绝经后妇女原发性骨质疏松症的诊断工具的制作方法

本发明属于诊断领域，涉及一种绝经后妇女原发性骨质疏松症的诊断工具，还涉及血液中dhrs12基因在制备绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断工具中的应用。

背景技术：

骨质疏松症(osteoporosis，op)是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病(who)。2001年美国国立卫生研究院(nih)提出骨质疏松症是以骨强度下降、骨折风险性增加为特征的骨骼系统疾病，骨强度反映了骨骼的两个主要方面，即骨矿密度和骨质量。

该病可发生于不同性别和任何年龄，但多见于绝经后妇女和老年男性。骨质疏松症分为原发性和继发性两大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(i型)、老年性骨质疏松症(ii型)和特发性骨质疏松(包括青少年型)3种。绝经后骨质疏松症一般发生在妇女绝经后5-10年内，因绝经后卵巢合成雌激素减少所致，为骨量减少和骨组织微结构破坏，以致骨骼脆性增高从而易发生骨骼的一种全身性疾病。女性绝经后骨密度(bonemineraldensity，bmd)丢失速度很快，年丢失率为1.5％-2.5％，从而导致骨密度急剧下降，使得绝经后女性成为骨质疏松症的高发人群。

具有以下高危因素者易患绝经后骨质疏松症：

雌激素缺乏：雌激素缺乏，被认为是引起绝经后骨质疏松症的主要因素，绝经后卵巢功能减退，分泌雌激素水平降低，同时伴有维生素d、钙的摄入不足，造成继发性骨丢失。

遗传因素：骨质疏松症多见于白种人，其次是黄种人，而黑种人最少。骨密度为诊断骨质疏松症的主要指标，骨密度值主要决定于遗传因素，其次是受环境因素的影响。

营养因素：钙缺乏，已发现青幼年时钙的摄入量与成年人的骨量峰直接有关。低钙饮食(<10mg·kg^-1·d^-1)者有3/4患有骨质疏松，而高钙饮食(10mg·kg^-1·d^-1)者有1/4患有骨质疏松；长期蛋白质营养缺乏，造成血浆蛋白降低，骨基质合成不足，新骨生成落后，如同是伴有钙的缺乏，骨质疏松会加快出现；维生素c缺乏，是骨基质羟脯氨酸合成不可缺少的，如缺乏可使骨基质合成减少。

废用因素：肌肉对骨组织是一种机械力的影响，肌肉发达则骨骼粗壮，骨密度高。老年人活动减少，肌肉强度减弱，机械刺激减少，骨量减少。同时肌肉强度的减弱和协调障碍是老年人较容易摔倒，伴骨量减少时，则已发生骨折。

其他因素：酗酒、嗜烟、过多咖啡和咖啡因的摄入、肝素使用均是本病的危险因素。酒精中毒可影响钙的吸收，酒精也直接作用于成骨细胞，抑制骨的形成。咖啡因摄入过多是尿钙和内源性粪钙丢失：肝素可引起骨质疏松，一般研究表明每天接受1500u以上的肝素治疗患者中60％的发展成为骨质疏松症。

此外，年龄增长、服用皮质类固醇和抗惊厥药物、具有骨质疏松症家族史或具有影响骨量的特殊基因、早绝经或绝经前行双侧卵巢切除术也是绝经后骨质疏松症的高危因素。

绝经后骨质疏松症早期可以没有任何症状，骨质在不知不觉中流失，直到发生骨折后才被意识到，亦被称之为“无声杀手”，由于早期没有典型的临床症状，所以常常不能引起医患足够的重视，以致许多患者只能无奈的面对从病痛到恢复的漫漫长路。

诊断骨质疏松症，首先必须进行骨密度的测定。骨密度实际上就是表示骨的健康程度，或是反过来说表示骨的老化程度。常用的检测手段：

x线摄片法：使用历史最早，但由于有放射性，其测验结果不能量化，已逐渐被取代。

单光子测定仪：费用低、方便、辐射量小而安全。但因不能测躯干骨以及不能区别皮质骨、松质骨、软组织等而受限制，已逐渐被取代。

定量超声法：低廉、方便、又无放射性损伤。适合各年龄段人群的骨状态普查工作。不仅能检测骨密度，还能了解骨的质量即可反应骨的微结构及弹性。但目前只用于跟骨、胫骨和指骨，不能进行全身骨骼的检测。

