一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体的制作方法

本发明涉及一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，属于酶工程
技术领域：
。
背景技术：
：苯丙氨酸氨基变位酶(pam)可用于催化苯丙氨酸发生异构化，催化α-苯丙氨酸转氨基变为药用价值更高的β-苯丙氨酸，β-苯丙氨酸是合成抗癌药物紫杉醇的重要前体，具有广阔的市场前景。但是，该反应是一个放热反应，生产过程中高温会影响酶的结构，导致酶活下降，进而产生了大量的能耗，提高了生产成本。此外，该酶在催化过程中酶活相对较低，不利于β苯丙氨酸的生成。在生产催化过程中，提高该的热稳定性以及酶活尤为重要。目前，苯丙氨酸氨基变位酶主要来源于成团泛菌(pantoeaagglomerans)、海洋链霉菌(streptomycesmaritimus)和中华红豆杉(taxuschinensis)。中华红豆杉来源的目的基因在原核生物中表达不够理想，海洋链霉菌来源的基因在温度较高时表现出苯丙氨酸裂解酶活性，而野生型成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶活力和热稳定性也有限。因此，获得一种酶活提高、稳定性增强的苯丙氨酸氨基变位酶对于β-苯丙氨酸的工业化生产具有重要的应用价值。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，含有seqidno.2所示的氨基酸序列。本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。在本发明的一种实施方式中，所述基因含有seqidno.1所示的核苷酸序列。本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。本发明的第四个目的是提供表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的细胞。本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达seqidno,2所示的苯丙氨酸氨基变位酶突变体i91m。在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌bl21为宿主。在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pet系列质粒为载体。在本发明的一种实施方式中，所述载体为pet28a。本发明的第六个目的是提供一种提高苯丙氨酸氨基变位酶稳定性的方法，所述方法是将seqidno.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶第91位异亮氨酸突变为甲硫氨酸。本发明的第七个目的是提供一种生产所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的方法，将表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的基因工程菌接种于lb培养基中，35-37℃培养至od600为0.6-0.8时，加入诱导剂iptg于20-22℃诱导16-18h。在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的lb表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至0.1mm，20℃诱导16-18h，表达苯丙氨酸氨基变位酶突变体酶。在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用histraphp柱分离得到苯丙氨酸氨基变位酶突变体。本发明还提供所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体及所述基因工程菌在制备含有β-苯丙氨酸的产品中的应用。有益效果：本发明提供的苯丙氨酸氨基变位酶突变体i91m的最适ph为8.5，最适温度为55℃，50℃处理1h仍有83％残留酶活性，相比野生酶50℃处理1h剩余25％酶活，提高了约2.3倍；突变体热稳定性有明显提高。同时该突变体也具备了更好的催化活性，比酶活相较于野生酶略有提高；因此，本发明提供的苯丙氨酸氨基变位酶突变体i91m，具有很好的酶学性质，有利于以后的工业生产。附图说明图1：野生酶和突变酶i91m在不同温度下的酶活曲线，pa(wt)为野生酶。图2：野生酶和突变酶i91m在50℃下不同ph下的酶活曲线，pa(wt)为野生酶。图3：野生酶和突变酶i91m在50℃下保存后的热稳定性曲线，pa(wt)为野生酶。图4：野生酶和突变酶i91m在50℃下的酶活柱状图，pa(wt)为野生酶。图5：野生酶和突变酶a95g、a95r、i91h、i91m在50℃下处理1h的剩余酶活，pa为野生酶。图6：野生酶和突变酶i91h、i91v、i91m在50℃下的相对酶活柱状图，pa(wt)为野生酶。具体实施方式酶活的定义(u)：每分钟转化l-α-苯丙氨酸生成1μmol/lβ-苯丙氨酸所需的酶量定义为1u。比酶活(u/mg)：每毫克pam的酶活。相对(剩余)酶活的定义：将野生酶和突变酶在ph＝8.5的pbs缓冲液中，温度为50℃反应30min，测定产物生成量，以野生酶催化的产量为标准定义为100％。lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母浸膏5g/l，nacl10g/l。苯丙氨酸氨基变位酶反应体系：底物为200μl20mm的l-α-苯丙氨酸，加入100μg纯酶，加入磷酸盐缓冲液200μl在一定温度下反应30min后用100℃高温终止反应，并离心去除沉淀，取上清过0.22μm的膜后作为液相测定的样品。苯丙氨酸氨基变位酶检测：采用安捷伦1260进行hplc检测，流动相为水乙腈缓冲液；检测波长254nm，流速为0.5ml/min；色谱柱为c18柱。最适反应ph的确定：分别在不同ph缓冲液中测定野生酶和突变体的酶活，计算相对酶活，确定最适反应ph。最适反应温度的确定：分别在不同温度条件下测定野生酶和突变体酶活，确定相对酶活，确定最适反应温度。温度稳定性的确定：将野生酶和突变体在ph＝8.5的pbs缓冲液中，50℃分别保温30min、1h、2h后测定残留酶活，得到温度稳定性结果。实施例1(1)突变体i91m的构建：化学合成法合成pa-pam基因(如seqidno.1所示)，并将该基因克隆于pet28a质粒的ndei和hindiii酶切位点处，由天霖生物技术公司完成，获得pet28a-pam重组质粒。以pet28a-pam为模版，用表1所示引物在表2所示条件下pcr，pcr产物转化e.colijm109后获得携带编码突变体基因的重组质粒pet28a-pam-i91m。