC)对所得到的间质细胞进行鉴定(Li Guangyu,Lan Haiyan,Liang Jihong,Mo yuncong,Deng Xuelian,Lin Chunyu,Su Wenyong.2016.MCL1is a key regulator of steroidogenesis in mouse Leydig cells.Mol Reprod Dev 83(3):226-35.)，同时连续监测了间质细胞分泌睾酮的能力。该方法的建立将为今后研究间质细胞的功能奠定了良好的基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种裸鼹鼠睾丸间质细胞的分离纯化和培养方法，以方便、高效的获得纯度高、状态好的裸鼹鼠睾丸间质细胞，为体外建立裸鼹鼠睾丸间质细胞提供技术支持，同时为体外研究裸鼹鼠睾丸间质细胞的功能及生物学特性提供奠定理论基础。

为了实现上述目的，本发明的裸鼹鼠睾丸间质细胞的分离纯化方法，包括以下步骤：

A、向裸鼹鼠睾丸组织中加入消化液进行消化，消化结束后，加入等体积的消化终止液终止消化；将终止消化后的浑浊液(含有细胞及组织块)经200目细胞筛网过滤，以得到单细胞悬液；然后，将细胞悬液置于含有3个密度梯度Percoll液面上进行离心；离心后，在管内可见3条细胞带，收集35％和60％之间的细胞带，用PBS洗一遍后加入新鲜的培养液制得细胞悬液；

B、将细胞调制适宜的密度接种在60mm培养皿中，于三气培养箱中进行培养，细胞大部分贴壁后更换培养液；培养7天后进行细胞鉴定，中间每隔3天换一次培养液。

其中，所述步骤A中的裸鼹鼠睾丸组织可通过以下步骤制备得到：动物脱臼处死后，无菌条件下取出睾丸，剥除白膜之后将睾丸两侧各剪一个小口。将睾丸置于无菌PBS中，用镊子将睾丸内的精液尽量挤出，如此重复3次。将尽量去除精子的睾丸组织置于新鲜的1.8ml冰浴PBS中，用剪刀剪至1mm³大小。

进一步，所述步骤A中的消化条件为：I型胶原酶终浓度为0.02mg/ml，DNA酶I终浓度为0.005％(质量体积比)，温度为32℃，时间为30分钟，转速为30rpm/min。

进一步，所述步骤A中的消化终止液为含有终浓度为0.005％(质量体积比)DNA酶I的培养液。

进一步，所述步骤A中的培养液为：DMEM培养基+10％(V/V)胎牛血清+1％(V/V)青链霉素+1％(V/V)谷氨酰胺。

进一步，所述步骤A中的Percoll浓度梯度依次为，自上而下，分别放置20％、35％、60％各2.5ml。

进一步，所述步骤A中的离心条件为4℃，3000rpm离心30min。

进一步，所述步骤B中的细胞密度为5-6×10⁶个/ml。

进一步，所述步骤B中的三气培养箱的参数设置为：温度控制在34℃，氧浓度为10％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％。

本发明的有益效果在于：

1、综合使用多种消化分离方法从裸鼹鼠睾丸组织分离间质细胞，摸索出了适于变温的啮齿类哺乳动物裸鼹鼠睾丸间质细胞的合理培养方法。我们发现10％氧浓度条件下，细胞状态能够得到较好的保持，并能够保持增长；

2、35％-60％的Percoll浓度梯度下，能够得到较高纯度的裸鼹鼠睾丸间质细胞。综上所述，本发明方法能够简便、高效、经济的获得大量功能活性正常的裸鼹鼠睾丸间质细胞，低氧条件下的培养能够保证这种细胞在离体环境中依然能够保持在体状态下的生物学特性，从而便于直接在纯净的体外细胞培养模型中进一步研究裸鼹鼠睾丸间质细胞的特殊生理功能，从而为探索其中的生物学机制并应用于临床相关领域提供重要的理论依据。

