本发明涉及一种培养液的制备方法，特别是一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法。属于医学领域。
背景技术：
卵母细胞的体外成熟(invitromaturation,ivm)是指将gv期或mi期的卵母细胞在体外培养发育到第二次减数分裂中期(mii期)的过程。ivm可以作为一项技术,结合体外受精(ivf)技术可以有效地应用在生殖医学领域,治疗不孕不育症。
卵母细胞体外成熟技术作为辅助生殖技术重要组成部分，不但能提高卵母细胞利用效率，减少卵巢过度刺激综合征的发生，也为赠卵及女性生育力保存提供了更多选择。近年来，随着生殖医学的快速发展，卵母细胞体外成熟技术研究和临床应用得到了快速发展，但仍面临成熟率低、受精率低、优质胚胎率低及妊娠率低等问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，本发明改善了ivm后卵母细胞发育潜力较差，孤雌激活后胚胎发育能力也相对较低的问题。
实现上述目的的技术方案是：一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征是：该制备方法步骤如下：
步骤1)制备基础ivm培养基；
步骤2)在基础ivm培养基中添加脂蛋白，即得：卵母细胞体外成熟培养液。
所述步骤1)制备基础ivm培养基：
步骤a)采用商品化的组织培养液tcm199为基础细胞培养液；
步骤b)将已经商品化的0.075-0.10iu/mlfsh和0.5-0.8iu/mlhcg，0.1-0.2μg/ml的17β-雌二醇，和10％-20％体积百分比的人商品化替代血清添加到商品化的组织培养液tcm199中；
步骤c)对步骤b)的添加后的商品化的组织培养液tcm199进行过滤；
步骤d)过滤后保存，即得基础ivm培养基。
所述步骤c)中的过滤，通过过滤器进行过滤，所述过滤器为0.22μm的过滤器。
所述步骤d)中的保存是在温度为4℃环境中保存。
所述步骤d)基础ivm培养基2周内使用。
所述步骤2)在基础ivm培养基中添加20ug/m脂蛋白。
所述步骤2)卵母细胞体外成熟培养液在培养卵母细胞前，卵母细胞体外成熟培养液放置于37℃培养箱内，5％二氧化碳浓度条件下平衡12小时以上。
本发明的优点是：本发明改善了ivm后卵母细胞发育潜力较差，孤雌激活后胚胎发育能力也相对较低的问题，添加脂蛋白后可以使胚胎继续发育到囊胚，添加脂蛋白的ivm培养液提高了胚胎发育潜能，有效的改善了胚胎停育问题。该方法可以使得卵母细胞体外成熟率达到了68.78％，囊胚形成率达到了16.33％。
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
具体实施方式
实施例1
一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)制备基础ivm培养基；
步骤2)在基础ivm培养基中添加脂蛋白，即得：卵母细胞体外成熟培养液。
实施例2
一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)制备基础ivm培养基；
步骤a)采用商品化的组织培养液tcm199为基础细胞培养液；
步骤b)将已经商品化的0.075-0.10iu/mlfsh和0.5-0.8iu/mlhcg，0.1-0.2μg/ml的17β-雌二醇，和10％-20％体积百分比的人商品化替代血清添加到商品化的组织培养液tcm199中；
步骤c)对步骤b)的添加后的商品化的组织培养液tcm199用0.22μm的过滤器进行过滤；
步骤d)过滤后，在温度为4℃环境中进行低温保存，即得基础ivm培养基。所述的基础ivm培养基2周内使用。
步骤2)在基础ivm培养基中添加20ug/ml脂蛋白，即得：卵母细胞体外成熟培养液。
所述的卵母细胞体外成熟培养液在培养卵母细胞前，卵母细胞体外成熟培养液放置于37℃培养箱内，5％二氧化碳浓度条件下平衡12小时以上。
其中fsh为卵泡刺激素，是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，成分为糖蛋白；hcg是指人绒毛膜促性腺激素，由α和β二聚体的糖蛋白组成。
实施例3
该实施例是针对实施例2做的实验例，实验过程如下：
选取6周龄～8周龄的雌鼠，经腹腔注射10iu的pmsg进行超数排卵处理，46-48h后断颈处死小鼠，取出卵巢放入m2培养液中，在体视显微镜下用针压破卵泡，挑选gv期卵母细胞，按以下分组进行培养，对照组：基础ivm培养基；实验组：基础ivm培养基中添加20ug/ml脂蛋白，每个培养滴中加10-15个卵母细胞，于上述条件中培养，培养24h后统计mⅱ发生率,挑选mⅱ卵放入提前平衡好的含20mmsrcl2的ksom中1h进行孤雌激活，以37℃、5％co2条件下预平衡4h以上的ksom培养液洗5遍，再将卵子移入含5μg/mlcytochalasinb的预平衡的ksom培养液，37℃、5％co2条件下培养4h，以37℃、5％co2条件下预平衡4h以上的ksom培养液洗5遍，之后放入预平衡4h以上的ksom培养，18h后观察卵裂率，激活当天记d0天，d5当天观察囊胚形成率。见表1：表1
如表1所示，本发明改善了ivm后卵母细胞发育潜力较差，孤雌激活后胚胎发育能力也相对较低的问题，添加脂蛋白后可以使胚胎继续发育到囊胚，而没有添加脂蛋白的基础培养基不能让胚胎继续发育，表明添加脂蛋白的ivm培养液提高了胚胎发育潜能，有效的改善了胚胎停育问题。
本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，这里不一一叙述。