将重组质粒pet28a-pam-i91m转化e.colibl21菌株，获得重组菌株bl21/pet28a-pam-i91m。表1引物p1atgggtggtttcgttaactattgggttccgattgcap2gcttgcttttgcaatcggaacccaatagttaacgaa表2全质粒pcr扩增反应体系试剂用量ddh2o32μl5×psbuffer(mg2+plus)10μldntpmixture(2mmol/l)4μlp1(10mmol/l)、p2(10mmol/l)各1μlpet28a-pam1μlprimerstarhsdna聚合酶1μl共计50μlpcr扩增反应条件为：pcr产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将pcr产物纯化、消化后转入大肠杆菌bl21感受态细胞。(2)将重组大肠杆菌bl21/pet28a-pam-i91m接种于4ml卡那霉素浓度为100μg/ml的lb培养基(蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l)，37℃、200r/min振荡过夜培养。将上述过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于含卡那霉素浓度为100μg/ml的100mllb表达培养基(蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l)中，37℃、200r/min振荡培养至od600至0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至0.1mm，20℃诱导16-18h得到菌体，5000g的转速离心收菌。(3)将重组菌体溶于20ml结合缓冲溶液(50mmol/lna2hpo4、50mmol/lnah2po4、500mmol/lnacl、20mmol/limidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1ml的histraphp柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/l咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品并用sds-page分析鉴定。实施例2在200μl缓冲反应体系中加入100μg实施例1纯化后的突变酶，加底物l-α-苯丙氨酸200μl，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反应30min，确定相应酶活。以未突变的野生酶作为对照，其他条件与酶突变体相同。如图1所示，野生酶的最适温度为50℃。酶突变体i91m在50℃下的酶活为92％，55℃的酶活最高，其最适反应温度比野生酶提高了5℃。实施例3配制不同ph的pbs缓冲溶液：将ph设置为8.0、8.5、9.0、9.5。将野生酶和酶突变体i91m分别在不同ph缓冲溶液中50℃下放置30min后，测定酶活。如图2所示，在ph＝8.5时，酶活最高，定义为100％，在ph为9、9.5时，突变酶酶活都保持在80％以下。说明突变体在碱性条件下易失活。实施例4将野生酶和酶突变体i91m分别取100μg于200μl缓冲液中，保存于50℃金属浴中30min-2h，取样，测定残留酶活。如图3所示，发现突变酶在50℃下处理60min后，突变酶的剩余酶活由野生酶的25％提高到83％，相比于酶突变体i91m在50℃下的初始酶活仅仅下降了9％；在50℃处理30min和120min后，突变酶的相对酶活由野生酶的49％和17％提高到90％和22％。突变体热稳定性有显著提高。实施例5将野生酶和酶突变体i91m分别取100μg于200μl缓冲液中，以α苯丙氨酸为底物在50℃金属浴中反应30min，取样100℃灭活，测定野生酶和突变体酶活。以原酶催化的产物产量为标准，定义为100％。如图4所示，发现突变体在50℃下反应30min后比酶活从410u/mg提升到440u/mg，催化效率提升。实施例6配置底物浓度为1mm、3mm、5mm、7mm、10mm、12mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm的α-苯丙氨酸，进行催化反应，检测产物生成速率，利用origin软件进行数据拟合，测出km值和kcat值，并计算比酶活。对野生酶和酶突变体i91m的动力学参数进行分析，结果如表3所示，发现km和kcat值均有变大的趋势，比酶活略有提高。表3野生酶pa(wt)和突变体动力学参数。对比例1以seqidno.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶为亲本酶，分别将第95位的丙氨酸突变为甘氨酸和精氨酸，获得酶突变体a95g和a95r，将第91位的异亮氨酸突变为组氨酸和甲硫氨酸，获得酶突变体i91h和i91m。将野生酶和突变酶分别取100μg于200μlph＝8.5的pbs缓冲液中，保存于50℃金属浴中1h，取样，测定剩余酶活。如图5所示，野生酶、a95g、a95r、i91h、i91m的剩余酶活分别为25％、45％、43％、68％、83％。对比例2以seqidno.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶为亲本酶，分别将91位的异亮氨酸突变为组氨酸和缬氨酸和甲硫氨酸，获得酶突变体i91h、i91v、i91m。在ph＝8.5的pbs缓冲液中，温度为50℃反应30min，测定产物生成量，以野生酶催化的产量为标准定义为100％。i91h、i91v、i91m的相对酶活分别为50％、78％和107％，如图6所示。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种热稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>1626<212>dna<213>人工合成<400>1atgagcattgtgaatgaaagcggtagccagccggttgttagccgtgatgaaaccctgagc60cagattgaacgtaccagctttcatattagcagcggcaaagatattagcctggaagaaatt120gcacgcgcagcacgtgatcatcagccggttacactgcatgatgaagttgttaatcgtgtt180acccgtagccgtagcattctggaaagcatggttagtgatgaacgtgtgatttatggtgtg240aataccagcatggg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