人工设计合成的对蚜虫具有控害作用的miRNA分子的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人工设计合成的对蚜虫具有控害作用的mirna分子。

背景技术：

麦蚜是一类世界性的农业害虫，主要包括麦长管蚜sitobionavenae(fabricius)、麦二叉蚜schizaphisgraminum(rondani)、禾谷缢管蚜rhopalosiphumpadi(linnaeus)和麦无网长管蚜acyrthosiphondirhodum(walker)等。麦蚜具有分布广、数量大、繁殖力强、危害严重等特点，并且能够进行远距离迁飞，并能够在迁飞过程传播病毒，其排泄的蜜露也可孳生多种霉菌，影响小麦植株的光合作用和呼吸作用，导致作物减产，给农业生产造成巨大损失，由此成为农业领域病虫害防治研究的热点之一。目前国内对于蚜虫的防治方法主要是采用化学农药，过量喷施化学农药会给自然环境以及人类的生活带来严重的后果。近年来国内外很多学者致力于小麦抗性品种的筛选和利用研究，希望能够培育和利用小麦抗蚜品种/系在麦蚜的综合防治中能起到预防作用。目前，由于现有种质资源中还缺乏有效的抗蚜基因，因此亟待研究者开发新的靶标基因用于小麦害虫的防控。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种mirna分子：mirna分子为双链结构或者单链结构，mirna分子为双链结构时，含正义链和反义链；其中，正义链的核苷酸序列如序列表中的seqidno：1所示，且反义链的核苷酸序列如序列表中的seqidno：2所示；或mirna分子为单链结构时，其核苷酸序列如序列表中的seqidno：3所示，具体如下：

正义链(seqidno：1)：5’-uggacggagaacugauaagggc-3’

反义链(seqidno：2)：5’-ccuuaucaguucuccguccauu-3’

单链(seqidno：3)：5’-gcccuuaucaguucuccgucca-3’

优选地，双链结构中，反义链的化学修饰包括：3’端进行胆固醇修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，3’端进行四个硫代骨架修饰，得到：5’-cscsuuaucaguucuccguccsasusus-chol3’，并且全链进行甲氧基修饰；或单链结构的化学修饰包括：3’端进行胆固醇修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，3’端进行四个硫代骨架修饰，得到：5’-gscsccuuaucaguucuccguscscsas-chol3’，并且全链进行甲氧基修饰。

本发明提供的mirna分子，是以蚜虫的mirnaavi-mir-184-3p的成熟序列设计得到的相应的mirnaavi-mir-184-3pagomir(mirna激动剂)和mirnaavi-mir-184-3pantagomir(mirna拮抗剂)。其中的mirnaavi-mir-184-3pagomir为双链结构，反义链(seqidno：2)进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰；正义链(seqidno：1)是作用链，反义链是补上的辅助链，设计时错开前2个碱基进行反向互补设计，并在末端加uu悬垂便于解链。其中的mirnaavi-mir-184-3pantogimir为单链结构(seqidno：3)，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。本发明提供的mirnaavi-mir-184-3pagomir和mirnaavi-mir-184-3pantagomir均是委托苏州吉玛基因股份有限公司进行设计合成的。

本发明保护包括上述双链结构的mirna分子或单链结构的mirna分子的试剂盒。

本发明还保护一种试剂盒，试剂盒包括mirna分子溶液，mirna分子溶液包括质量分数为30％的蔗糖溶液和浓度为300～500nm的上述双链结构的mirna分子或单链结构的mirna分子；其中，蔗糖溶液的溶剂为水。

其中，mirna分子溶液的配制过程可以如下：(1)用超纯水配置质量分数为30％的蔗糖溶液，然后采用0.2μm的微孔膜过滤灭菌，将得到的滤液分装于1.5ml的灭菌离心管中，置-20℃冰箱保存备用；(2)利用质量分数为30％的蔗糖溶液将合成的mirnaavi-mir-184-3pagomir或mirnaavi-mir-184-3pantagomir分别稀释为300～500nm浓度备用。

本发明还保护上述试剂盒在制备控害蚜虫产品中的应用。蚜虫包括麦蚜，麦蚜包括麦长管蚜sitobionavenae(fabricius)、麦二叉蚜schizaphisgraminum(rondani)、禾谷缢管蚜rhopalosiphumpadi(linnaeus)和麦无网长管蚜acyrthosiphondirhodum(walker)中的一种或多种。

本发明还提供了一种上述试剂盒控害蚜虫的方法，包括如下步骤：取数头若蚜在含有mirna分子溶液的饲蚜器中饲喂72h；然后接入到麦株上继续饲养，直至发育为成蚜。需要说明的是，优选接入到新鲜的盆栽麦株上生长，饲养期间记录蚜虫的死亡情况及个体发育情况，直到大约6-7天后发育为成蚜，统计蚜虫的存活率；若蚜优选来源于：将蚜虫连续单头饲养n代，收集第n+1代无翅成蚜初产24h内生殖的若蚜，n代优选为3代。

