一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法与流程

本发明涉及病原菌的快速检测方法技术领域，尤其是涉及一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法。

背景技术：

副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis,hps)是一种重要的猪呼吸道病原菌，目前已至少鉴定出15个血清型，不同血清型菌株之间存在高毒力、中等毒力和无毒力等显著差异，鉴定hps血清型对该病的诊断和防治具有重要意义。hps血清4型是高毒力菌株，又是我国目前流行最多、分布范围最广的血清型之一。目前该菌常规血清型鉴定方法为细菌分离培养和鉴定的基础上，通过琼脂扩散试验与hps所有血清型的阳性血清进行反应来判定血清型，通常需要3-5天的时间，费时费力，而且约有30％的hps分离菌株不能被准确鉴定出血清型，严重影响副猪嗜血杆菌病的快速诊断和检测。

环介导等温扩增技术(lamp，国际专利公开号wo00/28082)是2000年notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(如需要还可以添加环引物对)，利用一种链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可通过凝胶电泳进行检测。用于lamp技术扩增的2对引物是针对靶基因序列的6个区段，因而具有比pcr更高的特异性，同时也具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。

副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究主要利用血清学分型方法开展，即在hps分离培养和鉴定的基础上，通过琼脂扩散试验与hps所有血清型的阳性血清进行反应来判定血清型，通常需要3-5天的时间，费时费力，而且约有30％的hps分离菌株不能被准确鉴定出血清型，严重影响副猪嗜血杆菌病的快速诊断和检测。

技术实现要素：

本发明的技术目的是建立一种简便、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度的hps血清4型lamp检测方法。

为快速准确地鉴定hps血清4型，本发明参考genbank发表的副猪嗜血杆菌sw124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharidebiosynthesisprotein，wcip4)基因序列(登录号kc795356.1)，运用引物设计软件primerexplorer4.0，在线进行lamp引物设计。按照引物设计原则，针对其6个特定区域设计4条引物：两条外引物分别为上游外引物(f3)和下游外引物(b3)；两条内引物分别为上游内引物(fip)和下游内引物(bip)，fip由f1的互补序列和正向序列f2构成，bip由b1的互补序列和正向序列b2构成，靶基因片段即为上游外引物f3与下游外引物b3之间的基因序列。依据primerexplorer4.0设计的引物，可获得多个靶基因片段，然后运用blast进行序列比对，筛选出wcip4基因特异性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。创新性发现，此wcip4基因特异性片段经lamp方法扩增，仅在恒温条件下(62℃)反应60分钟，即可将目的dna从几个拷贝扩增到10⁹个拷贝，通过电泳检测扩增产物来判定结果。故而可作为一种运用lamp技术快速检测hps血清4型方法的分子标记使用。

在此基础上，本发明进一步提供一组环介导等温扩增引物，其可特异性环介导等温扩增所述的分子标记。根据一种优选的实施方式，所述引物组包括上游外引物f3和下游外引物b3，其核苷酸序列如seqidno.1-2所示；以及上游内引物fip和下游内引物bip，其核苷酸序列如seqidno.3-4所示。

更进一步，本发明提供一种快速检测hps血清4型的方法，以待测样品细胞基因组dna为模板，利用上述的特异性引物组进行环介导等温扩增反应。所述待测样品细胞基因组dna可以将待测样品经常规细菌培养后提取细菌基因组dna。

所述的方法，还包括步骤：设置阴性对照模板和阳性对照模板，阴性对照模板为超纯水，阳性对照模板为hps血清4型参考菌株hs79基因组dna；利用凝胶电泳对环介导等温扩增产物进行检测，电泳结果出现特征性梯度状电泳条带判定为阳性，若无任何扩增产物则为阴性。

所述环介导等温扩增反应的反应体系包括：10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；用灭菌超纯水补足体系至25μl；

其中10×lampbufffer组成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。

所述环介导等温扩增反应的反应条件如下：95℃变性5min，取出样品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反应60min，最后80℃反应10min终止反应。

所述方法中使用的试剂优选制作为快速检测hps血清4型的试剂盒，包括所述特异性引物组。

优选的包括：

10×lampbufffer：2.5μl；10mmol/l的dntps：3.0μl；0.25mol/l的mgso4：0.2μl；5mol/l的betaine：0.5μl；10μmol/l的fip引物：2.0μl；10μmol/l的bip引物：2.0μl；10μmol/l的f3引物：0.5μl；10μmol/l的b3引物：0.5μl；8u/μl的bstdna聚合酶：0.7μl；模板dna：1.0μl；使用时用灭菌超纯水补足体系至25μl；

