一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胆管癌中的应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码rna--enst00000588480.1在诊断及制备胆管癌药物中的应用。

背景技术：

胆管癌(cholangiocarcinoma,cca)是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，起病隐匿，早期诊断困难，平均生存期小于24月，五年生存率小于5％。手术是目前有效的治疗手段，但初诊患者仅30％适合手术，其余已经失去手术机会。因此，早期诊断早期治疗是提高胆管癌患者手术率和生存率的关键。目前胆管癌诊断金标准依靠组织和细胞学病理，临床常用经内镜下逆行胰胆管造影术(endoscopicretrogradecholangiopancreatography,ercp)行组织活检和细胞学刷片检查，但活检取材困难，刷片诊断阳性率仅约20％。胆汁作为胆管上皮细胞赖以生存的微环境，蕴含丰富的胆道疾病信息，是应用价值很高的液体活检标本。与细针穿刺和组织病理检查相比，体液标本取材方便、可重复、创伤小，可应用于临床实时动态个体化诊疗中。而传统血液和胆汁肿瘤标志物ca199、cea、ca125的检测主要基于蛋白质组学，具有不统一、特异性不强等缺点。因此，寻找胆管癌特异性肿瘤标记物对早期诊断具有重要理论意义和实用价值。

外泌体exosome是由胞内体分泌而来，晚期内涵体膜向内出芽形成，细胞内多泡体(multivesicularbody,mvb)与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的一种直径约30-120nm的膜性囊泡。exosome广泛存在于许多体液中如血清、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁等。目前常用超高速差速离心法、聚合沉淀法从体液中提取，两种方法各有优势，前者提取的浓度和纯化率高，后者多使用试剂盒进行提取，具有浓度和纯化率高、样本量少、快速简便等优点。目前报道的2篇关于胆汁样本exosome的提取均采用超高速差速离心法。exosome可用电镜观察大小和形态，或检测标志物来鉴定exosome，常选取的标志物有alix、tsg101、cd81、cd82、cd63、cd9、cd24、epcam、hsc70等。研究发现，exosome可通过囊泡运输方式，在体内充当细胞间通讯使者的角色；在免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应及肿瘤发生发展等过程中均有作用；有证据显示，肿瘤来源的exosome有利于致瘤微环境的产生和重建。因脂质双分子层的保护作用，exosome可在体液中稳定存在且半衰期长，且其中的标记蛋白以及非编码rna可选择性富集，可提供丰富、稳定、灵敏且特异的生物信息。稳定的生物学特性、内容物富集和多样性、非侵入性及检测迅速，使exosome有望成为应用前景广阔的新型循环生物标志物。近年来针对exosome应用于疾病诊断的开发研究逐年增长，其中70％以上均是exosome在肿瘤性疾病中的研究，此外，心血管疾病、肾脏疾病、自身免疫病等多种疾病中也亦有exosome作为疾病循环标志物的相关研究。exosome作为大分子信息物质的载体，含有丰富的蛋白质、mrna、非编码rna等信号分子，其中非编码rna发挥重要的作用，是现今研究的热点之一。

