与苎麻纤维细度相关联的SSR标记及应用的制作方法

本发明涉及农业生产领域的苎麻相关联的SSR标记及应用，具体涉及一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记及应用。
背景技术：
：：苎麻是具有中国特色的天然纺织原料。苎麻纤维具有拉力强,富弹性,耐水湿,耐热力大,富绝缘性等特性。并且苎麻纤维吸湿散湿快,透气性好,可作为优良纺织原料，广泛用于服装制作、装饰用品和产业用纺织品等。另外，苎麻也可作为饲料作物种植。在我国南方,由于夏季高温高湿,苜蓿等北方牧草生长潜力受限。苎麻的生态适应性强，不仅可正常生长，还能获得较高的生物产量；且叶蛋白含量高，富含多种维生素和氨基酸，营养丰富，可以和苜蓿相媲美。有研究结果表明，苎麻叶蛋白含量和产量均高于杂交象草和多年生黑麦草等南方主要牧草。因此，苎麻除作为传统的纤维原料作物外，目前其作为我国南方地区的新型蛋白牧草资源已得到广泛认可，现有技术中已有育成了中饲苎、湘饲苎等系列品种。在家禽、牲畜、水产养殖方面，作为饲料或纤饲兼用作物具有良好的发展前景。纤维细度是评定苎麻纤维等级、纤维质量及纺织利用价值的关键性指标。由于纤维细度和产量负相关，高细度品种其产量构成因素整体较低。现有苎麻品种纤维质量难以满足纺织高支、细薄产品的要求，主要原因是缺乏高细度，2500支以上的品种。蛋白质含量是许多作物重要的营养品质性状。研究表明，蛋白质含量是一个复杂的数量性状，受多基因控制。对于苎麻而言，叶片蛋白质或叫叶蛋白质含量是重要的饲用营养品质指标。有研究表明，不同苎麻品种之间叶蛋白含量差异显著，含量低的不及含量高的50%，且呈连续性变异。因此，如何来培育纤维细度高的品种是苎麻育种的现实要求，是苎麻产业经济发展瓶颈制约的重大突破，也是苎麻资源优势转变为经济优势的关键所在。常规的育种方法是借助表型及育种家经验对作物的重要农艺性状进行选育,其效率低,周期长；而基于基因型选择和高效准确的分子辅助技术,开启了作物育种的新方向。将分子标记技术用于作物重要农艺性状的辅助选择或者鉴定可大大缩短育种时间和提高选择效率。分子标记在苎麻上主要集中在分子标记开发（Chenetal.2011;Liuetal.2013;Chenetal.2015)、种质资源的遗传多样性分析（揭雨成等，2002；郭安平等，2003；Liuetal.2008；Luanetal.2015b）、分子身份证构建（王晓飞等，2010；Luanetal.2015a）、遗传连锁图谱构建（邹自征，2012；栾明宝等，2013；Liuetal.2014）及QTL定位（Liuetal.2014）。Chenetal.（2015）通过转录组开发了52个可能与纤维品质相关的SSR分子标记。但是到目前从事发掘纤维细度和叶片蛋白质含量分子标记的研究还鲜有报道。现代育种有必要利用植物遗传多样性平台，并结合最新的基因组技术来发现新基因或等位基因，用于性状的改良。利用目标数量性状连锁分子标记，通过分子标记辅助选择，可有效提高数量性状的遗传改良进程。关联分析(Associationanalysis)是在植物数量性状研究和植物育种中应用的一种较新的分析方法。它以连锁不平衡为基础鉴定某一群体内性状与遗传标记或候选基因间的关系。与重组群体比较,它的显著优点是高通量,即能在全基因组范围有效地检测大量的具有不同遗传背景的种质资源材料的性状控制基因位点或区域;除高通量外,GWAS采用遗传背景丰富的自然群体为材料,不需要花多年时间构建特定的分离群体,具有作图定位精度高、可达到单基因的水平。目前全基因组关联分析已经成功应用于玉米、水稻、拟南芥，油菜、大麦等重要作物。如何来利用苎麻的自然群体为材料，利用具有多态性的SSR分子标记，分析其遗传多样性、群体结构等；同时对其纤维细度和SSR分子标记进行关联分析，开发并发掘与其相关的SSR位点，从而为苎麻纤维细度性状的QTL定位及其改良等研究提供科学依据；并应用于苎麻新品种育种方面。技术实现要素：：本发明提供一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记及应用，其是利用上百份的苎麻自然群体为材料，利用多态性的若干的SSR分子标记，分析苎麻遗传多样性及群体结构，从而对其纤维细度和SSR分子标记进行关联分析，并应用于苎麻的品种改良。