本发明属于天然产物化学领域，涉及一种应用大孔树脂联用制备液相色谱技术分离高纯度橄榄苦苷的方法。
背景技术：
橄榄苦苷(oleuropein)是一种环烯醚萜苷类化合物，主要存在于油橄榄树的果实、叶子中，其中在叶子中含量最高。由于橄榄苦苷中含有多个酚羟基，具有极强的抗氧化能力，能够预防冠心病和动脉粥样硬化的发生、舒缓血管平滑肌、减轻低密度脂蛋白的氧化，此外，橄榄苦苷还具有良好的抗炎、抗真菌、抗病毒和降血糖等活性。橄榄苦苷还被用于多种护肤品中做为添加剂，主要用于保持肌肤的弹性、防治皮肤老化、抵御由于氧化导致的皮肤细胞损伤。
近年来，国内外学者对橄榄苦苷的提取纯化方法进行了有益探索。如专利201010549802.x(一种纯化橄榄苦苷的方法)公开了一种从油橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法。将油橄榄叶用乙醇提取，然后加入活性炭脱色，回收乙醇后用正丁醇萃取，正丁醇萃取相回收溶剂后用制备型高速逆流色谱仪分离，可以得到纯度90％以上的橄榄苦苷纯品。但是该专利使用活性炭脱色并正丁醇萃取，溶剂耗费较多，回收正丁醇能耗大，并且最后工艺回收率较低，整个工艺橄榄苦苷得率仅达到1％左右。专利201310618221.0(一种橄榄苦苷对照品的制备方法)公开了一种从橄榄叶中制备高纯度橄榄苦苷对照品的方法，将橄榄叶用甲醇提取，然后减压浓缩，将沉淀加水溶解后用氯化钠饱和，过滤后将滤液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液再用饱和氯化钠溶液洗涤，提取物最后用ods中压柱分离，用水：乙醇(1:0-100)洗脱，tlc检测，合并洗脱馏分后浓缩得到橄榄苦苷粗品；将所得粗品再用葡聚糖柱纯化，既得橄榄苦苷晶体，纯度>98％。该专利虽然得到化合物纯度较高，但是步骤繁琐，周期长，溶剂消耗多，得率较低。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种利用大孔树脂联用制备液相色谱分离高纯度橄榄苦苷的方法，在不影响得率的基础上获得更高纯度的橄榄苦苷。
本发明的方法，包括如下的步骤：
1)油橄榄叶提取：
首先将油橄榄叶用提取溶剂进行提取，提取液进行浓缩后作为上样液；
2)大孔树脂富集橄榄苦苷：
上样液经过大孔吸附树脂柱进行吸附，吸附完毕后，树脂柱先用纯净水进行洗涤，然后加入不同浓度的乙醇水溶液对大孔树脂柱进行梯度解吸附；收集50％-90％的乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得到油橄榄叶提取物；
3)制备液相色谱分离高纯度橄榄苦苷：
将油橄榄叶提取物用制备液相色谱分离，用甲醇-水洗脱液进行梯度洗脱，紫外检测器检测洗脱馏分，收集合并含有橄榄苦苷的馏分后回收溶剂，干燥后得到乳白色粉末即为橄榄苦苷。
所述的步骤1)中，提取溶剂可以是乙醇、水或乙醇水溶液。
所述的步骤2)中，大孔吸附树脂选自苯乙烯和二乙烯基苯基质交联得到的大孔吸附树脂。
上述制备方法中，步骤2)中的上样液可以在大孔树脂柱上吸附一次，也可以循环吸附。
上述制备方法中，制备液相色谱样品检测可以采用仪器自带检测器，也可以使用高效液相色谱，薄板层析或其他检测手段检测。
本发明的方法分离成本低，制备过程安全，通过将大孔树脂富集和制备液相色谱分离联用，能够从油橄榄叶提取物中分离制备得到高纯度的橄榄苦苷。
具体实施方式
下面是本发明的实施例，本发明包括但不仅限于实施例。
实施例1
取1kg油橄榄叶，加入12升60％的乙醇，回流提取2h，倾出提取液，然后再加入10倍量60％的乙醇进行第二次提取，将两次提取液合并，然后减压回收溶剂至溶液中无醇味。向浓缩后提取液中加入蒸馏水，使其密度相当于原药材0.2g/ml。将浓缩后提取液通过大孔树脂柱进行橄榄苦苷富集，流速8bv/h，吸附完成后首先用蒸馏水洗脱，弃去蒸馏水洗脱液。然后用70％乙醇洗脱，流速为10bv/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂。将大孔树脂70％乙醇洗脱部位用甲醇溶解，通过制备液相色谱进行分离，使用20×250mm分离柱，上样量60mg，甲醇-水梯度洗脱，流速10ml/min，紫外检测器在线检测，收集含有橄榄苦苷的馏分，回收溶剂后干燥得到乳白色粉末，经过核磁共振、质谱鉴定为橄榄苦苷，纯度≥90％，整个工艺橄榄苦苷得率为81.2％。
实施例2
取1kg油橄榄叶，加入12升水，回流提取2h，倾出提取液，然后再加入10倍量的水进行第二次提取，将两次提取液合并，然后减压回收溶剂至提取液密度相当于原药材0.15g/ml。将浓缩后提取液通过大孔树脂柱进行橄榄苦苷富集，流速10bv/h，吸附完成后首先用蒸馏水洗去杂质，弃去蒸馏水洗脱液。然后用60％乙醇洗脱，流速为10bv/h，收集60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂。将大孔树脂60％乙醇洗脱部位用甲醇溶解，通过制备液相色谱进行分离，使用50×650mm制备柱，上样量150mg，甲醇-水梯度洗脱，流速30ml/min，紫外检测器在线检测，收集含有橄榄苦苷的馏分，回收溶剂后干燥得到乳白色粉末，经过核磁共振、质谱鉴定为橄榄苦苷，纯度≥90％，整个工艺橄榄苦苷得率为79.8％。