其中10×lampbufffer组成：200mmol/ltris-hcl，100mmol/lkcl，20mmol/lmgso4，100mmol/l(nh4)2so4，1.0％tritonx-100。

本发明通过提供一种hps血清4型的特异性基因片段及具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测样品中是否存在hps血清4型特异性基因片段进而确定样品是否为hps血清4型。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高(对hps血清4型基因组dna的检测敏感度为1.0pg，对副猪嗜血杆菌血清4型菌液的检测敏感度为1.6×10²cfu/ml)、特异性强(仅检测hps血清4型参考菌株和分离菌株为阳性，而对hps其它血清型参考和分离菌株、以及其它种属的细菌检测均为阴性)、方便快捷(整个检测在3小时内完成，与现有的琼脂扩散试验检测血清型相比省时2-3天)、不需要特殊仪器(在恒温水浴锅中就可反应)、适用范围广(适用于兽医科研检测实验室、检验检疫部门、养殖企业等)等优点，可解决hps血清4型的现场快速检测和基层普及应用的难题。

附图说明

图1：lamp检测hps不同血清型菌株的特异性结果，其中m：dl2000dnamarker；1-17孔所用模板对应的菌株与表3中的菌株序号一致，其中第5孔出现阳性条带，为hps血清4型参考菌株hs79。

图2：lamp检测其它种属细菌菌株的特异性结果，其中m：dl2000dnamarker；1-20孔所用模板对应的菌株与表4中的菌株序号一致，第20孔为hps血清4型参考菌株hs79作为阳性对照。

图3：lamp检测hps血清4型基因组dna的敏感性结果，其中m：dl2000dnamarker；模板dna的量分别标注于泳道上面，检测结果显示本发明的检测限为1.0pg。

图4：lamp检测hps血清4型菌液的敏感性结果，其中m：dl2000dnamarker；泳道上面的标注为菌液的稀释度，检测结果显示本发明的检测限为4个菌，敏感性为0.16cfu/μl(1.6×10²cfu/ml)。

图5：lamp检测临床分离hps菌株结果，其中m：dl2000；1-21孔所用模板对应的菌株与表5中的菌株序号一致，结果显示只有孔道1-14这14株hps血清4型菌株出现典型的梯状条带，其它血清型菌株均为阴性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1lamp引物的设计和合成

参考genbank发表的副猪嗜血杆菌sw124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharidebiosynthesisprotein，wcip4)基因序列(登录号kc795356.1)，运用引物设计软件primerexplorer4.0，在线进行lamp引物设计。按照引物设计原则，针对其6个特定区域设计4条引物：两条外引物分别为上游外引物(f3)和下游外引物(b3)；两条内引物分别为上游内引物(fip)和下游内引物(bip)，fip由f1的互补序列和正向序列f2构成，bip由b1的互补序列和正向序列b2构成，靶基因片段即为上游外引物f3与下游外引物b3之间的基因序列。依据primerexplorer4.0设计的引物，可获得多个靶基因片段，然后运用blast进行序列比对，筛选出wcip4基因特异性高且高度保守的靶基因片段(如seqidno.5所示)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名称和序列见表1。

表1lamp所用引物名称及序列

实施例2用作模板的hps细菌基因组dna提取

取分离培养的hps菌株，划线培养于添加终浓度100μg/mlnad的胰酶大豆琼脂(tsa)平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5ml添加终浓度100μg/mlnad的胰酶大豆肉汤(tsb)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。取过夜培养的菌液1ml，离心后弃上清液，菌沉淀重悬于50μl超纯水中，煮沸5min裂解细菌后，离心取上清液1.0μl用于lamp反应模板。

实施例3lamp反应体系的建立

lamp反应体系总量为25μl，反应组分见表2。

表2lamp反应体系的组分及添加量

lamp反应在pcr仪中进行，首先95℃变性5min，取出样品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反应60min，最后80℃反应10min终止反应。利用琼脂糖凝胶电泳对lamp扩增产物进行检测，电泳结果出现特征性梯度状电泳条带判定为阳性，若无任何扩增产物则为阴性。

实施例4具体检测方法的建立

(1)细菌培养。取拟鉴定血清型的hps分离菌株，接种于5ml添加终浓度100μg/ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的胰酶大豆肉汤(tsb)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。

(2)细菌基因组dna的提取。取过夜培养的菌液1ml，离心后弃上清液，菌沉淀重悬于50μl超纯水中，煮沸5min裂解细菌后，离心取上清液1.0μl作为lamp反应模板。