双能x线吸收法：是目前最理想的测定法，是诊断骨质疏松症的金标准，国内外通用，可测全身各部位骨骼，也能测软组织厚度，但该设备数量较少且价格昂贵，因此对于骨质疏松症患者的诊断来说经济负担大。为此寻找一种敏感性高、准确度高且价格合理的诊断骨质疏松症的方法是亟待解决的问题。

近年来，遗传因素已经成为了骨生物学中最活跃的研究领域之一，很多基因已经被确定为调节古骨密度的候选基因。这些候选基因大多数都是影响骨代谢的基因。如维生素d受体(vdr)、脂蛋白受体相关基因5(lrp5)、i型胶原蛋白(colia1)、雌激素受体α、转化生长因子tgfβ1、骨形态发生蛋白(bmps)、runx2、osterix(osx)、sclerostin、tcirg1、igf-1、il-1(骨质疏松症，张弛，中国骨质疏松杂志，2010年10月，802-813)。此外，已经有相当数量的专利申请涉及骨质疏松症的基因诊断，如申请号为：201610272604.0、201610922798.4、201510628024.6、201510628081.4、201510725408.x、201510628042.4、201610530383.2、201510629348.1、201510627056.4、201510627060.0、201610555353.7的专利。可见利用基因来诊断骨质疏松症成为了今后骨质疏松症早期诊断的发展趋势。

技术实现要素：

本发明首次发现dhrs12(dehydrogenase/reductase12)基因在绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的血液中的含量比正常人低很多，dhrs12基因的差异表达可作为诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的一种方法，据此可以开发诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的工具。

具体的，本发明提供了检测dhrs12基因表达的产品在制备诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测产品包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测dhrs12基因的表达水平以诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品。

进一步，所述用rt-pcr诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增dhrs12基因的引物；所述用实时定量pcr诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增dhrs12基因的引物；所述用免疫检测诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品包括：与dhrs12蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品包括：与dhrs12基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与dhrs12蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与dhrs12基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量pcr诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增dhrs12基因的引物的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测dhrs12基因表达的产品可以应用于该平台实现对dhrs12基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知dhrs12基因的异常与绝经后妇女原发性骨质疏松症相关也属于dhrs12基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的工具，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测dhrs12基因转录水平的针对dhrs12基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的dhrs12蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括dhrs12基因在内的多个基因(例如，与绝经后妇女原发性骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括dhrs12蛋白在内的多个蛋白质(例如与绝经后妇女原发性骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与绝经后妇女原发性骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高绝经后妇女原发性骨质疏松症诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测dhrs12基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括dhrs12蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用rt-pcr、实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测dhrs12基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对dhrs12基因的引物和/或探针。根据dhrs12基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测dhrs12基因表达水平的引物和探针。

所述高通量测序平台包括检测dhrs12基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测dhrs12基因的转录水平。

与dhrs12基因的核酸序列杂交的探针可以是dna、rna、dna-rna嵌合体、pna或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述dhrs12蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述dhrs12蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能够保留与dhrs12蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对dhrs12基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物如seqidno.4所示。

用于诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的dhrs12基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组dna的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症的dhrs12基因及其表达产物的来源是血液。在发明的具体实施方案中，血液是取自绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常骨密度女性的血液。

本发明的dhrs12基因的具体序列可在国际公共核酸序列数据库genebank中查询到。

本发明的dhrs12基因的编码序列包括以下任一一种dna分子：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码相同功能蛋白质的dna序列；

(3)与(1)或(2)限定的dna序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的dna分子。

在本发明的具体实施方案中，所述dhrs12基因的编码序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本发明的上下文中，dhrs12基因表达产物包括dhrs12蛋白以及dhrs12蛋白的部分肽。所述dhrs12蛋白的部分肽含有与绝经后妇女原发性骨质疏松症相关的功能域。

“dhrs12蛋白”包括dhrs12蛋白以及dhrs12蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括dhrs12蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与dhrs12的dna杂交的dna所编码的蛋白质。

