一种检测多种羊巴贝斯虫的方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及一种可检测多种羊巴贝斯虫的方法及其检测试剂盒，特别是一种用于检测羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种的方法及检测试剂盒。

背景技术：

羊巴贝斯虫病（ovinebabesiosis）是由媒介蜱传播的巴贝斯属（babesia）的多种巴贝斯虫寄生于羊红细胞内而引起的一种血液原虫病。感染动物表现高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等临床症状，严重感染时甚至可以引起死亡。目前，报道且命名的羊巴贝斯虫种主要有绵羊巴贝斯虫（b.ovis）、莫氏巴贝斯虫（b.motasi）和粗糙巴贝斯虫(b.crassa)。绵羊巴贝斯虫致病性最强，莫氏巴贝斯虫次之，粗糙巴贝斯虫几乎没有致病性。绵羊巴贝斯虫和莫氏巴贝斯虫的传播媒介分别为扇头蜱（rhipicephalus）和血蜱（haemaphysalis）属的蜱种，粗糙巴贝斯虫的传播媒介尚不清楚。莫氏巴贝斯虫的不同地理分离株生物学特性存在较大差异，根据致病性的不同，目前的观点是其至少包含两个种或亚种（uilenberg,2006）。

我国对羊巴贝斯虫病的研究起步较晚，最早在四川（1982年）和黑龙江（1986年）有过相关报道。之后，在云南、山西、河南和甘肃等省份也有零星的报道，但一直没有分离到病原。自1996年已来，中国农业科学院兰州兽医研究所先后从甘肃、新疆、河北、辽宁、湖北、河南等地分离到9株羊的巴贝斯虫，通过对其生物学特性和分子分类学的研究表明这些巴贝斯虫可以分为两个种，即莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种(babesiasp.)(guanetal.,2002,2009;liuetal.,2007;niuetal.,2009)。而莫氏巴贝斯虫不同分离株又可分为两个亚种，代表株分别为临潭/天祝株和宁县/河北株(baietal.,2002;guanetal.,2002;liuetal.,2007b；niuetal.,2009a)。然而目前对于这些羊的巴贝斯虫尚未进行统一命名，主要原因是对其部分基因组学的研究工作尚未完成。因此目前暂将其分别称为羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种。此外，通过多年的研究，建立了可鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的多种分子生物学和血清学检测技术，如lamp、rlb和elisa等方法，同时应用这些方法对我国不同地区羊的巴贝斯虫感染状况的调查研究。2008年guan等建立了能特异性检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫的lamp方法，并应用此方法分别对采自甘肃甘南州和新疆伊犁共510份血液样品进行了检测，结果显示莫氏巴贝斯虫的阳性率为14.3%，羊巴贝斯虫未定种阳性率为3.5%（guanetal.,2008）；2009年niu等应用建立的rlb方法对采自我国5省份的1234份羊的血样进行了巴贝斯虫的检测，结果表明莫氏巴贝斯虫平均阳性率为0.73%（niuetal.,2009a）；2012年-2013年间，guan等和wang等利用莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种的可溶性虫体抗原建立的elisa方法，对我国22个省份羊巴贝斯虫病的流行状况进行调查，结果显示在这22个省份中莫氏巴贝斯虫的平均阳性率为43.5%（guanetal.,2012a），羊巴贝斯虫未定种的为31.66%（wangetal.,2013）。这些结果表明羊巴贝斯虫病在我国普遍流行，严重危害我国养羊业的健康持续发展。

中国发明专利2015100354937公开一种可准确检测与区分羊莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对及检测试剂盒，该专利试剂盒内有可用于检测羊莫氏巴贝斯虫的引物对和用于检测羊巴贝斯虫未定种新疆株的引物对基因序列对以及探针。该专利的靶基因是18srrna，其检测需要用很昂贵的real-timepcr仪，其可检测仅是针对羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫两个种，而且在检测时需要分别在两个pcr管中进行扩增反应，检测所用的试剂价格也较高。

建立快速、灵敏、准确、操作方便的检测方法，以配合该病的防控计划的实施，是控制该病在我国的流行的先决条件。然而常规的血涂片显微镜检测方法虽然视为巴贝斯虫病诊断的金标准，但在感染早期或持续感染期（这些时期染虫率较低）很难在显微镜下检查出病原。同时在形态学上很难区分不同巴贝斯虫虫种，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性；目前建立的pcr、lamp、rlb和real-timepcr等分子检测方法，无法区分莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种，而且操作繁琐，确定同一份样本感染的巴贝斯虫种类需要进行多次检测，导致容易污染出现假阳性；抗体检测技术（如elisa），容易出现交叉反应，较难于区分不同病原的感染。

