桑脉带病毒的RT‑LAMP检测方法及其引物组、试剂盒以及应用与流程

本发明属于桑脉带病毒检测领域，尤其涉及一种桑脉带病毒的rt-lamp检测方法及其引物组、试剂盒以及应用。

背景技术：

在国家实施“东桑西移”产业结构调整战略和东部地区产业转移等因素推动下，广西桑蚕产业自“十五”以来迅猛发展，从2005年以来，广西蚕茧产量已连续12年居全国第一。桑蚕业的迅猛发展为广西农民增收、农业增效、县域经济大发展和新农村建设作出了重要贡献，也已成为广西的新兴优势产业，更是部分地区的主要支柱产业。然而，桑树病毒病在广西桑蚕区发生严重，发生率为40％左右，个别桑园发病率甚至达到80％，已成为广西桑树的主要病害之一，严重影响了广西桑蚕业的发展。

桑脉带病毒(mulberryveinbandingvirus,mvbv)是广西桑树病毒病主要病原，该病毒是番茄斑萎病毒属(tospovirus)新成员，与西瓜银色斑驳病毒血清型病毒具有较近的亲缘关系。然而，由于桑脉带病毒是近年新发现的侵染桑树的病毒，尚未建立系统的检测方法，有必要开发一种快速、准确的mvbv检测方法，以满足桑蚕产业需求。

目前检测植物病毒的方法主要是反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)和酶联免疫吸附法(elisa)，这两种方法均存在不足：rt-pcr需要购买专业的pcr仪，且反应时间较长；elisa需要制备高质量的病毒血清，检测时间亦长，且灵敏度相对分子生物学方法低。此外，番茄斑萎病毒属(tospovirus)成员中，如果其n蛋白的同源性高，氨基酸水平一致性达到50％，采用elisa检测还会出现交叉反应，产生假阳性的结果。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术是日本学者notomi在2000年建立的一种核酸扩增方法，该方法具有检测速度快、灵敏度高、无需专业仪器等优点。rt-lamp检测是在lamp检测的基础上加入反转录酶，把反转录与靶基因扩增结合，在60-65℃温度进行反应，反应结束后通过加入荧光染料即可观察到结果。目前rt-lamp已经广泛运用到人类、动/植物病毒的检测和快速诊断。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、简便的桑脉带病毒的rt-lamp检测方法及其引物组、试剂盒以及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

桑脉带病毒的rt-lamp检测引物组，包括外侧引物对mvbv-f3和mvbv-b3、内侧引物对mvbv-fip和mvbv-bip，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的碱基序列。

上述桑脉带病毒的rt-lamp检测引物组在检测桑脉带病毒方面的应用。

桑脉带病毒的rt-lamp检测试剂盒，包括rt-lamp检测引物组、rt-lamp反应液、酶溶液和核酸荧光染料；rt-lamp检测引物组包括外侧引物对mvbv-f3和mvbv-b3、内侧引物对mvbv-fip和mvbv-bip，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的碱基序列。

rt-lamp反应液含有20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100(ph8.8)，1mbetaine，10mmdntps。

酶溶液含有bstdna聚合酶和amv逆转录酶。

核酸荧光染料为sybrgreenⅰ(10000×)。

上述桑脉带病毒的rt-lamp检测试剂盒，还包括阳性对照和阴性对照；阳性对照为感染mvbv的桑叶组织，阴性对照为健康桑叶组织。

上述桑脉带病毒的rt-lamp检测试剂盒在检测桑脉带病毒方面的应用。

桑脉带病毒的rt-lamp检测方法，以待测样品的总rna为模板，利用rt-lamp检测引物组进行rt-lamp扩增反应，以检测待测样品是否感染桑脉带病毒；rt-lamp检测引物组包括外侧引物对mvbv-f3和mvbv-b3、内侧引物对mvbv-fip和mvbv-bip，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的碱基序列。

rt-lamp扩增反应的反应体系和反应条件分别为：

反应体系：共25μl，包含以下组分：rt-lamp反应液12.5μl，酶溶液1μl，浓度20μm的mvbv-fip、mvbv-bip各2μl，浓度20μm的mvbv-f3、mvbv-b3各0.5μl，模板2μl，加rnasefreeh2o至25μl，反应结束加入1μl核酸荧光染料(稀释10倍)；

