本发明属于医药领域，涉及多肽药物的制备，具体涉及一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途。
背景技术：
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势，年平均增长近2％。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型，肺癌组织类型不同，其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类，常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同，预后效果也不同。因此，为了提高治疗效果，肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。
小细胞肺癌占肺癌总数的20％-25％，对化学治疗及放射治疗敏感，但易复发和发生远处转移，文献报道局限期小细胞肺癌的5年生存率为7％，广泛期仅为1％。近几年提出的肿瘤干细胞学说认为，在大部分肿瘤中潜伏着的极少量肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的根源。
生物活性肽(Biologically active peptides,BAP)是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质，如抗肿瘤、抗菌、抗高血压、抗病毒以及提高免疫力等，这些物质广泛存在于动物、植物以及微生物中。生物活性肽主要有4种来源，分别为蛋白酶解多肽、微生物发酵代谢多肽、天然活性多肽以及化学合成多肽。
由于近几年来恶性肿瘤发病率的不断提高，而传统的化疗药物不仅毒副作用大而且治疗效果并不理想，因此，生物活性肽凭借其活性高、副作用小、针对性强的优势得到了国内外科研工作者的研究和关注。目前已经从多种生物中提取得到了抗肿瘤活性肽，其中动物来源的活性肽展现了广阔的前景。Hsu等分别用木瓜蛋白酶和蛋白酶XXⅢ酶解金枪鱼肉，分离纯化后得到了两种抗肿瘤活性较好的多肽(Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines.Process Biochemistry,2006,41:1217-1222)。这两条多肽对乳腺癌细胞MCF-7的IC50值达到了8.1和8.8μM。Leng等人通过SephadexG-25、FPLC并结合MALDI-TOF成功的从壳蛤中分离出了对胃癌细胞BGC-823有明显抑制作用的分子量为3147u活性肽，当肽的浓度为4.0μg/mL时其对癌细胞的抑制率达到了60％(Inhibitory effects of anticancer peptide from Mercenaria on the BGC-823 cells and several enzymes.FEBS Letters,2005,579:1187-1190)。另外还分别从贻贝、泥蚶、海鞘、牡蛎等动物体内得到了抗肿瘤肽，这些都为以后动物体内抗肿瘤肽的提取奠定了基础。
知了猴又称知了龟、爬蚱等，是金蝉的成熟若虫，蛋白含量非常高，具有较高的食用和药用价值。然而，目前对于知了猴多肽的提取、分离纯化及抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移方面的研究鲜有报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种酶解多肽，以知了猴为原料，由如下方法制备：
将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，8.3-8.7；酶解温度，53-57℃；酶解时间，9-11小时；
酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；
冷却后，8000-10000rpm离心20-30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；
将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。
优选地，所述不同截留分子量的超滤膜包括截留分子量分别为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜。
优选地，酶解多肽的分子量范围为3000-5000u。
优选地，酶解多肽的分子量范围为1000-3000u。
优选地，加热使碱性蛋白酶灭活的方法为：在80-90℃条件下水浴8-12分钟。
优选地，加热使碱性蛋白酶灭活的方法为：在85℃条件下水浴10分钟。
优选地，酶解条件为：pH值，8.5；酶解温度，55℃；酶解时间，10小时。
优选地，离心条件为：9000rpm离心25分钟。
优选地，所述碱性蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.4-0.5％。
上述酶解多肽在制备预防小细胞肺癌患者化疗后出现肿瘤转移的药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的酶解多肽可以有效抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞样细胞侵袭和转移，毒理实验研究证明酶解多肽无明显毒副作用。肿瘤干细胞学说认为，在大部分肿瘤中潜伏着的极少量肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的根源，因此，本发明提供的酶解多肽有望开发成预防小细胞肺癌患者化疗后出现肿瘤转移的药物。
附图说明
图1为酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移、侵袭的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。
实施例1酶解多肽的制备
一、实验材料
1、仪器试剂