技术实现要素：

本发明提供一种可克服现有技术不足的，可用于检测多种羊巴贝斯虫的试剂盒。

本发明的检测羊巴贝斯虫的方法是以羊巴贝斯虫血小板反应蛋白相关匿名蛋白trap基因作为检测标识。

本发明的可检测多种羊巴贝斯虫的试剂盒中包括有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、和seqidno.6三对引物。其中：第一对特异性引物为羊巴贝斯虫未定种的特异性正向和反向引物：

bsp-f：5’-aaataaaggagcacaaacac-3’（seqidno.1）

bsp-r:5’-ggcaagcctcctctcttcttcct-3’(seqidno.2)；

第二对特异引物为莫氏巴贝斯虫lz亚种的特异性正向和反向引物：

bmlz-f：5’-tatctcaagtaaaggactg-3’(seqidno.3)

bmlz-r：5’-cgcctactctttccgtgggcacct-3’(seqidno.4)；

第三对特异引物为莫氏巴贝斯虫nb亚种的特异性正向和反向引物：

bmnb-f：5’-tatctcaaacaaaggacag-3’(seqidno.5)；

bmnb-r：5’-tcactaggggttgttacgtt-3’(seqidno.6)。

为方便应用，本发明的可检测多种羊巴贝斯虫的试剂盒内还有标准羊巴贝斯虫未定种阳性基因组dna、标准莫氏巴贝斯虫lz亚种基因组dna、标准莫氏巴贝斯虫nb亚种基因组dna、标准巴贝斯虫阴性羊基因组dna和预混pcr反应缓冲液premixtaq。

本发明的试剂盒及检测方法是一种多重pcr方法，是以巴贝斯虫血小板反应蛋白相关匿名蛋白（thrombospondin-relatedanonymousprotein，trap）基因为检测标识。该基因为是编码蛋白的基因，本发明人相关的实验表明trap在种和亚种间差异性较18srrna基因大，因此更加适合作为鉴别检测不同种和亚种的靶标基因。因此，通过序列比对，在trap蛋白基因序列的差异区段，设计羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种特异的三对特异引物，用于田间检测和区分上述三种巴贝斯虫种类，同时也可用于实验室虫种的鉴定。前期研究中发明人获得了羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种6个虫株的血小板反应蛋白相关匿名蛋白（trap）基因的全长序列，序列比对分析结果显示，种内该基因高度保守（相似性为99.8%-100%），而种/亚种间差异较大，羊巴贝斯虫未定种与莫氏巴贝斯虫trap蛋白基因的相似性只有55.4-56.1%；莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种的相似性为74-74.6%。因此该基因可作为鉴别检测这些寄生虫感染的靶标基因，用于建立鉴别检测这三个巴贝斯虫的分子检测方法。

本发明在检测时是自待检样品中提取基因组dna，将dna样品与pcr反应预混缓冲液premixtaq、pcr用水、羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种的特异性引物混匀，在pcr仪中进行扩增，扩增产物在1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭或其他核酸染色试剂）中电泳，然后在紫外凝胶成像仪中观察，根据扩增产物片段大小即可确认被检样本中是否感染羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种或莫氏巴贝斯虫nb亚种。本发明在一个pcr反应管中就可以快速、特异的鉴别检测同一份样本中感染多种巴贝斯虫的种类。

本发明实际上是一种采用多重pcr扩增技术建立的区分巴贝斯虫种类的分子检测方法。多重pcr是在同一pcr管中加入多对特异性引物和多个dna模板，引物可以特异性的分别与其对应的靶标分子模板反应，在一个pcr反应中同时扩增多个目标dna分子，从而实现在同一样本中同时鉴别检测多种微生物的目的。相比其他分子检测技术，该方法操作简单、快速，不仅具有高效性，而且节约成本，适用于病原的快速检测，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。目前，国内尚无鉴别检测羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种的多重pcr方法的报道。