非编码rna主要包括小分子单链rna(microrna,mirna)和长链非编码rna(longnoncodingrna,lncrna)。lncrna是一类长度>200nt的非编码rna，在基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mrna降解和翻译调控等众多生命活动中发挥重要作用。exosome内lncrna的研究已有少量报道，研究显示：lncrna占血浆exosome的测序rna的3％，由rna通过控制超级增强子的活性调节。senfter等研究显示：因lncrna不稳定，exosome可能是其血行转移的载体；mustafa等发现，尿液exosome中lncrna-p21可鉴别前列腺良恶性肿瘤。exosome中lncrna具有以下特点：①组织和循环特异性：cabili等收集lincrna转录组测序数据，发现lncrna具有高度的组织特异性，可作为诊断及预后标志物。②富集性：gezer等研究发现，肺癌细胞培养上清中exosome内多种lncrna含量较细胞培养液中高。本研究将对胆汁提取exosome前后lncrna的表达量进行检测，分析胆汁exosome是否存在富集现象。③稳定性：ban等指出，低ph有助于exosome的提取；malik等研究显示，exosome内hsp60在一定温度、ph值和乙醇中具有稳定性。综合以上特点，表明exosome中lncrna可作为肿瘤的临床诊断标志物。最近的研究显示：胆汁exosome中5种mirna可作为胆管癌诊断组合，敏感度和特异度分别为67％和96％，优于血清ca199检测。与mirna比较，lncrna在胆管癌领域较少，仅有2篇组织中的研究：在肝内胆管癌组织芯片中研究发现lncrnacps1和cps1-it1可做为肝内胆管癌判断预后的标志；wang等研究表明，lncrna与mrna联合诊断可预测肝内胆管癌患者生存期。目前尚没有lncrna在胆管癌体液中研究，更没有胆管癌体液exosome中lncrna的研究，因此，本研究具有较好的创新性和应用前景。因lncrna的研究较少，现有lncrna的具体功能机制尚待探索，新的lncrna尚待发现。因此，发展高通量、高分辨率的成像及实验技术，进一步从胆汁中筛查灵敏度及特异度更高的lncrna分子将为胆管癌的早期诊断提供理论依据。

课题组前期通过对5位胆管良性狭窄和5位胆管癌患者胆汁中exosome进行lncrna全转录组测序(广州市锐博生物科技有限公司)，发现两者差异在1倍以上的lncrna有54条(其中19个上调，35个下调)，进一步采用荧光实时定量rt-pcr(qrt-pcr)在32对有胆管良性狭窄和胆管癌患者胆汁标本中进行验证，发现lncrna：enst00000588480.1在胆管癌患者胆汁中表达平均上调4.87倍；roc曲线显示曲线下面积0.688(95％可信区间：0.55-0.82)，敏感度:63％，特异度:75％。与患者的tnm分期和不良预后呈正相关。生物信息学分析显示enst00000588480.1在方面具有重要的作用。以上的结果表明enst00000588480.1是胆管癌潜在的诊断标记物和治疗靶点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供lncrnaenst00000588480.1在诊断胆管癌及在制备治疗胆管癌药物中的应用。

本发明涉及一种长非编码rna，其基因位于19号染色体:1,989,903-1,990,370，长度为468核苷酸，其核苷酸序列为seqidno：1；

seqidno:1：

ggctttccgcagtgaactcgggggcactatcctcggtacccagatgcccacctgtgtgccactcccctcccaaaccagcccctgagcccgagctctgttacctgcagcgaactcctcgatggtcatgagcgggaagcgaatgaggcccagggccttgcccagaaccttccgcctgttctctggcgtcacctgcagctgctgccgctgacactcggcctcggaccagcggacaacggcattgaacagccgcacctcacggatgcccagtgtgtcgcgctccaggacagccaccagcgtgtctgtggggtggaggaaggggctgcgtgaacacgacacccacatgcccaccctgcaggaggcagtgagactaacgtgaggaccagcagttaaagccgggctggcaactatggcccgtggcccaaatctggccctgtgagtgtgtttataaataaagctttatcaacacaa