超滤杯和超滤膜购于上海摩速科学器材有限公司；
碱性蛋白酶37017(1:2.5U/g)购于诺维信公司。
2、实验样品
收集刚出土上树的新鲜知了猴，保存在水中，于-20℃冻存。使用前于室温条件自然化冻。
二、实验方法
1、酶解方法
将知了猴洗净后绞成肉糜，取10g肉糜置于50mL超纯水中，加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.45％，酶解条件为：pH值，8.5；酶解温度，55℃；酶解时间，10小时；
酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；
冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉。
2、纯化方法
将冻干粉用超纯水溶解(1g冻干粉加10mL超纯水)，然后依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)即得不同分子量大小的酶解多肽。
超滤过程中控制CO2的压力使其小于0.25MPa。
三、实验结果
得到五个不同分子量范围的酶解多肽，分子量范围分别为：
酶解多肽1，分子量为10000u以上；
酶解多肽2，分子量介于10000u和5000u之间；
酶解多肽3，分子量介于5000u和3000u之间；
酶解多肽4，分子量介于3000u和1000u之间；
酶解多肽5，分子量为1000u以下。
实施例2酶解多肽对小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞侵袭和转移的影响
本实施例实验方法参照文献方法操作(陈恭让等，紫花牡荆素抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞样细胞侵袭和转移的研究，中南药学2014年10月第12卷第10期)，并使用该文献中公开的紫花牡荆素作为阳性药。
一、实验方法
1、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系的培养和传代
人小细胞肺癌NCI-H446细胞系购自上海奥陆生物科技有限公司。用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的高糖DMEM培养基，在37℃、5％CO2的饱和湿度条件下培养。细胞贴壁生长，约1-2d长满瓶底90％。用0.25％胰蛋白酶消化后，重新接种至新培养瓶，继续培养，取对数生长期细胞用于实验。
2、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞培养
取对数生长期NCI-H446细胞系细胞，消化成单细胞悬液，800rpm离心5min弃上清液，加入PBS洗涤2次，再次离心后弃上清液，以2×104个/孔接种于超低黏附6孔细胞培养板，并加入2mL干细胞条件培养基(添加100IU/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、2％不含维生素A的B27添加物、0.4％牛血清白蛋白、5μg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基)悬浮培养。每隔2d加入1mL干细胞条件培养基。约5d，增殖形成60μm大小的人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞。
3、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞传代培养
收集上述直径达60μm的肺癌干细胞，500rpm离心5min，弃上清液，用PBS洗涤1次后加入1mL 0.05％胰蛋白酶消化3min。用干细胞条件培养基终止消化，并用移液枪吹打至单细胞悬液，计数。以每孔2×104个细胞重新接种于超低黏附6孔细胞培养板中，加入2mL干细胞条件培养基悬浮培养。第3代肺癌干细胞用于后述实验。
4、藻红蛋白(PE)荧光标记CD133抗体流式细胞术分析
收集人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞和第3代肺癌干细胞，消化成单细胞悬液。用1mL4％多聚甲醛固定10min，加入400μL 0.5％BSA缓冲液重悬。置4℃冰箱中封闭10min，计数并调整细胞密度至5×105个/200μL，分装于EP管中。分别加入2μLPE标记的抗人CD133抗体和2μL PE标记的抗IgG2b同型对照抗体，置于4℃冰箱中避光孵育过夜。13000rpm离心10s并用生理盐水清洗1次，吹打均匀后用流式细胞仪检测平均荧光强度值和CD133+细胞百分率。每管计数1×105个，实验重复3次。
5、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞和肺癌干细胞的转移、侵袭能力
实验采用Transwell小室(侵袭实验采用BD biosciences已铺胶的Transwell小室)。细胞培养小室底部为8μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜，上室分别加入DMEM培养基200μL(含小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞，2×105个/mL)和DMEM/F12培养基200μL(含第3代肺癌干细胞，2×105个/mL及0.1％BSA)。Transwell小室下室分别对应加入500μL含10％胎牛血清的DMEM培养基和含10％胎牛血清的干细胞条件培养基。置37℃培养箱中，孵育48h。取出Transwell小室用PBS洗2遍，棉球擦去上表面未转移的细胞。用0.5mL4％多聚甲醛4℃固定20min，加入0.5mL 0.1％结晶紫染色20min，PBS洗2遍，倒置显微镜下观察。随机选取5个400倍视野，统计视野中转移和侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的转移和侵袭能力，实验重复3次。