优选地，含有mirna分子溶液的饲蚜器为含有mirna分子溶液的半封闭饲蚜器，含有mirna分子溶液的半封闭饲蚜器的制备方法包括如下步骤：将灭菌后的圆柱形玻璃管垂直放置于吸水纸上，顶端利用厚度为0.8～2μm的石蜡薄膜封口，在石蜡薄膜的上表面加入mirna分子溶液，然后再用厚度为8～15μm的石蜡薄膜封顶，得到含有mirna分子溶液的半封闭饲蚜器；其中，圆柱形玻璃的直径为2cm，高度为3cm，mirna分子溶液的体积为200～300μl；饲喂的条件包括：将接入数头若蚜的含有mirna分子溶液的半封闭饲蚜器的底端与吸水纸密闭接触，然后将整个饲养体系放置在养虫室中，养虫室的温度为20±1℃，湿度60±10％，光周期l:d＝14h:10h。需要说明的是，两端开口的圆柱形玻璃管，使用前高温高压灭菌，垂直放置于吸水纸上，顶端利用石蜡薄膜(parafilm,美国)封口，在石蜡薄膜上方滴入mirna分子溶液，再封一层石蜡薄膜，制成“石蜡薄膜-mirna分子溶液-石蜡薄膜”的三明治结构；接入蚜虫后，将半封闭饲蚜器置于铺好吸水纸的托盘上，于养虫室中饲养，保证饲蚜器的底端口径与吸水纸密闭接触，是为了防止蚜虫逃逸。

优选地，数头为10～20头。

优选地，在麦株上生长期间，用养虫罩覆盖麦株，其目的是避免蚜虫逃逸。

mirnas主要通过转录调控、转录抑制、翻译抑制三个方式在后转录水平参与生物的个体发育、细胞分化、细胞凋亡和增殖等生命过程。由于mirna在昆虫发育中的重要作用，它们的表达抑制和过表达也许都会影响生物的正常发育。因mirna大小的限制，mirna的直接敲除并不能很好的实现。一般mirna功能的研究主要通过增强或减弱目的mirna的表达来鉴定。现在运用最多的就是利用特定的mirnas序列，化学合成mirna拮抗剂(mirnaantagomir)和mirna激动剂(mirnaagomir)，与普通的mirna抑制剂(mirnainhibitor)和mirna模拟物(mirnaminics)相比，具有更强的细胞亲和力、稳定性和抑制性。mirnaantgomir是根据mirna的成熟序列设计，经过一系列的化学修饰和特殊标记合成的单链小rna，能够通过与体内成熟mirna的竞争结合，阻断mirna与靶基因的结合，达到抑制mirna发挥作用。mirnaagomir是一种双链小rna，通过模拟体内mirna，与靶基因相互配对，增强目的基因在体内的表达。通过将mirnaagomir和mirnaantagomir导入生物体内，增强或减弱目的基因的在生物体内的表达，从而影响生物体正常的生长发育过程。尤其是那些防治害虫靶标基因针对性强，且沉默后对小麦害虫有致死性，这些基因可作为理想的候选基因资源，用于创制rnai介导的新型抗虫作物。

本发明设计合成的mirnaavi-mir-184-3pagomir(mirna激动剂)和mirnaavi-mir-184-3pantagomir(mirna拮抗剂)对蚜虫有致死性，为蚜虫的防控提供了一种有效的产品；并且，其作用的靶标基因可作为理想的候选基因资源，用于创制rnai介导的新型抗虫作物，为作物尤其是小麦害虫的防控提供了新的研究思路，具有很高的研究价值和广阔的应用前景。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中麦蚜在半封闭饲蚜器中的饲养示意图；

图2为本发明实施例中麦蚜经mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomir、agomirnc、antagomirnc和nc饲喂处理后的死亡率统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明实施例采用的蚜虫为麦长管蚜sitobionavenae(fabricius)。

实施例一：mirnaavi-mir-184-3pagomir和mirnaavi-mir-184-3pantagomir的设计与合成

以蚜虫的mirnaavi-mir-184-3p的成熟序列设计得到相应的mirnaavi-mir-184-3pagomir(mirna激动剂)和mirnaavi-mir-184-3pantagomir(mirna拮抗剂)。其中的mirnaavi-mir-184-3pagomir为双链结构，两条链的核苷酸序列分别如序列表中的seqidno：1和序列表中的seqidno：2所示；其中的mirnaavi-mir-184-3pantogimir为单链结构，其核苷酸序列如序列表中的seqidno：3所示。

为了更好的表征本发明提供的mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomir的效果，本发明还设计了阴性对照agomirnc和antagomirnc，其中的agomirnc的两条链的核苷酸序列分别如序列表中的seqidno：4和序列表中的seqidno：5所示，antagomirnc单链的核苷酸序列如序列表中的seqidno：6所示。

本发明提供的mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomir以及对应的阴性对照agomirnc和antagomirnc均是委托苏州吉玛基因股份有限公司进行设计合成的。具体序列信息如下表1所示。