本发明目的之一是提供一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记，包括与苎麻纤维细度相关联的SSR标记R74。所述的一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记，其优选是还包括与苎麻纤维细度相关联的SSR标记R51、R90。本发明所述的一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记，其优选是所述SSR标记R51、R74、R90和苎麻头季麻、二季麻和三季麻的苎麻纤维细度相关联。本发明的另一目的是所述苎麻纤维细度相关联的SSR标记在培育苎麻新品种中的应用。优选所述的与苎麻纤维细度相关联的SSR标记在培育高苎麻纤维细度的苎麻新品种中的应用。本发明所述的应用，其是以若干份苎麻自然群体为材料，利用具有多态性的95对SSR分子标记，进行分析苎麻遗传多样性、群体结构；并对苎麻纤维细度和SSR分子标记进行关联分析，进而确定与苎麻相关的SSR位点，并对苎麻纤维细度性状的QTL定位及苎麻品种进行改良。本发明的有益效果：与传统QTL定位方法相比，GWAS采用遗传背景丰富的自然群体为材料，不需要花多年时间构建特定的分离群体，具有作图定位精度高、能同时扫描控制目标性状所有关联位点的优点。本发明提供的SSR标记与苎麻纤维细度相关联，而培育纤维细度高与苎麻的品质直接相关联，为今后筛选优良种质、基因定位的分子标记辅助育种打下基础，本发明的SSR标记能够用于苎麻的分子育种及提高苎麻产量中。对于我国苎麻的育种和生产具有重要意义。同时，本发明也为分子标记辅助育种提供了有益的借鉴。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明：图1为本发明其中一个实施例中CV值随K值的变化趋势的示意图；图2为本发明107份种质资源的进化树；注：图中每个分枝为一个样品；0.05表示在固定长度的样品间的遗传距离；图3，为本发明的自然群体中个体间的亲缘关系关联分析结果图，说明，图中的亲缘关系用kinship相似系数来衡量，结果发现表明，67.704％的两两材料间的kinship值在0到0.05之间，说明本发明利用的107苎麻种质资源之间的亲缘关系较远，具有较高的遗传多样性。具体实施方式:下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例1：本发明实施例是以107份苎麻自然群体为材料，利用具有多态性的95对SSR分子标记，分析其遗传多样性、群体结构等；并对其纤维细度和SSR分子标记进行关联分析，发掘与纤维细度相关的SSR位点，为苎麻纤维细度性状的QTL定位及其改良等提供科学依据。本发明提供一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记，包括与苎麻纤维细度相关联的SSR标记R74。其优选是还包括与苎麻纤维细度相关联的SSR标记R51、R90。本发明所述的一种与苎麻纤维细度相关联的SSR标记，其优选是所述SSR标记R51、R74、R90和苎麻头季麻、二季麻和三季麻的苎麻纤维细度相关联。本发明所述苎麻纤维细度及叶蛋白含量相关联的SSR标记在培育苎麻新品种中的应用。优选所述的与苎麻纤维细度及叶蛋白含量相关联的SSR标记在培育高苎麻纤维细度的苎麻新品种中的应用。本发明所述的应用，其是以若干份苎麻自然群体为材料，利用具有多态性的95对SSR分子标记，进行分析苎麻遗传多样性、群体结构；并对苎麻纤维细度和SSR分子标记进行关联分析，进而确定与苎麻相关的SSR位点，并对苎麻纤维细度性状的QTL定位及苎麻品种进行改良。具体的方法如下。1、材料与方法供试材料，以107份苎麻核心种质资源为研究材料。纤维细度测定及统计分析，2014年10月(2014年三麻)、2015年8月（2015年二麻）、2015年10月（2015年三麻）在成熟期收获苎麻，调查其纤维细度性状。2014年9月（2014年三麻）、2015年5月（2015年头麻）和2015年7月（2015年二麻），在旺盛生长期，每个小区取5株顶端的叶子，在105℃杀青30分钟，然后70℃烘干至恒重，粉碎过60目筛，采用凯氏定氮测定粗蛋白含量；利用SPSS软件，对107份种质资源的纤维细度和叶片粗蛋白含量进行统计描述分析。