优选地，dhrs12蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与seqidno.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与seqidno.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述dhrs12蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是dhrs12蛋白的融合蛋白。对于与dhrs12蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留dhrs12蛋白的生物学活性即可。

本发明的dhrs12蛋白也包括对seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留dhrs12蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断绝经后妇女原发性骨质疏松症”既包括判断绝经后妇女是否已经患有原发性骨质疏松症、也包括判断绝经后妇女是否存在患有原发性骨质疏松症的风险，还包括预测绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的预后，还包括判断患有原发性骨质疏松症的绝经后妇女在经过治疗后是否已经复发。

附图说明

图1显示利用qpcr检测dhrs12基因在绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中的表达差异；

图2显示利用测序检测dhrs12基因在绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中差异表达的基因

1、研究对象：

选择绝经后妇女原发性骨质疏松症患者3例，年龄分别为81岁、68岁、79岁；正常绝经女性2例，年龄分别为67岁、68岁。

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的纳入标准：绝经超过12个月的汉族绝经后妇女，患者均知情同意；

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的排除标准包括①既往接受过抗骨吸收药物(包括降钙素、双磷酸盐、雌激素等)或促骨形成药物(如甲状旁腺素等)治疗者(单纯使用钙剂和/或维生素d者除外)；②长期服用糖皮质激素者；③合并有恶性肿瘤、骨转移肿瘤和其他内分泌、骨代谢病史(如类风湿性关节炎、甲亢、肾上腺疾病等)者；④脊柱或髋部等部位新鲜骨折或髋关节手术置换者；⑤严重肝肾疾病、长期卧床≧3个月者；⑥精神障碍、认知障碍。

2、血液总rna提取

使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。

基本步骤：

(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；

(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；

(3)异丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、rna样品的质量分析

利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。

5、片段化rna

illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。

6、反转合成cdna

在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。

7、连接adaptor

双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。

8、ung酶消化cdna二链

在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。

9、illuminax-ten上机测序

illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。

10、生物信息学分析

测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：

(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；

(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；

(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；

(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。

11、结果

rna-seq结果显示(如图2所示)，与正常绝经女性相比，绝经后妇女原发性骨质疏松症患者血液中dhrs12基因的mrna水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例2qpcr实验验证绝经后妇女原发性骨质疏松症患者和正常绝经女性中差异表达的基因

1、研究对象：

选择绝经后妇女原发性骨质疏松症患者30例，正常绝经女性30例，年龄在65-82岁之间。

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的纳入标准：绝经超过12个月的汉族绝经后妇女，患者均知情同意；

绝经后妇女原发性骨质疏松症患者的排除标准包括①既往接受过抗骨吸收药物(包括降钙素、双磷酸盐、雌激素等)或促骨形成药物(如甲状旁腺素等)治疗者(单纯使用钙剂和/或维生素d者除外)；②长期服用糖皮质激素者；③合并有恶性肿瘤、骨转移肿瘤和其他内分泌、骨代谢病史(如类风湿性关节炎、甲亢、肾上腺疾病等)者；④脊柱或髋部等部位新鲜骨折或髋关节手术置换者；⑤严重肝肾疾病、长期卧床≧3个月者；⑥精神障碍、认知障碍。

2、血液总rna提取

使用博凌科为tripurelsreagent血液(血液样本)rna抽提试剂进行血液总rna的提取。

基本步骤：

(1)按照3:1的体积比例加入tripurelsreagent和血液振荡混匀；

(2)加入氯仿帮助有机相和水相分层；

(3)异丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、qpcr

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。

引物序列如下：

扩增dhrs12基因的正向引物序列为5’-cagtccgaaagaacaccat-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-ctccgtcagaaccacttg-3’(seqidno.4)；

扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.5)，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.6)。

扩增程序：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以sybr

green作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

5、结果

结果如图1所示，与正常绝经女性相比，绝经后妇女原发性骨质疏松症患者血液中dhrs12基因的mrna水平显著下降，差异具有统计学意义(p<0.05)，结果同rna-seq实验。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>首都医科大学附属北京友谊医院

<120>绝经后妇女原发性骨质疏松症的诊断工具

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