本发明属于运动补剂技术领域，具体涉及一种两步酶解法生产磷酸肌酸的方法。
背景技术：
磷酸肌酸是在肌肉或其他兴奋性组织（如脑和神经）中的一种高能磷酸化合物磷脂，担当着补充三磷酸腺苷（atp）的能量储备的作用。
磷酸肌酸通常用磷酸烯醇丙酮酸和肌酸进行合成。具体如下图：
但该合成方法使用的原料磷酸烯醇丙酮酸为化工合成产品，而且合成时需要用到有机溶剂，大大限制了磷酸肌酸作为运动补剂的大规模生产及应用。
技术实现要素：
为克服现有技术存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种以天然磷脂为原料、两步酶解法生产磷酸肌酸的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种两步酶解法生产磷酸肌酸的方法：以天然磷脂为原料，加入水、肌酸类化合物和生物酶，在40-80℃一次酶解反应4-72h；一次酶解反应结束后，加入磷脂酶c，在40-80℃二次酶解反应4-8h，提纯，即得磷酸肌酸；其中，天然磷脂与水、肌酸类化合物、生物酶、磷脂酶c的质量比为1∶0.1-20∶0.1-4∶0.001-0.1∶0.01-0.1；所述生物酶的酶活≥1000u/g，磷脂酶c的酶活≥10000u/g。
所述天然磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油(pg)和溶血磷脂(lp)中的一种或几种的混合物。
所述天然磷脂源自下述来源(1)、(2)或(3)：
(1)、植物或其提取物，所述植物包括但不限于大豆、菜籽、葵花籽；
(2)、动物或其提取物，所述动物包括但不限于虾类、鱼类、禽类、哺乳动物；
(3)、(1)和(2)中的两种或多种的混合物。
所述肌酸类化合物包括但不限于无水肌酸、肌酸的水合物、肌酸的盐类中的一种或几种的混合物。
所述生物酶包括但不限于磷脂酶d、肌酸激酶中的一种或两种的混合物。
所述提纯的方法为离心过滤法、有机溶剂萃取法或色谱柱分离法。
本发明生产方法的路线示意图如下：
其中，天然磷脂中的r1、r2均代表h或脂肪酸链，x代表小分子化合物，如：x=h，所述天然磷脂即为磷脂酸；x=胆碱，所述天然磷脂即为磷脂酰胆碱（pc）；x=乙醇胺，所述天然磷脂即为磷脂酰乙醇胺（pe）。
有益效果：本发明制备方法不使用如正己烷、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等任何有机溶剂，使用的原料为天然产物，产品具有更高的生理活性。
附图说明
图1：本发明生产方法的工艺流程图。
具体实施方式
为使本发明更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
工艺流程图如图1所示，具体步骤为：
菜籽磷脂（粉末）和蛋黄卵磷脂（粉末）混合物（经检测，混合物中的磷脂含量为95.6wt%）中加入水、肌酸和生物酶，在45℃一次酶解反应16h；一次酶解反应结束后，加入磷脂酶c，在55℃酶反应6h，经过低温（5℃）离心分离，得到的固相经10重量倍蒸馏水清洗过滤3次，得目标产品，经高效液相色谱检测，目标产品中磷酸肌酸的含量为90.8%；
其中，菜籽磷脂和蛋黄磷脂混合物（以其中的磷脂含量计）与水、肌酸、生物酶、磷脂酶c的质量比为1∶10∶1∶0.01∶0.01；所述生物酶为磷脂酶d（酶活1000u/g）和肌酸激酶（酶活1000u/g）以质量比1∶1的混合物；所述磷脂酶c的酶活为10000u/g。
实施例2
工艺流程图如图1所示，具体步骤为：
大豆浓缩磷脂（大豆油中提取，经检测，其中的磷脂含量为60wt%）中加入水、肌酸和生物酶，在55℃一次酶解反应72h；一次酶解反应结束后，加入磷脂酶c，在60℃酶反应4h，经过低温（5℃）离心分离，得到的固相经10重量倍蒸馏水清洗过滤3次，得目标产品，经高效液相色谱检测，目标产品中磷酸肌酸的含量为91.2%；
其中，大豆浓缩磷脂（以其中的磷脂含量计）与水、肌酸、生物酶、磷脂酶c的质量比为1∶0.1∶0.1∶0.01∶0.01；所述生物酶为磷脂酶d（酶活1000u/g）；所述磷脂酶c的酶活为10000u/g。
实施例3
工艺流程图如图1所示，具体步骤为：
牛脑提取物（经检测，其中的磷脂含量为15.6wt%）中加入水、肌酸和生物酶，在40℃一次酶解反应72h；一次酶解反应结束后，加入磷脂酶c，在55℃酶反应4h，经过低温（5℃）离心分离，得到的固相经10重量倍蒸馏水清洗过滤3次，得目标产品，经高效液相色谱检测，目标产品中磷酸肌酸的含量为90.2%；
其中，牛脑提取物（以其中的磷脂含量计）与水、肌酸、生物酶、磷脂酶c的质量比为1∶18∶2∶0.01∶0.01；所述生物酶为磷脂酶d（酶活1000u/g）；所述磷脂酶c的酶活为10000u/g。