SSR分子标记分析利用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度与浓度。参照Chen等的方法对实验室的95对SSR多态性引物进行PCR扩增。PCR产物烯酰氨凝胶垂直电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，银染检测多态性，拍照记录条带；用数字1和0分别表示供试材料电泳条带的有或无，样品缺失记为2，用Excel进行统计，并根据相应软件格式进行转换。遗传多样性和聚类分析利用powerMark3.25，分析其最大等位基因频率、基因型数、等位基因数、基因多样性、杂合度和多态性信息含量(PICvalue)；根据NJ聚类法，构建其聚类图。群体结构分析通过admixturer软件，分析107个样品的群体结构。分别假设107个样品的分群数（K值）为1-10，进行聚类，根据CV值来确定分群数；CV值最小时对应的K值，即为分群数。亲缘关系分析本研究利用95对分子标记，使用软件SPAGeDi计算107份苎麻种质资源材料两两间的Kinship相似系数。运算得到的结果中，所有为负值的亲缘关系相似系数均设置为零，然后将所有的亲缘关系相关系数乘以2，应用于关联分析。关联分析利用ＴＡＳＳＬＥ软件的一般线性模型（ｇｅｎｅｒａｌｌｉｎｅａｒｍｏｄｅｌ，ＧＬＭ）和混合线性模型（ｍｉｘｅｄｌｉｎｅａｒｍｏｄｅｌ，ＭＬＭ），将群体结构分析所得的Ｑ值和亲缘关系Ｋ作为协变量，进行标记与性状的关联分析。2.结果与分析纤维细度和叶片粗蛋白含量表型分析，表1说明，遗传多样性分析利用筛选出的95对SSR多态性引物对107份苎麻进行扩增，共扩增出252个多态性条带。各引物位点的多态信息含量PIC（Simpson多态性指数）平均为0.447969；每一个位点等位基因数平均为2.642105，期望平均值为2.185957；每个位点观察杂合度平均为0.319365，期望平均值为0.519303；基因多样性平均为0.522578；基因型多样性（shannon-wiener多样性指数）平均为0.82431；MAF平均为0.325672。群体结构分析利用admixture软件分析供试验材料的群体结构，分别假设107个样品的分群数（K值）为1-10，进行聚类，根据CV值来确定分群数。CV值随K值的变化趋势见图1。结果表明，当群体数K=1时其交叉验证误差值为0.87987，此时误差值最小，表明供试材料群体结构简单，可直接分为一个亚群。亲缘关系分析如图3所示，自然群体中个体间的亲缘关系是影响关联分析结果的一个重要因素，这种亲缘关系可以用kinship相似系数来衡量。分析结果发现表明，67.704％的两两材料间的kinship值在0到0.05之间表明本研究利用的107苎麻种质资源之间的亲缘关系较远，具有较高的遗传多样性。亲缘聚类关系分析如图2所示，进化树用来表示物种之间的进化关系，根据各类生物间的亲缘关系的远近，把各类生物安置在有分枝的树状的图表上，简明地表示生物的进化历程和亲缘关系。基于各个种质资源在各SSR位点的基因型，利用powermarker进行NJ聚类，获得各种质资源间的进化树。从种质资源间的进化树上可以看出，107份种质资源主要分为两大类。其中第一类包含87个品种，第二类包含20个品种。SSR位点与苎麻纤维细度的关联分析为避免群体结构和亲缘关系的存在影响关联分析的准确性，应用Tassel3.0软件，将核心种质各个体的Q值和Kinship值作为协变量，基于GLM模型和MLM模型进行纤维细度表型变异对标记变异的回归分析，探求相关性状的关联标记，并统计各位点的表型变异解释率。结果表明，在基于GLM模型分析中头季麻、二季麻、三季麻分别检测到1个、8个、4个纤维细度关联分子标记（p<0.05）。在两个环境中同时检测到的有3个，其中R74分子标记在三个环境中全被检测到。在二季麻和三季麻中可以被同时检测到的标记有R51、R74、R90。R51、R74在两个环境中表型变异解释率均超过10%。在基于MLM模型分析中头季麻、二季麻、三季麻分别检测到1个、5个、4个纤维细度关联分子标记（p<0.05）；在两个环境中被同时检测到的标记有2个，其中R74分子标记在三个环境中全被检测到。在二季麻和三季麻中可以被同时检测到的标记有R51、R74。R51、R74在两个环境中表型变异解释率均超过10%。