一种长非编码rna在制备治疗胆管癌药物中的应用；

一种长非编码rna在制备诊断胆管癌试剂中的应用；

一种检测enst00000588480.1的引物，如seqidno.2和seqidno.3所示，

enst00000588480.1primerf(seqidno：2)：5'-gcttcccactccaaagtcc-3',

primerr(seqidno：3)：5’-ctagagggagctgacggatg-3’。

plaprimerf(seqidno：4)：5'-aagttcttgatccccaatgctt-3',

primerr(seqidno：5)：5'-gtctgataggatgtgttggttgc-3'。

一种试剂盒，包括所述引物；

一种包括所述长链非编码rna的药物组合物；

所述引物在制备诊断胆管癌试剂中的应用；

所述药物组合物在制备治疗胆管癌药物中的应用。

所述药物组合物，其中还包括辅料。辅料包括：(lip2000,opti-mem培养液,pbs磷酸缓冲盐溶液)。

技术方案

标本收集

本研究纳入了南京医科大学第二附属医院2013年2015年于消化内科行ercp的患者样本为患者ercp术中插管后抽取得到的胆汁。其中胆管癌患者32例作为实验组，良性胆管狭窄患者32例作为对照组，所有病例均经过影像学/病理学检查确认。所有患者术前均空腹，手术均由熟练的操作者实施，获取的胆汁提取后均立即储存于-80℃冰箱待用。本研究得到了南京医科大学第二附属医院的伦理委员会批准，纳入研究的患者均于术前签署知情同意书。

外泌体分离

本研究采用传统的超高速差速离心法分离胆汁中的外泌体，分步提纯外泌体，低温常规转速和高速离心外泌体使用常规ep管，过滤步骤使用的0.22μm滤器购自merckmillipore公司，超速离心步骤使用与beckman超速离心机适配的beckman超速离心管(10.4ml，beckmancoulter，美国)。离心过程中配平均使用1xpbs缓冲液。

rna提取和定量pcr分析

根据试剂的使用说明，用trizol试剂分离总rna。逆转录反应应用biotekesupermoⅲ逆转录试剂盒(bioteke，北京，中国)。逆转录试剂盒对0.4μg总rna进行逆转录，最终体积为20μl。荧光定量pcr应用sybrgreenmastermix试剂盒(vazymebiotech，南京，中国)。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到ct值，采用相对量法与内参进行目的基因相对表达量的分析。

数据处理

实验数据皆用spss17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾student’st检验。生存分析用kaplan-meier方法。单因素分析中p<0.05的随后再使用多因素分析。

附图说明

图1.胆汁外泌体的鉴定

1a：胆汁外泌体电镜图；

1b：外泌体粒径图；

1c：流式细胞仪检测外泌体标志蛋白cd63和cd81的表达。

图2.lncrna差异表达和鉴定及其诊断价值

2a：enst00000588480.1在患者胆汁中表达水平；

2b：enst00000588480.1和ca199roc曲线比较。

图3.enst00000588480.1在预后评估中价值

3a：enst00000588480.1表达与患者tnm分期关系；

3b：enst00000588480.1表达与患者生存分析关系。

图4.enst00000588480.1靶基因功能和通路预测

4a：enst00000588480.1功能预测；

4b：kegg通路分析。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照sambrook，j等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(molecularcloning：alaboratorymanual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的超速离心管、滤器等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1外泌体的分离和鉴定

(1)取出储存于-80℃冰箱的患者胆汁标本，用预冷的pbs配平后于4℃以300xg离心10分钟后弃沉淀以去除沉淀的细胞和细胞碎片，将上清移至新的标记好的10ml离心管。

(2)取出的上清用预冷的pbs配平后于4℃以16,500xg离心20分钟，弃沉淀进一步去除上清中的碎片，用注射器吸取上清并通过0.22μm滤器过滤，将滤液收集至标记好的超速离心管。

(3)在装有滤液的超速离心管中加入预冷的pbs至离心管容积的2/3以上并用pbs配平。在4℃下以120,000xg在超速离心机真空离心70min，可于管底观察到黄色沉淀，即为分离的外泌体。弃上清，可用50μl预冷的pbs溶液悬浮外泌体并转移至新的、标记好的无酶ep管，置于-80℃冰箱保存，也可加入1ml的trizol裂解液充分吹匀管底的黄色沉淀并移至新的、标记好的1.5mlep管以进行后续的rna提取。