(3)hps菌株的lamp检测。按照表2中的lamp反应体系将除bstdna聚合酶外的其它组分加入0.2ml反应管中，放入pcr仪中，95℃变性5min，取出样品冰浴，加入bstdna聚合酶，然后62℃反应60min，最后80℃反应10min终止反应。同时设置阴性对照和阳性对照。

(4)lamp扩增产物的电泳检测。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测：取9μllamp扩增产物加1μl10×上样缓冲液混匀，以dl2000dnamarker作为相对分子量标准，用含核酸染色剂的1.5％琼脂糖凝胶在100v电压下电泳约30min，于凝胶成像系统中拍照分析结果。电泳图片显示lamp特征性梯度状条带，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。

实施例5特异性实验

取甘油保存的hps不同血清型菌株，划线培养于添加终浓度100μg/mlnad的胰酶大豆琼脂(tsa)平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5ml添加终浓度100μg/mlnad的胰酶大豆肉汤(tsb)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。针对用于鉴定lamp菌种间特异性试验所用的其它种属细菌菌株，同样取适量甘油保存的相应菌株，划线培养于tsa平板，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5mltsb培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。利用promega公司的细菌全基因组dna提取试剂盒抽提细菌基因组dna，操作步骤简述为：取2ml培养12～16h的菌液至1.5ml离心管；13,000rpm离心2min，弃净上清，留取菌体沉淀；加入600μlnucleilysissolution，轻轻吹打至沉淀重悬；80℃培养5min，使菌体裂解，然后使其冷却至室温；加入3μlrnasesolution，颠倒2～5次，混匀；水浴37℃培养30min，并冷却至室温；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速涡旋振荡20s；将样品在冰上放置5min；13,000rpm离心10min；将含有dna的上清液转移至一个干净的的装有600μl异丙醇的1.5ml离心管；轻轻颠倒混匀直至出现线状dna；13,000rpm离心5min；轻轻倒出上清液，并用干净的吸水纸将管内残液吸干；加入600μl70％乙醇，轻轻颠倒几次；13,000rpm离心2min，小心吸出乙醇；将离心管在空气中晾10～15min，至乙醇完全蒸发；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培养1h水化dna，并定期敲打离心管，也可在4℃过夜水化dna；将提取的dna保存于-20℃。提取的模板dna通过凝胶电泳和紫外分光光度计分析其质量和浓度。核酸浓度测定：用紫外分光光度计分别测定核酸在260nm和280nm处的紫外吸收值，以260nm和280nm处的紫外吸收值的比值计算纯度，高质量dna的od260/280的值在1.8左右。细菌基因组dna完整性测定：取3μl提取的模板dna溶液电泳，选用的电泳胶为1.0％的琼脂糖凝胶，在紫外投射仪下检测dna的大小，根据其亮度和扩散管程度来判断dna的完整性。

(1)lamp检测hps不同血清型菌株的特异性

分别以表3中的17株副猪嗜血杆菌不同血清型的参考菌株基因组dna作为模板，利用lamp反应体系和程序进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定hps血清型特异性。检测结果见表3和图1，hps血清4型参考菌株hs79的孔内有明显的阶梯状条带，其它血清型孔内无条带出现，表明本发明的lamp反应体系对hps不同血清型菌株具有高特异性。

(2)lamp检测其它种属细菌菌株的特异性

分别以表4中的19株其它种属细菌菌株基因组dna作为模板，利用优化后的lamp反应体系和程序进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定lamp方法对其它种属细菌的特异性。检测结果见表4和图2，hps血清4型参考菌株hs79的孔内有明显的阶梯状条带，其它种属细菌菌株孔内无条带出现，表明本发明的lamp反应体系对其它种属细菌菌株具有高特异性。

