一种快速鉴定乳酸菌产生氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的方法与流程

本发明涉及一种快速鉴定乳酸菌产生氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术：

乳酸菌是发酵食品或饮料(例如酱油、发酵香肠、黄酒等)中广泛存在的一种微生物，其代谢产生的乳酸是一种风味物质，因此对发酵起积极作用。但是，最近国内外的研究发现，部分乳酸菌能够分解精氨酸产生瓜氨酸，而瓜氨酸又是广泛存在于发酵食品中的一种致癌物—氨基甲酸乙酯(EC)的一种重要前体物质，尤其在消费者日常食用(饮用)较多的酱油和黄酒中，EC的含量相对较高。瓜氨酸由乳酸菌经精氨酸脱亚胺酶途径降解精氨酸形成，但是并非所有乳酸菌都具有该途径，其存在表现为菌株特异性，即不同菌株降解精氨酸或产生瓜氨酸的能力不尽相同。

乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的编码基因，除了arcA、arcB、arcC、arcD基因，部分乳酸菌如清酒乳杆菌还有arcR(调控基因)，PTP(可能与瓜氨酸分泌和重吸收有关的转运蛋白的编码基因)，不同乳酸菌菌株arc基因簇排列顺序和完整性可能有所不同。研究证明，各乳酸菌菌株降解精氨酸和产生瓜氨酸的能力差异根源在于arc基因簇的多态性。

目前，检测乳酸菌是否产生氨基甲酸乙酯前体瓜氨酸的方法主要是菌株分离后纯培养，然后在含有精氨酸的培养基中生长一段时间(例如在添加精氨酸的MRS培养基中发酵3天)，离心取上清液，使用高效液相色谱检测胞外精氨酸和瓜氨酸的含量，进而确定该菌是否具有产瓜氨酸的能力。此方法耗时较长，不仅需要配制流动相，还需要做标准曲线，检测周期约1周左右，并不是一个快速的检测方法。另一种方法是以简并引物扩增arcA、arcB、、arcC基因的部分序列，该方法快速简便，但是普适性差，主要是用于检测希氏乳杆菌、短乳杆菌、酒酒球菌、戊糖片球菌、肠膜明串珠菌等来源于葡萄酒中的乳酸菌，对于从黄酒中分离的乳酸菌检测效果很差，主要表现为以该引物检测时，许多能够产生瓜氨酸的乳酸菌都不能扩增出arcA和arcB，已有报道的这些引物在实际应用时具有相当大的局限性。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种快速检测乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的方法，所述方法是以乳酸菌基因组DNA为模板，分别用引物对A和引物对B进行PCR，如果能够得到分别为200～300bp、450bp～550bp的PCR产物，那么该乳酸菌具有精氨酸脱亚胺酶途径，否则该乳酸菌不具有精氨酸脱亚胺酶途径。

其中引物对A由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成；所述引物对B由核苷酸序列为SEQ ID NO.3和核苷酸序列为SEQ ID NO.4的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。

在一种实施方式中，所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、弯曲乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、乳杆菌、短乳杆菌、魏斯氏菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、棒状乳杆菌、柠檬明串珠菌、假肠膜明串珠菌、肠膜明串珠菌。

在一种实施方式中，所述200～300bp具体是指250bp；所述用450bp～550bp具体是指500bp。

在一种实施方式中，所述PCR的反应体系为：DNA模板<500ng，上游引物和下游引物各0.2～1μM，10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP4μL，灭菌蒸馏水补至50μL。

在一种实施方式中，所述PCR的反应条件为：预变性，94℃，4min；变性，94℃，35s；退火，50℃，35s，延伸，72℃，40s；变性、退火、延伸进行30个循环，继续延伸，72℃，10min，最后10℃保持直到取出。

在一种实施方式中，所述PCR产物的检测是使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

本发明的第二个目的是提供一种组合引物对，包括引物对A和引物对B；其中引物对A由核苷酸序列为SEQ ID NO.1和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成；所述引物对B由核苷酸序列为SEQ ID NO.3和核苷酸序列为SEQ ID NO.4的核苷酸片段组成，或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同时进行反向互补后得到的两个核苷酸片段组成。

本发明还要求保护所述组合引物对在食品中乳酸菌检测方面的应用。

在一种实施方式中，所述食品包括发酵食品或饮料。

在一种实施方式中，所述食品是酱油、发酵香肠、酱油、黄酒等。

本发明的优点和效果：

本发明公开的引物特异性高、通用性好，检测方法灵敏、准确、便捷，可以检测不同食品来源不同种属的乳酸菌，具有良好的食品安全检测前景。

附图说明

图1为利用本发明设计的简并引物检测来源于黄酒发酵液的乳酸菌精氨酸脱亚胺酶途径的凝胶图像(A、B分别为利用两对引物进行PCR扩增的产物)，其中孔道M为2000bp marker(从上到下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)，孔道1-33依次为黄酒发酵液中分离的乳酸乳球菌1-20，弯曲乳杆菌1-21，发酵乳杆菌2-1，发酵乳杆菌2-17，发酵乳杆菌2-18，植物乳杆菌2-19，弯曲乳杆菌2-20，乳杆菌2-22，植物乳杆菌2-24，发酵乳杆菌2-28，短乳杆菌2-29，发酵乳杆菌2-32，短乳杆菌2-34，发酵乳杆菌2-36，发酵乳杆菌2-1-1，发酵乳杆菌2-1-17，乳杆菌2-1-19，魏斯氏菌2-1-26，魏斯氏菌4-15，魏斯氏菌4-19，短乳杆菌4-22，植物乳杆菌7-6，德氏乳杆菌7-13，发酵乳杆菌7-14，干酪乳杆菌14-1，发酵乳杆菌14-6，植物乳杆菌14-8，棒状乳杆菌14-9，柠檬明串珠菌14-16，假肠膜明串珠菌1-5、柠檬明串珠菌1-6、肠膜明串珠菌1-15。