MLM模型检测到的分子标记位点，在GLM模型中均被检测到。在MLM模型下，对于纤维细度而言，3种环境下均检测到与其相关的分子标记位点有1个；2种环境下均检测到的分子标记位点有1个；其余5个分子标记位点仅在一种环境下被检测到。说明苎麻纤维细度虽然存在效应稳定的QTL,但受基因型与环境互作的显著影响。表23.讨论利用传统QTL作图方法进行苎麻性状QTL定位有很多不足。首先，由于分离群体仅涉及两个特定的亲本材料，因此只涉及同一基因座的两个等位基因（苎麻是杂合体，最多可涉及4个等位基因），定位的QTL可能不是优异等位基因（Magnusetal.2008）；其次,构建群体费时费力。苎麻构建一个群体从开始杂交到群体可以QTL定位，一切顺利的话需要3年。另外，由于苎麻杂交授粉技术的限制，构建过程外源花粉污染严重，获得苎麻的真实杂交后代困难。对真伪杂交种的鉴别就是一个很费时费力的工作，且构建的群体偏分离比较严重。因此，本研究利用自然群体作为分析群体，不仅可充分利用种质资源的遗传多样性和优异等位基因，而且避免了构建群体的不足。供试群体材料的恰当选择关系到关联分析的成功与否。由于表型性状容易受到环境因素的影响,种质的表型性状与遗传背景经常出现不一致,表型性状类似的种质遗传关系很远,本实验挑选107份种质构建了关联分析的群体，尽量做到群体结构简单,并包含了较丰富遗传变异度。群体结构是影响关联分析结果的重要因素，亚群的混合使整个群体的LD强度增强，容易造成伪关联。同一作物不同的自然群体有时也会表现不同的群体结构。前人关于苎麻的群体遗传结构报道不多，有学者认为104份苎麻种质资源可划分为2大类群。本发明中的107份苎麻种质资源划分为了1大类群，把苎麻种质资源划分为1大类群要考虑到其可能造成的苎麻的伪关联。连锁不平衡是关联分析的前提。自花授粉作物LD水平较高，而异花授粉作物LD水平较低。苎麻作为异花授粉作物，也表现出了较低的LD水平，与前人的结论一致。由于LD水平较低，进行全基因组关联分析需要较多的分子标记。而本发明所用的分子标记仅有95个，因此，本研究只是进行了粗略意义上的全基因组关联分析，只是一定意义上的粗定位。因此，为了得到更加可靠地结果，需要进一步扩大标记数目。群体结构分析是关联作图的基础。由于群组结构的存在会通过位点的LD,使得整个群体的连锁不平衡强度增加,导致非连锁位点间处于连锁不平衡状态,因此通过数学模型的处理来消除群体结构的影响成为目前关联分析的必要过程。本研究同时采用了GLM模型和MLM进行亚麻表型性状的关联分析,可以矫正因群组结构造成的假阳性结果,对于提高分析精确度具有重要意义。本发明一共发现了5个与品质性状相关的稳定分子标记。其中，纤维细度3个,粗蛋白含量2个。在这5个稳定的分子标记中，与纤维细度相关的分子标记R74在三个环境中均被检测到，且遗传贡献率达到11.29%-14.23%之间，是一个可用于分子育种的分子标记。其他4个分子标记均是在2个环境中被检测到，利用价值尚需进一步验证。本发明找到在两个模型中与纤维细度都共同关联的标记有2个,分别是R51、R74,与粗蛋白含量相关的是R43。这两个关联在两个模型中的贡献度均超过10%。本发明采用SSR分子标记对材料进行关联分析；目前国内使用SSR分子标记对苎麻种质进行遗传多样性研究的还较少。本发明是利用95条引物对107份苎麻核心种质材料扩增出255个位点，所有位点的平均PIC值为0.4480,平均多样性指数为0.5226,苎麻SSR标记的多态性与表型性状的多态性指数相差不大,推测原因可能是本发明分析的107份苎麻种质为自然群体,虽然在形态上表现出丰富的多样性,但遗传背景仍比较复杂。本发明利用分子标记R51和R74，对种质资源圃中的品种进行了快速检测，根据其基因型，成功预测了品种的纤维细度高低情况，下表3为4个品种的基因型和纤维细度高低情况。表3品种R51R74纤维细度208BBAA高515AABB低1276AABB低1455BBAA高说明，利用R51扩增出BB基因型、R74扩增出AA基因型，纤维细度高，大于2200支；利用R51扩增出AA基因型、R74扩增出BB基因型，则纤维细度低，小于1200支。本领域技术人员在不脱离本发明的实质和精神，可以有多种变形方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变化，均包含于本发明的权利范围之内。当前第1页1 2 3