表1mirnaagomir和antagomir的序列信息

对mirnaavi-mir-184-3pagomir的反义链(seqidno：2)进行修饰，得到：5’-cscsuuaucaguucuccguccsasusus-chol3’，修饰过程具体为：对反义链的3’端进行胆固醇修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，3’端进行四个硫代骨架修饰，最后全链进行甲氧基修饰。上面正义链(seqidno：1)是作用链，下面反义链是补上的辅助链，设计时错开前2个碱基进行反向互补设计，并在末端加uu悬垂便于解链。

其中的mirnaavi-mir-184-3pantogimir为单链结构(seqidno：3)，并且对其进行修饰，得到：5’-gscsccuuaucaguucuccguscscsas-chol3’，修饰过程具体为：对3’端进行胆固醇修饰，5’端进行两个硫代骨架修饰，3’端进行四个硫代骨架修饰，全链进行甲氧基修饰。

实施例二：采用mirnaavi-mir-184-3pagomir和mirnaavi-mir-184-3pantagomir饲喂蚜虫及引起的致死效果

1、mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomi、agomirnc和antagomirnc配制方法：

(1)用超纯水配置质量分数为30％的蔗糖溶液，然后采用0.2μm的微孔膜过滤灭菌，将得到的滤液分装于1.5ml的灭菌离心管中，置-20℃冰箱保存备用；

(2)利用质量分数为30％的蔗糖溶液将合成且修饰后的mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomir、agomirnc和antagomirnc分别稀释至浓度为300nm，得到mirnaavi-mir-184-3pagomir(+蔗糖溶液)、mirnaavi-mir-184-3pantagomir(+蔗糖溶液)、agomirnc(+蔗糖溶液)和antagomirnc(+蔗糖溶液)，备用。

2、mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomir、agomirnc、antagomirnc和nc饲喂蚜虫

(1)将蚜虫连续单头饲养3代，收集第4代无翅成蚜初产24h内生殖的若蚜，分别取10头放入含200μl的mirnaavi-mir-184-3pagomir(+蔗糖溶液)、mirnaavi-mir-184-3pantagomir(+蔗糖溶液)、agomirnc(+蔗糖溶液)、antagomirnc(+蔗糖溶液)和质量分数为30％的蔗糖溶液的半封闭饲蚜器中饲喂。其中，半封闭饲蚜器的制备方法包括如下步骤：将灭菌后的圆柱形玻璃管垂直放置于吸水纸上，顶端利用厚度为1μm的石蜡薄膜封口，在石蜡薄膜的上表面分别加入对应的溶液(即mirnaavi-mir-184-3pagomir(+蔗糖溶液)、mirnaavi-mir-184-3pantagomir(+蔗糖溶液)、agomirnc(+蔗糖溶液)、antagomirnc(+蔗糖溶液)、质量分数为30％的蔗糖溶液)，然后再用厚度为10μm的石蜡薄膜封顶，制成“石蜡薄膜-mirna分子溶液/蔗糖溶液-石蜡薄膜”的三明治结构，得到含有不同溶液的半封闭饲蚜器；并且，圆柱形玻璃的直径为2cm，高度为3cm，不同溶液的体积均为200μl。接入蚜虫后，将半封闭饲蚜器置于铺好吸水纸的托盘上，如图1所示，于养虫室中饲养，保证饲蚜器的低端口径与吸水纸密闭接触，防止蚜虫逃逸。饲喂的条件包括：将分别接入10头若蚜的含有对应溶液的半封闭饲蚜器放置在养虫室中，养虫室的温度为20±1℃，湿度60±10％，光周期l:d＝14h:10h。

(2)如上饲喂72h后，将饲蚜器中的若蚜分别接入到新鲜的盆栽麦株上，用养虫罩覆盖以免蚜虫逃逸，饲养期间记录蚜虫的死亡情况及个体发育情况，直到6-7天后发育为成蚜，统计每个处理的存活率。

为了保证可重复性，每种处理设置10次操作重复。

3、饲喂mirnaavi-mir-184-3pagomir、mirnaavi-mir-184-3pantagomir、agomirnc、antagomirnc和nc对蚜虫的致死效果

具体结果如图2和下表2所示：经统计学分析发现，饲喂mirnaavi-mir-184-3pagomir后麦蚜的死亡率是68.88±2.90％，饲喂mirnaavi-mir-184-3pantagomir后麦蚜的死亡率是56.00±2.92％，跟3个对照相比有显著性差异；饲喂antagomirnc对照组后麦蚜的死亡率是30.00±2.83％，饲喂agomirnc对照组后麦蚜的死亡率是16.00±2.90％，饲喂nc对照组后麦蚜的死亡率是9.00±2.63％。处理组和对照组之间均存在差异性显著(p<0.05)。

表2饲喂不同物质对蚜虫的致死效果

本发明设计合成的mirnaavi-mir-184-3pagomir(mirna激动剂)和mirnaavi-mir-184-3pantagomir(mirna拮抗剂)对蚜虫有致死性，为蚜虫的防控提供了一种有效的产品；并且，其作用的靶标基因可作为理想的候选基因资源，用于创制rnai介导的新型抗虫作物，为作物尤其是小麦害虫的防控提供了新的研究思路，具有很高的研究价值和广阔的应用前景。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

sequencelisting

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>人工设计合成的对蚜虫具有控害作用的mirna分子

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