反应条件：在63℃恒温下，扩增60min，80℃，反应5min使酶失活

本发明采用环介导等温扩增(lamp)技术，并根据桑脉带病毒的基因序列设计了相应的rt-lamp检测引物组，包括外侧引物对mvbv-f3和mvbv-b3、内侧引物对mvbv-fip和mvbv-bip。由此发明了桑脉带病毒的rt-lamp检测方法及试剂盒。本发明是检测桑脉带病毒的首个rt-lamp检测方法，应用本发明的检测方法及试剂盒，仅需通过对疑似感染的待测样品进行rna提取并进行环介导等温扩增，一步完成逆转录和扩增步骤，反应结束后加入核酸荧光染料，直观地根据反应液颜色变化判断，若反应液显绿色，则判断为阳性；若反应液为橙色，则判断为阴性；因而可能快速、准确、高效地检测出是否感染桑脉带病毒。总之，本发明用于检测桑脉带病毒具有特异性强、操作简单和灵敏度高的特点，不需要专门仪器，能通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，适用于桑苗繁育和田间桑树上mvbv的检测，不仅可应用于桑脉带病毒病的早期诊断、流行学等研究，而且适合于在基层单位开展mvbv检测。

附图说明

图1是rt-lamp产物可视化图分析图，图中：1携带mvbv桑叶样品(rt-pcr检测确定含有mvbv的样品，阳性对照)，2健康桑叶样品(rt-pcr检测确定不含有mvbv的样品，阴性对照)。

图2是rt-lamp特异性分析图，图中：1表现为典型脉带症状的桑叶样品，2番茄环纹斑点病毒(tomatozonatespotvirus,tzsv)样品，3朱顶红褪绿环斑病毒(hippeastrumchloroticringspotvirus，hcrv)样品。

图3是rt-lamp灵敏度可视化结果分析图，图中：1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、阴性对照(健康桑叶样品)。

图4是rt-lamp灵敏度电泳结果分析图，图中：m：generuler1kbplusladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、阴性对照(健康桑叶样品)。

图5是rt-pcr灵敏度电泳结果分析图，图中：m：generuler1kbplusladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、阴性对照(健康桑叶样品)。

图6是rt-lamp检测田间桑病样检测结果分析图，图中：1阴性对照；2阳性对照；3-8田间样品。

具体实施方式

实施例1mvbvrt-lamp检测试剂盒的制备

1.1试剂

引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；植物总rna提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；bstdna聚合酶及其反应缓冲液购自newenglandbiolabs(neb)公司，amv逆转录酶购自promega公司，核酸荧光染料为sybrgreenⅰ(10000×)购自上海索莱宝生物科技有限公司，betaine购自生工生物工程(上海)股份有限公司，dntps购自宝生物工程(大连)有限公司(takara)。引物组保存于-20℃冰箱，其他试剂按照对应产品说明书描述的条件进行保存条件。

1.2试剂盒的组装

试剂盒包含rt-lamp引物组、rt-lamp反应液、酶溶液和核酸荧光染料。

rt-lamp引物组：包括外侧引物对mvbv-f3(seq.id.no.1)和mvbv-b3(seq.id.no.2)、内侧引物对mvbv-fip(seq.id.no.3)和mvbv-bip(seq.id.no.4)。

rt-lamp反应液含有20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100(ph8.8)，1mbetaine，10mmdntps。

酶溶液：8单位(u)的bstdna聚合酶和2单位的amv逆转录酶

核酸荧光染料：sybrgreenⅰ(10000×)。

阳性对照：含有mvbv的显症桑叶。

阴性对照：不含有mvbv的健康桑叶(经rt-pcr方法检测确认)。

实施例2rt-lamp检测方法检测mvbv及其特异性

检测样品3份，其中显症桑叶1份、被番茄环纹斑点病毒(tzsv)侵染的烟草样品1份和被朱顶红褪绿环斑病毒感染的水鬼蕉1份。

采用实施例1的试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品总rna：利用天根生化科技(北京)有限公司总rna提取试剂盒提取待测样品总rna。