具体实施方案

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1：

1、乳酸菌基因组DNA的提取：使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，根据说明书提取黄酒发酵液中分离的乳酸菌菌株的基因组DNA。

2、引物设计及PCR扩增：

设计了简并引物对A和简并引物对B；其中引物对A的上下游引物的核苷酸序列分别为5’-AACCAYGCHATGATGCAYYT-3’/5’-TTKGABCCRTCRTTCCATTG-3’，用于检测arcA基因，产物长度为250bp；引物对B的上下游引物的核苷酸序列分别为5’-AYTCHGGKGTDGTTTGGAA-3’/5’-TCVGTMACTTCCATTTCHGT-3’，用于检测arcB基因，产物长度为500bp；其中，Y＝C/T，K＝G/T，R＝A/G，B＝G/T/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T。

乳酸菌菌株基因组DNA模板<500ng，上游引物和下游引物各0.2～1μM，10×Ex Taq Buffer5μL，dNTP 4μL，灭菌蒸馏水补至50μL。PCR扩增的条件为：预变性，94℃，4min；变性，94℃，35s；退火，50℃，35s，延伸，72℃，40s；变性、退火、延伸进行30个循环，继续延伸，72℃，10min，最后10℃保持直到取出。

3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：如果使用引物对A和引物对B进行扩增，分别出现250bp、500bp大小的条带，则说明该乳酸菌菌株具有精氨酸脱亚胺酶途径，能够利用精氨酸产瓜氨酸，其在发酵食品或饮料中就有产生一种致癌物-氨基甲酸乙酯(EC)的可能性；如果没有相应大小的条带，则说明该乳酸菌不具有精氨酸脱亚胺酶途径，不能利用精氨酸产瓜氨酸。

实施例2：本发明方法的有效性验证

结合黄酒发酵过程中乳酸菌的检测实例，对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并非局限于此，也可以推广到其他食品或饮料中乳酸菌的检测。

如图1所示，从黄酒发酵液中分离的33株乳酸菌(包括发酵乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌、德氏乳杆菌、棒状乳杆菌、柠檬明串珠菌、乳酸乳球菌等种属的乳酸菌)，采用实施例1的方法进行处理，有30株均能扩增出相应大小的条带，有3株无法检测到相应的条带。

然后，将这些乳酸菌进行发酵并利用高效液相色谱检测乳酸菌降解精氨酸、产瓜氨酸的能力，具体是：甘油保藏菌在MRS培养基中活化2次至OD₆₀₀＝0.8-1.0，转接到MRS-Arg(添加5g/L精氨酸的MRS培养基，pH5.0)，30℃静置培养72h，然后10000rpm离心5min，取上清液，以5％TCA溶液稀释1倍以沉淀上清液中的蛋白，再以高效液相色谱检测样品中精氨酸和瓜氨酸含量。HPLC检测氨基酸的方法如下：使用安捷伦1260高效液相色谱，色谱柱为ODS HYPERSIL C-18column(250×4.6mm,5μm)，流动相A为0.8％(w/v)乙酸钠，0.5％(v/v)四氢呋喃的水溶液，流动相B为乙酸钠：水：甲醇：乙腈＝1:50:100:100。洗脱程序为0min，A：B＝92:8；15-22min，A：B＝40:60；22-25min，A：B＝92:8。流速保持1mL/min，以保留时间定性，以峰面积定量。

测定结果显示，上一步检测到均能扩增出相应大小的条带的这30株乳酸菌在发酵72h后都能利用完5g/L的瓜氨酸，并产生一定量的瓜氨酸(不同菌株产量有事差异，多数菌株产量约100mg/L)；而上一步检测到无法扩增出相应大小的条带的3株菌，无法产生瓜氨酸。

除此之外，发明人还尝试了大量其他来源的乳酸菌的检测，结果发现，如果使用本发明的引物对进行扩增能够分别出现250bp、500bp左右大小的条带的乳酸菌，经发酵验证后确实具有利用精氨酸和产瓜氨酸的性能；而经检测没有相应大小的条带乳酸菌，经发酵验证后确实无法利用瓜氨酸和/或产瓜氨酸。

以上数据说明，本发明的简并引物，具有较强的通用性、特异性和准确性。

实施例3：引物序列对检测有效性、准确性的影响

发明人还采用了已有报道的来自Detection ofarc Genes Related with the Ethyl Carbamate Precursors in Wine Lactic Acid Bacteria文献中的引物进行PCR扩增以检测从黄酒中分离的乳酸菌能否产生瓜氨酸，结果显示很多通过高效液相色谱检测确定能够产生瓜氨酸的菌株基因组不能扩增出相应的PCR产物，说明该文献中报道的引物并不适用于黄酒来源的乳酸菌的检测。然而，用本发明中的引物检测来源于黄酒中的乳酸菌产瓜氨酸是全部适用的，而且本发明还对其他来源(如酸奶)的乳酸菌进行检测，结果也是与菌株产瓜氨酸能力吻合的，进一步说明本发明的检测方法有效性高，适用性广。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。