6、酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移、侵袭的影响
肺癌干细胞分组：
对照组：用1％DMSO预先处理第3代肺癌干细胞24h；
阳性药组：用紫花牡荆素(3μM，溶于含1％DMSO的干细胞培养基中)预先处理第3代肺癌干细胞24h；
酶解多肽3低剂量组组：用酶解多肽3(5μg/mL，溶于含1％DMSO的干细胞培养基中)预先处理第3代肺癌干细胞24h；
酶解多肽3高剂量组组：用酶解多肽3(10μg/mL，溶于含1％DMSO的干细胞培养基中)预先处理第3代肺癌干细胞24h；
酶解多肽4低剂量组组：用酶解多肽4(80μg/mL，溶于含1％DMSO的干细胞培养基中)预先处理第3代肺癌干细胞24h；
酶解多肽4高剂量组组：用酶解多肽4(160μg/mL，溶于含1％DMSO的干细胞培养基中)预先处理第3代肺癌干细胞24h。
实验采用Transwell小室(侵袭实验采用BD biosciences已铺胶的Transwell小室)。细胞培养小室底部为8μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜，上室分别加入DMEM培养基200μL(含小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞，2×105个/mL)和DMEM/F12培养基200μL(含预处理的第3代肺癌干细胞，2×105个/mL及0.1％BSA)。Transwell小室下室分别对应加入500μL含10％胎牛血清的DMEM培养基和含10％胎牛血清的干细胞条件培养基。置37℃培养箱中，孵育48h。取出Transwell小室用PBS洗2遍，棉球擦去上表面未转移的细胞。用0.5mL4％多聚甲醛4℃固定20min，加入0.5mL 0.1％结晶紫染色20min，PBS洗2遍，倒置显微镜下观察。随机选取5个400倍视野，统计视野中转移和侵袭细胞的相对数目来表示酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移、侵袭的抑制作用。
二、实验结果
1、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞与肺癌干细胞的形态特征
人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞呈梭形贴壁生长，肺癌干细胞呈现典型非黏附三维球状，与文献报道一致。
2、PE荧光标记CD133抗体流式细胞术分析
PE荧光标记的鼠抗人CD133抗体流式细胞术检测结果表明，人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞的CD133+细胞百分率为(4.26±2.41)％；人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞的CD133+细胞百分率为(16.48±4.96)％。两组间CD133+细胞百分率的差异有统计学意义(P＜0.05)。结果表明，人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞高表达干细胞表面标志物CD133+，具有肿瘤干细胞特性，与文献报道一致。
3、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞和肺癌干细胞转移和侵袭能力的比较
Transwell结果表明，人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞比小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞具有更高的体外转移和侵袭能力，见表1。2组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
表1人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞和肺癌干细胞转移和侵袭能力比较
4、酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移、侵袭的影响
Transwell实验结果表明，不同浓度的酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞的体外转移和侵袭能力具有显著的抑制作用，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，结果见表2和图1。
表2酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移、侵袭的影响
上述结果证明，酶解多肽可以显著抑制人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞的转移和侵袭，且分子量范围为3000-5000u的酶解多肽比分子量范围为1000-3000u的酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移和侵袭的抑制作用更强。
实施例3酶解多肽的安全性评价
取昆明种小鼠，体重25-31g，随机分组，采用尾静脉注射和不注射酶解多肽进行毒性对比实验研究。结果表明，酶解多肽3和酶解多肽4在高达600mg/kg的剂量下连续注射45天，无任何毒副作用，心、肝、肾、肺解剖观察均无异常，并且体重均有增加。实验结果见表3。
表3酶解多肽毒性实验
上述实施例证明，本发明提供的酶解多肽可以有效抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞样细胞侵袭和转移，毒理实验研究证明酶解多肽无明显毒副作用。肿瘤干细胞学说认为，在大部分肿瘤中潜伏着的极少量肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的根源，因此，本发明提供的酶解多肽有望开发成预防小细胞肺癌患者化疗后出现肿瘤转移的药物。