本发明利用顶复门寄生虫入侵宿主细胞过程中的参与虫体运动和黏附宿主细胞功能的trap蛋白基因为鉴别检测三种巴贝斯虫的靶标基因，该基因在种内高度保守（相似性为99.8%-100%），而种/亚种间差异较大（种间相似性为55.4-56.1%，亚种间的相似性为74-74.6%）。本发明准确利用该基因的这一特点，设计特异性鉴别检测这三种寄生虫感染的多重pcr引物，该引物只能特异性的检测到对应的巴贝斯虫种，未能检测到感染羊的其他梨形虫和无浆体，且灵敏度较高。从而提供了一种快速、灵敏、准确、操作方便的可在一个pcr管中同时鉴别检测羊巴贝斯虫种类的方法，填补了技术空白。从现有技术层面分析，目前，国内尚无这样优化的进行鉴别检测羊巴贝斯虫的多重pcr方法。本发明中，所用的特异性引物是基于羊的这三种巴贝斯虫trap蛋白基因的变异区设计的，这一点恰好体现了所选的靶标基因在种间差异性较大的特点。通过对该方法条件的优化，使本发明具有良好的特异性、敏感性和重复性，可用于羊和传播媒介蜱体内不同种羊巴贝斯虫的快速鉴别检测。

附图说明

图1多重pcr引物反应性评价结果。其中m为dna标准分子量dl5000,1为羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种基因组dna混合物，2为阴性质控标准品pcr用水。

图2多重pcr特异性评价结果。其中m为dna标准分子量dl5000,1-2分别为羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株的基因组dna，3-4分别为莫氏巴贝斯虫lz亚种临潭株和天祝株的基因组dna，5-6分别为莫氏巴贝斯虫nb亚种河北株和宁县株的基因组dna，7为羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种基因组dna混合物，8-12分别为尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、羊无浆体、巴贝斯虫阴性羊基因组dna及阴性质控标准品pcr水。

图3多重pcr的敏感性评价结果。其中m为dna标准分子量dl5000,1-10分别为含三种巴贝斯虫基因组dna各0.1pg、1pg、10pg、100pg、250pg、500pg、750pg、1ng、5ng、10ng的样品。

具体实施方式

以下提供本发明的具体实施方式，本发明的检测方法在200μl的pcr管中进行，所用引物和试剂如下：

（1）特异性引物

羊巴贝斯虫未定种的特异性正向和反向引物：

bsp-f：5’-aaataaaggagcacaaacac-3’

bsp-r:5’-ggcaagcctcctctcttcttcct-3’，扩增的目的片段大小为566bp。

莫氏巴贝斯虫lz亚种的特异性正向和反向引物：

bmlz-f：5’-tatctcaagtaaaggactg-3’

bmlz-r：5’-cgcctactctttccgtgggcacct-3’，扩增的目的片段大小为1486bp。

莫氏巴贝斯虫nb亚种的特异性正向和反向引物：

bmnb-f：5’-tatctcaaacaaaggacag-3’

bmnb-r：5’-tcactaggggttgttacgtt-3’，扩增的目的片段大小为2094bp。

（2）标准羊巴贝斯虫未定种阳性基因组dna（30ng/μl）

（3）标准莫氏巴贝斯虫lz亚种基因组dna（30ng/μl）

（4）标准莫氏巴贝斯虫nb亚种基因组dna（30ng/μl）

（5）标准巴贝斯虫阴性羊基因组dna（30ng/μl）

（6）pcr用水（同时作为阴性质控标准品）

（7）预混pcr反应缓冲液premixtaq（2×）

（8）6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、40%的蔗糖水溶液）

（9）1×tae缓冲液（0.04m的tris-乙酸，0.001m的edta）

（10）1%琼脂糖凝胶（50ml1×tae缓冲液中加入0.5g琼脂糖，加热融化并冷却到大约60℃后加入溴化乙锭或其他核酸染色试剂）

本发明的具体操作方法如下：

1、多重pcr引物反应性评价

多重pcr反应体系为25μl：premixtaq（2×）12.5μl，六条特异性引物混合物1μl（其中bsp-f/bsp-r和bmlz-f/bmlz-r的终浓度为1μmol，bmnb-f/bmnb-r的终浓度为2.5μmol），基因组dna模板2μl（阳性对照反应管中加入三种巴贝斯虫基因组dna混合物，每种巴贝斯虫基因组dna的终浓度为3ng/μl，阴性质控反应管中加入pcr用水）,pcr用水9.5μl。将上述反应液混匀后在pcr仪中进行扩增，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃30s、57℃40s、72℃2min，扩增30个循环，再72℃延伸10min，最后12℃保存。将pcr产物进行1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭或其他核酸染色试剂）电泳，紫外凝胶成像仪中观察扩增结果。结果如图1显示，阳性反应管中扩增出3条条带（泳道1），大小大约分别为600、1500和2000bp，与预期结果相符；而阴性质控反应管中没有条带扩增出（泳道2），表明本次扩增结果可靠。另外通过序列测定分析结果显示，阳性反应管中扩增出的3条带的序列分别对应于羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种trap蛋白基因的序列，与原序列相似性为100%，表明该多重pcr的引物反应性良好。

