一种马卡列丙粗多糖的提取方法及其用途与流程

技术领域：

本发明涉及一种药物提取方法和用途，具体涉及一种种马卡列丙粗多糖的提取方法及其用途。

背景技术：

马卡列丙是侗药中从古到今常用不衰的跌打损伤特效良药,汉语俗称毛秀才,是菊科旋覆花属植物显脉旋覆花duhaldeanervosa,又名黑根、草威灵,产于四川西部、云南北部至南部,贵州西部、广西西部，多生在海拔1200-2100处的低山地区杂木林下、草坡和湿油草地。越南、缅甸、泰国、印度、不丹、锡金和尼泊尔也有分布，能袪风寒,通经络.消积止痛。其性平，昧激苦辛。目前对于马卡列丙中的有效物质研究较少，对提取物的具体功能也不清楚，尤其是对于粗多糖的功效不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种马卡列丙粗多糖的提取方法及其用途，本发明提供了一种马卡列丙粗多糖的提取方法，并对粗多糖对于骨细胞的用途进行了试验，明确了马卡列丙不同提取物粗多糖的用途，为进行骨细胞分化以及制作治疗骨科疾病的药品提供了依据。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：.

一种马卡列丙粗多糖的提取方法，包括如下步骤：

取马卡列丙药材，粉碎，使用水加热回流提取，过滤得到滤液，滤液减压回收即得水提液浓溶液，以1ml/min的速度，加入无水乙醇，边加边搅拌，使其最终醇浓度为80％，静置，过滤，取沉淀，干燥即得粗多糖(vii)。

进一步的改进，所述马卡列丙药材粉碎后过过3号筛再加入的纯化水进行水加热回流提取，粉碎且过3号筛的纯化水与马卡列丙药材的体积质量比为10:1ml/g；水加热回流提取进行三次。

进一步的改进，所述滤液减压回收至50ml。

进一步的改进，所述粗多糖(vii)用于促进骨细胞分化。

进一步的改进，所述粗多糖(vii)的浓度≥50ug/ml。

进一步的改进，所述粗多糖(vii)用于促进骨细胞矿化钙盐沉积。

进一步的改进，所述粗多糖(vii)的浓度为25ug/ml。

附图说明：

图1为马卡列丙提取物诱导mc3t3-e1细胞分化6天的碱性磷酸酶活性图；其中a.25ug/ml碱性磷酸酶活性b.50ug/ml碱性磷酸酶活性,*表示p<0.05，***p<0.001。

图2马卡列丙提取物低浓度诱导mc3t3-e1细胞矿化效果，a.矿化的形态图b.矿化的量化图,*表示p<0.05。

图3马卡列丙提取物高浓度诱导mc3t3-e1细胞矿化效果；

a.矿化的形态图b.矿化的量化图,*表示p<0.05，**表示p<0.01。

图中ⅰ为马卡列丙的挥发油，ⅱ提取挥发油后的剩余水提物；ⅲ为马卡列丙的石油醚提取物即石油醚部位，ⅳ为马卡列丙的乙腈提取物；v为马卡列丙的的正丁醇提取物，即正丁醇部位；vi为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取后的剩余水溶物质即水部位；vii为马卡列丙的粗多糖；ix为马卡列丙的的乙腈提取物；x为马卡列丙的醇提物。

具体实施方式：

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。下面详细描述本技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。

实施例1

马卡列丙药材，粉碎，过3号筛，称取50g，加热(沸水浴)回流提取3次，每次均加入10倍量的纯化水，回流提取1小时，合并续滤液，减压回收至50ml，即得水提液浓溶液。以1_ml/min的速度，加入无水乙醇，边加边搅拌，使其最终醇浓度为80％，静置，过滤，取沉淀，干燥即得粗多糖(vii)。

实施例2

对实施例1中的提取物进行功能检测，具体方法如下：

1.1碱性磷酸酶(alp)活性测定

取对数期的mc3t3-e1细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后按1×105个细胞每孔接种于12孔板，第二天用诱导分化培养液进行药物处理，药物处理每三天更换一次，第六天进行碱性磷酸酶活性测定。药物处理完后，将培养板放在冰上，用pbs洗2次，再每孔加80ul的ripa裂解液在冰上裂解30min。用移液枪将裂解液转移到1.5ml离心管，12000rpm4℃离心10min，取上清液按操作说明进行碱性磷酸酶活性测定，用酶标仪检测405nm的吸光值，根据标准曲线和测定值计算出样品中的碱性磷酸酶的单位酶活。