(4)将外泌体pbs悬浮液送至南京医科大学分析测试中心做电镜鉴定。

实施例2检测enst00000588480.1r在胆汁外泌体中的表达情况

rna提取

用trizol吹匀的外泌体冰上静置5min后，加入约0.2ml的氯仿(三氯甲烷，体积比氯仿：trizol＝1：5)，快速剧烈混匀，冰上静置5min；

上述混合液于4℃以12000rpm/min离心20min，后分为三层(水相/白色沉淀/红色有机物)，用移液器轻轻吸取上层无色透明液体至新的无酶ep管，尽量避开白色沉淀；

在无色透明上清液中加入与之等体积的异丙醇，低速涡旋混合后冰上静置10min，于4℃以12000rpm/min离心15min，弃上清；

在上述沉淀中加入1ml预冷的现配75％乙醇(0.1％depc水：无水乙醇＝1：3)后，于4℃以7500rpm/min离心5min，尽量吸尽上清并弃上清；

将弃去上清的ep管倒置于滤纸上，室温干燥约15min；

干燥后加入适量depc水(15-20μl)，轻吹混匀。

用depc水将超微量紫外分光光度计调零后，吸取1μl的rna溶液滴于one-drop仪器中进行rna浓度及a260/a280的检测，a260/a280比值范围在1.8到2.1表明符合要求；

用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。配制1％的琼脂糖凝胶后，实验用微波炉加热溶解琼脂糖至琼脂糖完全溶解，将溶液冷却至60-65℃左右，加入溴化乙锭(eb，10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×tae缓冲液中平衡10min待用。点样。按1：4的体积比将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，将各样本含有1μg的rna加入凝胶孔中。80v恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。

tris-乙酸(tae)缓冲液配方(1l)50×：

实时定量pcr

从胆汁外泌体提取的rna，逆转录和定量pcr分析(以20μl为例)：

(1)逆转录反应采用biotekesupermoⅲ逆转录试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)。

逆转录体系如下：

按以下条件进行逆转录反应：

①50℃，60min；

②70℃，10min；

之后随即冰上冷却，得到的cdna即可直接用于后续的qpcr。根据xx提供的基因序列，设计引物序列。

qpcr应用steponereal-timepcr系统。

qpcr体系如下：

qpcr反应条件如下：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性，根据扩增曲线得到ct值。将所选常用内参的ct值导入bestkeeper，筛选出表达相对最稳定的内参pla。根据筛出的内参pla和目的基因的ct值，使用2^-δδct法，计算目的基因lncrna的相对表达量。计算公式为：2^-δδct。

结果表明，enst00000588480.1r在胆管癌患者胆汁外泌体中表达较对照组上调4.87倍(图2a)。

实施例3enst00000588480.1在胆管癌诊断和预后评估中的价值

为了检测enst00000588480.1在诊断胆管癌中的价值，roc曲线显示曲线下面积0.688(95％可信区间：0.55-0.82)，敏感度:63％，特异度:75％(图2b)。胆管癌中enst00000588480.1高表达与患者的tnm分期(ⅰ-ⅱvs.ⅲ-ⅳ，p＝0.027，图3a)相关，根据enst00000588480.1在胆管癌患者中和不良预后(p＝0.0231，图3b)呈正相关。

实施例4enst00000588480.1靶基因功能和通路预测

lncrna靶基因预测整合了ncbi，rnacentral,genecode等数据库，对lncrna作用于靶基因的cis作用和trans作用进行预测，csnk1g2，btbd2。然后通过kobas,http://kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php对其进行功能(图4a)和通路(图4b)预测。

sequencelisting

<110>南京医科大学第二附属医院

<120>一种长非编码rna及其在诊断/治疗胆管癌中的应用

<130>

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<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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actcccctcccaaaccagcccctgagcccgagctctgttacctgcagcgaactcctcgat120

ggtcatgagcgggaagcgaatgaggcccagggccttgcccagaaccttccgcctgttctc180

tggcgtcacctgcagctgctgccgctgacactcggcctcggaccagcggacaacggcatt240

gaacagccgcacctcacggatgcccagtgtgtcgcgctccaggacagccaccagcgtgtc300

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