2、多重pcr特异性评价

在上述1的多重pcr方法反应体系中，分别对羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、莫氏巴贝斯虫lz亚种临潭株和天祝株、莫氏巴贝斯虫nb亚种河北株和宁县株以及此3个巴贝斯虫种/亚种基因组dna混合物进行扩增，同时设立尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、羊无浆体、巴贝斯虫阴性羊基因组dna及阴性质控pcr水的扩增对照（加入的基因组dna终浓度都为3ng/μl）。扩增产物同上进行凝胶电泳，分析该多重pcr方法的特异性。结果如图2显示，羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株反应管中扩增出大约600bp的条带（泳道1-2），莫氏巴贝斯虫lz亚种临潭株和天祝株的反应管中扩增到大约1500bp的条带（泳道3-4），莫氏巴贝斯虫nb亚种河北株和宁县株反应管中扩增出大约2000bp的条带（泳道5-6），3个巴贝斯虫种/亚种基因组dna混合物反应管中扩增出3条条带，大小分别约为600、1500和2000bp（泳道7）。而尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫、羊无浆体、巴贝斯虫阴性羊基因组dna及阴性质控的pcr水对照反应管中没有扩增出条带（泳道8-12）。表明该多重pcr方法具有较好的特异性，可用于鉴别检测这3种巴贝斯虫感染。

（3）多重pcr敏感性评价

将羊巴贝斯虫未定种、莫氏巴贝斯虫lz亚种和莫氏巴贝斯虫nb亚种的基因组dna分别稀释成0.1pg/μl、1pg/μl、10pg/μl、100pg/μl、250pg/μl、500pg/μl、750pg/μl、1ng/μl、5ng/μl、10ng/μl10个浓度梯度，每次反应分别取3种巴贝斯虫相同浓度基因组dna各1μl，加入对应的pcr管中，同时将pcr用水调整为8.5μl，其他反应条件同前进行多重pcr扩增，评价其敏感性。结果如图3显示，当加入的3种巴贝斯虫基因组dna浓度大于100pg/μl时，可扩增出对应的3条带，即该多重pcr可检测到3种巴贝斯虫的最低基因组dna量为100pg，对应的染虫率为0.001%（guanetal.,2008）。结果表明该多重pcr方法具有较高的敏感性，可用于在田间鉴别检测这3种巴贝斯虫的调查。

（4）多重pcr重复性分析

用建立的多重pcr方法，分别对巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、莫氏巴贝斯虫lz亚种临潭株和天祝株及莫氏巴贝斯虫nb亚种河北株和宁县株的单一虫株基因组dna样本、3种巴贝斯虫混合基因组dna及巴贝斯虫阴性羊基因组，在不同时间重复检测3次，3次结果均一致——只扩增到对应虫种预期大小的目的条带，巴贝斯虫阴性羊基因组未扩增出条带，表明建立的多重pcr检测方法结果稳定、重复性好。

（5）田间样本的检测

应用本发明建立的多重pcr方法对采自新疆和甘肃省的750份绵羊样本进行检测。结果显示，在新疆采集的379份绵羊基因组中，检测到7份（1.85%）羊巴贝斯虫未定种的感染，没有检测到莫氏巴贝斯虫感染的样本；在甘肃采集的271份绵羊基因组中，检测到1份（0.37%）羊巴贝斯虫未定种感染的样本，10份（3.69%）莫氏巴贝斯虫lz亚种感染的样本。本次田间样本的检测没有检测到莫氏巴贝斯虫nb亚种感染的样本，这些结果与每种巴贝斯虫媒介蜱的分布、采样地点及前期使用lamp、rlb和real-time方法调查的结果基本相一致。

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种可检测多种羊巴贝斯虫的试剂盒

<160>6

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列bsp-f

<400>

aaataaaggagcacaaacac20

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列bsp-r

<400>

ggcaagcctcctctcttcttcct23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列bmlz-f

<400>

tatctcaagtaaaggactg19

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列bmlz-r

<400>

cgcctactctttccgtgggcacct24

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列bmnb-f

<400>

tatctcaaacaaaggacag19

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列bmnb-r

<400>

tcactaggggttgttacgtt20