表3lamp检测hps不同血清型菌株的特异性

注：检测结果中“-”为阴性；“+”为阳性。

表4lamp检测其它种属细菌菌株的特异性

注：检测结果中“-”为阴性；“+”为阳性。

实施例6敏感性实验

(1)lamp检测hps血清4型基因组dna的敏感性

取甘油保存的hps血清4型参考菌株hs79，划线培养于添加终浓度100μg/mlnad的胰酶大豆琼脂(tsa)平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5ml添加终浓度100μg/mlnad的胰酶大豆肉汤(tsb)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。利用promega公司的细菌全基因组dna提取试剂盒抽提细菌基因组dna，操作步骤简述为：取2ml培养12～16h的菌液至1.5ml离心管；13,000rpm离心2min，弃净上清，留取菌体沉淀；加入600μlnucleilysissolution，轻轻吹打至沉淀重悬；80℃培养5min，使菌体裂解，然后使其冷却至室温；加入3μlrnasesolution，颠倒2～5次，混匀；水浴37℃培养30min，并冷却至室温；加入200μlproteinprecipitationsolution，高速涡旋振荡20s；将样品在冰上放置5min；13,000rpm离心10min；将含有dna的上清液转移至一个干净的的装有600μl异丙醇的1.5ml离心管；轻轻颠倒混匀直至出现线状dna；13,000rpm离心5min；轻轻倒出上清液，并用干净的吸水纸将管内残液吸干；加入600μl70％乙醇，轻轻颠倒几次；13,000rpm离心2min，小心吸出乙醇；将离心管在空气中晾10～15min，至乙醇完全蒸发；加入100μldnarehydrationsolution，65℃培养1h水化dna，并定期敲打离心管，也可在4℃过夜水化dna；将提取的dna保存于-20℃。提取的模板dna通过凝胶电泳和紫外分光光度计分析其质量和浓度。核酸浓度测定：用紫外分光光度计分别测定核酸在260nm和280nm处的紫外吸收值，以260nm和280nm处的紫外吸收值的比值计算纯度，高质量dna的od260/280的值在1.8左右。细菌基因组dna完整性测定：取3μl提取的模板dna溶液电泳，选用的电泳胶为1.0％的琼脂糖凝胶，在紫外投射仪下检测dna的大小，根据其亮度和扩散管程度来判断dna的完整性。

以浓度为100ng/μl的hps血清4型参考菌株hs79基因组dna为初始模板，分别以超纯水进行系列稀释，每个梯度各取1μl加入反应管中，反应体系中细菌基因组dna的量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、5pg、2.5pg、1.0pg、0.1pg、0.05pg、0.01pg、0.001pg，以超纯水作为阴性对照，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定敏感性结果。结果如图3所示，从第7泳道至第14泳道均出现lamp反应典型的阶梯状电泳条带，而且随着模板dna浓度的增加，条带亮度逐渐增强。结果表明，本发明建立的lamp方法最低限度能检测到1.0pg的hps血清4型参考菌株hs79基因组dna，且随着模板dna浓度的增加，lamp扩增产物量也随之增多。

(2)lamp检测hps血清4型菌液的敏感性

取甘油保存的hps血清4型参考菌株hs79，划线培养于添加终浓度100μg/mlnad的tsa平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5ml添加终浓度100μg/mlnad的tsb培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。经分光光度计测得菌液浓度od600为0.6，将菌液用超纯水倍比稀释至10^-11，从10^-6、10^-7和10^-8管中各取出100μl分别涂在tsa平板上，过夜培养后计算细菌的菌落数。同时从每个稀释度管中取出1μl作为模板dna进行lamp扩增，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定敏感性结果。结果如图4所示，从第9泳道至第13泳道均有典型的梯状条带，最低限度至少能检测到10^-5。平板计数结果显示在10^-7培养基中是80cfu/ml、10^-6培养基中是400cfu/ml，倍比计算得到10^-5约4000cfu/ml，模板取量为1μl，所以该lamp反应检测的最低含菌量为4个菌，即灵敏性为0.16cfu/μl(1.6×10²cfu/ml)。

实施例7lamp检测临床分离hps菌株

取表5中的21株hps临床分离株(已利用琼脂扩散试验鉴定血清型)，分别过夜培养后取菌液1ml，离心后弃上清液，菌沉淀重悬于50μl超纯水中，煮沸5min裂解细菌后，离心取上清液1.0μl用于lamp反应用模板dna。以优化后的lamp反应体系及程序进行扩增，核酸电泳观察lamp扩增结果。lamp检测结果如图5所示，在所有hps分离菌株中，只有14株血清4型菌株出现典型的梯状条带，其它血清型菌株均为阴性反应，提示本发明建立的lamp检测方法可用于临床hps分离株血清4型的检测和鉴定。

表5lamp检测临床分离hps不同血清型菌株的结果

注：检测结果中“-”为阴性；“+”为阳性。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法

<130>p1710133

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagtttctttttcgagaa19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ataaatcttcaggatgagaa20

<210>3

<211>52

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cagctctagaaaccaaataactacacttcttaattcccctttttatggattc52

<210>4

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gtggaaagattgtatcatgtacataaaaagacctttgatactagattgaatagcaaga58

<210>5

<211>224

<212>dna

<213>wcip4基因片段

<400>5

agagtttctttttcgagaaaatataaaaattcttaattcccctttttatggattcttttt60

atatcgaacgtgtagttatttggtttctagagctgttgtggaaagattgtatcatgtaca120

taaaaagttttgttatttagcagatgattgggggaatcttgctattcaatctagtatcaa180

aggttttacatattgtaagattttttctcatcctgaagatttat224