附图说明

图1为普通光学显微镜下的裸鼹鼠睾丸间质细胞。

图2为体外培养的裸鼹鼠睾丸间质细胞免疫细胞化学染色鉴定。其中A图为P450SCC抗体染色图，B是Hoechst染色图，C是AB两张图的重叠。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1、实验材料

12月龄的清洁级裸鼹鼠由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。将裸鼹鼠脱臼出死后，用75％酒精进行皮肤消毒。从裸鼹鼠腹部下方剪开，从靠近背侧的地方取双侧睾丸。

I型胶原酶、DNA酶I购自Solarbio生物科技有限公司，青链霉素混合液等购自Sigma公司，DMEM、澳洲来源胎牛血清等购自Thermo Fisher Scientific公司，100目细胞筛网购自BD公司，培养皿购自Corning公司。

睾丸间质细胞培养基成分为DMEM+10％(V/V)胎牛血清+1％(V/V)青链霉素+1％谷氨酰胺。

2、裸鼹鼠睾丸间质细胞分离纯化及培养方法

表1

*P＜0.05，与0.002mg/ml组相比；#P＜0.05，##P＜0.01，与0.02mg/ml组相比。

如表1数据所示，优选的I型胶原酶浓度为0.02mg/ml。

表2

*P＜0.05，与5％氧浓度组相比；#P＜0.05，与10％氧浓度组相比。

如表2数据所示，间质细胞优选的氧浓度为10％。

①动物脱臼处死后，无菌条件下取出睾丸，剥除白膜之后将睾丸两侧各剪一个小口。将睾丸置于无菌PBS中，用镊子将睾丸内的精液尽量挤出，如此重复3次。将尽量去除精子的睾丸组织置于新鲜的1.8ml冰浴PBS中，用剪刀剪至1mm3大小。然后加入消化液(I型胶原酶终浓度为0.02mg/ml，DNA酶I终浓度为0.005％(质量体积比))，于32℃恒温振荡摇床中消化30min，摇床转速为30rpm/min。消化结束后，加入等体积的消化终止液(终浓度为0.005％DNA酶I的培养液)终止消化。将终止消化后的浑浊液(含有细胞及组织块)经200目细胞筛网过滤，以得到单细胞悬液。然后，将细胞悬液置于含有3个密度梯度Percoll(自上而下，分别放置20％、35％、60％各2.5ml)液面上进行离心。离心后，在管内可见3条细胞带，收集35％和60％之间的细胞带，用PBS洗一遍后加入新鲜的培养液制得细胞悬液。

②将细胞调制5-6×10⁶个/ml后接种在60mm培养皿中，于三气培养箱(温度控制在34℃，氧浓度为10％，二氧化碳浓度为5％，湿度为96％)中进行培养，细胞大部分贴壁后更换培养液。培养7天后进行细胞鉴定，中间每隔3天换一次培养液。

3、采用本发明所得的裸鼹鼠睾丸间质细胞的鉴定

利用4％多聚甲醛对处于增殖培养基中的睾丸间质细胞进行固定，并结合形态学鉴定、免疫细化化学等方法进行鉴定。

①细胞形态学鉴定：结果如图1所示，光镜下，睾丸间质细胞胞体呈梭形或不规则椭圆形，胞体折光度较强，胞体周围有一圈明显的光晕，从胞体向周围伸出二极或三极突起。

②免疫细胞化学鉴定：结果如图2所示，利用4％多聚甲醛将纯化的裸鼹鼠睾丸间质细胞固定，然后利用特异性抗P450SCC的抗体进行免疫细胞化学染色。结果显示，细胞能够保持PSC450SCC阳性。

根据上述实验结果，本发明分离纯化的裸鼹鼠睾丸间质细胞具备典型的间质细胞形态，呈P450SCC阳性，具有双极或三极突起，并在含血清培养基中能够保持良好的增殖状态。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。