1.2马卡列丙提取物促进成骨细胞矿化程度评估

细胞悬液计数后，按5×104/孔接种于24孔板，第二天用诱导分化培养液进行药物处理，每三天更换新的药物处理一次，培养十四天后进行茜素红染色。去掉培养液后用pbs洗2次，用95％乙醇固定15min，pbs洗2次，0.1％茜素红37℃恒温染色30min，pbs洗1次，吹干，相差显微镜进行拍照。采用10％的氯化十六烷吡啶对矿化结节进行溶解，用酶标仪测540nm吸光值来评估细胞的矿化水平，进行量化。

2实验结果

2.1马卡列丙提取物对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

用分化培养液对成骨细胞mc3t3-e1进行药物处理，分化过程中细胞的形态会发生变化，细胞由扁平变成梭形。碱性磷酸酶是成骨细胞进行分化程度的指标，在早期骨形成中有重要作用。经过前期预实验发现分化6天的碱性磷酸酶水平比较高，故分别用不同的提取物进行诱导分化筛选碱性磷酸酶活性比较高的提取物成分，主要筛选25ug/ml和50ug/ml两个药物浓度。与溶剂对照组dmso相比25ug/ml时大部分提取物没有诱导碱性磷酸酶的上升。在50ug/ml药物诱导时，粗多糖(vii)具有较好的碱性磷酸酶活性。

2.3马卡列丙提取物对成骨细胞矿化钙盐沉积的影响

用分化培养液加不同的提取物进行诱导，每三天重新更换药物进行处理，诱导分化10天左右开始形成矿化结节，细胞成铺路石样的形态，并且有黑色的颗粒物在细胞表面形成。诱导至第14天，矿化结节比较明显，进行茜素红染色，茜素红染色呈橘红色颗粒，橘红色的颗粒物的多少体现矿化的程度。在低浓度25ug/ml进行诱导矿化的时候，矿化效果比较好，粗多糖(vii)的钙盐沉积有增多的趋势。

在高浓度50ug/ml进行诱导矿化的时候，粗多糖(vii)表现出较强的矿化效果，有明显的矿化结节，在量化评价的时候有显著性差异。

上述实施例仅仅是本发明的一个具体实施方式，并不作为本发明的限定，任何对其进行的简单改进和替换均在本发明的保护范围内。

技术特征：

1.一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

取马卡列丙药材，粉碎，使用水加热回流提取，过滤得到滤液，滤液减压回收即得水提液浓溶液，以1ml/min的速度，加入无水乙醇，边加边搅拌，使其最终醇浓度为80％，静置，过滤，取沉淀，干燥即得粗多糖(vii)。

2.根据权利要求1所述的一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，所述马卡列丙药材粉碎后过过3号筛再加入的纯化水进行水加热回流提取，粉碎且过3号筛的纯化水与马卡列丙药材的体积质量比为10:1ml/g；水加热回流提取进行三次。

3.根据权利要求2所述的一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，所述滤液减压回收至50ml。

4.根据权利要求1所述的一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，所述粗多糖(vii)用于促进骨细胞分化。

5.根据权利要求4所述的一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，所述粗多糖(vii)的浓度≥50ug/ml。

6.根据权利要求1所述的一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，所述粗多糖(vii)用于促进骨细胞矿化钙盐沉积。

7.根据权利要求6所述的一种马卡列丙粗多糖的提取方法，其特征在于，所述粗多糖(vii)的浓度≥25ug/ml。

技术总结
本发明公开了一种马卡列丙粗多糖的提取方法，包括如下步骤，取马卡列丙药材，粉碎，使用水加热回流提取，过滤得到滤液，滤液减压回收即得水提液浓溶液，以1mL/min的速度，加入无水乙醇，边加边搅拌，使其最终醇浓度为80％，静置，过滤，取沉淀，干燥即得粗多糖(VII)。本发明提供了一种马卡列丙粗多糖的提取方法，并对粗多糖对于骨细胞的用途进行了试验，明确了马卡列丙粗多糖的用途，为进行骨细胞分化以及制作治疗骨科疾病的药品提供了依据。

技术研发人员：蔡伟;尚子超;刘良红;肖顺丽
受保护的技术使用者：湖南医药学院
技术研发日：2019.08.27
技术公布日：2019.12.03