(2)建立rt-lamp反应体系：在薄壁pcr管中建立25μl的反应体系：rt-lamp反应液12.5μl，酶溶液1μl，外侧引物mvbv-f3、mvbv-b3各0.5μl(20μm)，内侧引物mvbv-fip、mvbv-bip各2.0μl(20μm)，步骤1获得的总rna模板2μl，加rnasefreeh2o至25.0μl；含有mvbv的桑叶的总rna为对照，健康桑叶的总rna为阴性对照。

(3)rt-lamp反应的条件：在63℃恒温条件下，扩增60min，在80℃条件下反应5min使酶失活；

(4)分析判断反应结果：反应结束，在步骤“(3)”获得的反应液中加入1μl核酸荧光染料sybrgreenⅰ(10000×)(稀释10倍)，若为反应液颜色为绿色则判定为阳性反应，为橙色则判定为阴性反应。

如图1所示，rt-lamp反应的结果显示，阳性对照的反应液变为绿色，而阴性对照的反应液保持橙色不变，表明检测能正常检测出目标病毒mvbv。图2显示，待测显症桑叶样品的反应液变为绿色，而烟草番茄环纹斑点病毒(tzsv)样品和朱顶红褪绿环斑病毒的反应液保持橙色不变，说明rt-lamp仅检测出目标mvbv，不能检测出同一血清型的番茄环纹斑点病毒(tzsv)和同属的朱顶红褪绿环斑病毒，表明引物具有较强的特异性。

实施例3mvbvrt-lamp检测方法的敏感性试验

按照实施例2提取的含有mvbv的桑病叶组织的总rna，利用微量分光光度计测其浓度，取总rna浓度为10ng/μl的核酸模板进行检测。按照10倍比例进行稀释后用作模板，共设10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl和10fg/μl共7个梯度。分别进行rt-lamp检测和常规rt-pcr检测，rt-lamp检测步骤同实施例2中的(2)-(4)。

rt-pcr检测：采用对应的总rna作为模板，rt-pcr反应扩增体系按诺唯赞生物科技有限公司的一步法rt-pcr试剂盒说明进行，反应体系组成为：2×onestepmix25μl，onestepenzymemix2.5μl，上游引物mvbv-n-f(10μm)1μl、下游引物mvbv-n-r(10μm)1μl，模板1μl，加水至50μl。反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35个循环；72℃终延伸7min。反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35个循环；72℃终延伸7min；4℃保存。取1.0μlpcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

rt-pcr的引物序列如下：

mvbv-n-f：5'-atgtctaccgtccgtcagctg-3'(seq.id.no.5)，

mvbv-n-r：5'-acttctatagaattagaagtgcttgg-3'(seq.id.no.6)。

结果显示，使用rt-lamp方法检测，当模板含量为100fg时，反应液呈绿色(阳性反应)，电泳时条带清晰可见(图3、图4)；使用rt-pcr方法检测，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测rt-pcr扩增产物，当模板含量为1pg时，扩增条带较弱；当模板含量为100fg时，已无明显的可见特性条带(图5)。本发明的rt-lamp检测方法比常规rt-pcr检测方法的灵敏度高10倍。

实施例4mvbvrt-lamp的检测试剂盒的应用

采集桑树样品，包含显症样品、可能携带mvbv隐症样品和健康无mvbv样品为试验材料，桑脉带病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法同实施例1和案例2。将所提取的桑叶组织总rna作为模板，进行rt-lamp检测。rt-lamp检测结果如图6所示，6份待测桑叶样品中，3、5、7、8号样品显示为绿色，表明这4个样品中含有病毒，4、6号样品显示为橙色，表明这2个样品中没有病毒样品。其中3号样品为无症状的隐症样品，说明rt-lamp方法检测到隐症样品中的目标病毒。

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