本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述核酸分子参与在表达该多肽的植物中rz2抗性基因介导的针对甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)的抗性，以及涉及编码该多肽的非功能性等位基因的核酸分子，所述非功能性等位基因在表达该多肽的植物中干扰对bnyvv的所述抗性。本发明进一步涉及由根据本发明的核酸分子编码的相应的多肽。此外，本发明涉及植物、植物细胞、植物器官、植物组织、植物部分或植物的种子或后代，其包含作为内源基因或转基因的任何核酸分子或其部分。此外，本发明还涵盖在包含rz2抗性基因的甜菜物种的植物中赋予、恢复或增加对bnyvv的抗性的方法，以及用于产生或鉴定和可能选择bnyvv抗性植物的方法。本发明还涵盖用于栽培甜菜物种的植物的方法，所述植物抵抗bnyvv侵染栽培的植物，以及涉及与根据本发明的任一核酸分子特异性杂交的寡核苷酸探针和引物。
背景技术：
丛根病(rhizomania)是全世界经济上最重要的甜菜疾病，可导致50％或更多的产量损失。该疾病也称为“根疯病”，由甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)引起，并通过土传甜菜多粘菌(polymyxabetae)传播。bnyvv感染表现为细根和侧根的增殖增加，并且形成了糖含量降低的大大减少的根体。受感染的植物显示出降低的吸水率，因此对干旱胁迫更敏感。当感染蔓延至整株植物，叶脉变黄，叶片上出现坏死病斑和黄色斑点。由于与其他病毒性疾病一样无法治愈性控制该疾病，只能通过栽培抗性品种来预防损害。目前正在研究的对抗丛根病的三种主要基因是：rz1(也称为“holly”)、rz2和rz3。
在国际专利申请wo2014/202044a1中鉴定和描述的rz2抗性基因源自海甜菜(betamaritima)，登录号wb42，并且已知当在数种甜菜中表达时，与rz1相比提供了对丛根病提高的抗性。此外，已知已鉴定出来自海甜菜的rz3，登录号wb41，其很可能是与rz2相同或是非常相似的等位基因变体。
然而，在开发新的甜菜品种的过程中，已观察到尽管存在rz2或rz3的抗性等位基因，某些遗传背景导致抗性的减弱或丧失。迄今为止，对于导致所观察到的效果的分子遗传背景一无所知。然而，为使分别由rz2或rz3介导的抗性作用可用于所有遗传背景中，甜菜属的植物育种者高度需求防止所观察到的抗性的减少或丧失。
具体而言，目标是鉴定所观察到的抗性减少或丧失背后的机制，并使用它来建立分别基于rz2和rz3显示对丛根病显示稳定抗性的甜菜品系。根据本发明，该目标经由权利要求和说明书中表征的实施方案来实现。
技术实现要素：
本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述核酸分子参与植物中由rz2抗性基因介导的对甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)的抗性，本发明还涉及编码所述多肽的非功能性等位基因的核酸分子，其干扰其中表达所述多肽的针对bnyvv的所述抗性。由此在植物中产生由所述核酸分子中的任何一种编码的多肽。
此外，本发明涉及植物、植物细胞、植物器官、植物组织、植物部分或植物的种子或后代，其内源地或转基因地包含所述核酸分子或其部分的任一者。根据一个特定的任选的实施方案，已通过基本生物学过程获得的那些植物及其成分是豁免的(exempted)。
此外，本发明同样包括在包含rz2抗性基因的甜菜物种的植物中赋予、恢复或增加对bnyvv的抗性的方法，以及产生或鉴定和可能选择bnyvv抗性植物的方法。本发明还包括用于栽培能抵抗携带bnyvv的栽培植物侵染的甜菜物种的植物的方法，以及与根据本发明的核酸分子中的任何一种特异性杂交的寡核苷酸探针和引物。
因此，本发明涉及在以下第[1]至[29]点中列出的并且在实施例和附图中阐明的实施方案。
[1]编码多肽的核酸分子，其参与在其中表达所述多肽的植物中由rz2抗性基因介导的对甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)的抗性，其中所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
(a)核苷酸序列，其编码具有根据seqidno.45的氨基酸序列的多肽；
(b)核苷酸序列，其包含根据seqidno.44的编码dna序列；
(c)核苷酸序列，其在严格条件下与根据(a)或(b)的核苷酸序列的互补序列杂交；
(d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽通过取代、缺失和/或添加氨基酸序列的一个或多个氨基酸而不同于由根据(a)或(b)的核苷酸序列编码的多肽；
(e)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与根据seqidno.45的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列；和
(f)核苷酸序列，其包含与根据seqidno.44的dna序列至少70％相同的编码dna序列，
其中，被编码的多肽的氨基酸序列参照seqidno.45在第25位具有脯氨酸(p)，参照seqidno.45在第72位具有脯氨酸(p)和/或参照seqidno.45在第186位具有缬氨酸(v)；或
其中，编码dna序列的核酸参照seqidno.44在第73位具有胞嘧啶(c)，参照seqidno.44在第214位具有胞嘧啶(c)和/或参照seqidno.44在第556位具有鸟嘌呤(g)。
[2]根据[1]的核酸分子，其中多肽具有seqidno.8、12、16或20的氨基酸序列，或编码所述多肽的核苷酸序列为seqidno.5、6、7、9、10、11、13、14、15、17、18或19，或者编码dna序列是根据seqidno.7、11、15或19的核苷酸序列。
[3]核酸分子，其与根据[1]或[2]的核酸分子特异性杂交并编码多肽的非功能性等位基因，所述非功能性等位基因干扰在其中表达所述多肽的植物中由rz2抗性基因介导的对bnyvv的抗性，其中核酸分子优选包含选自以下的核苷酸序列：
(a)核苷酸序列，其编码具有根据seqidno.4的氨基酸序列的多肽或具有与seqidno.4至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其中由于核苷酸序列中的一个或多个突变，所述多肽包含具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，优选地，其中参照seqidno.45第25位的脯氨酸(p)、seqidno.45第72位的脯氨酸(p)和/或参照seqidno.45第186位的缬氨酸(v)被另一氨基酸取代；和/或
(b)核苷酸序列，其包含根据seqidno.3的编码dna序列，包含与根据seqidno.3的dna序列至少70％相同的编码dna序列，或在严格条件下与seqidno.3的互补序列杂交，其中由于至少一个突变，所述核苷酸序列包含至少一个核酸取代，导致氨基酸取代，优选地，其中参照seqidno.44在第73-75位、参照seqidno.44在第214-216位和/或参照seqidno.44在第556-558位的一个或多个核苷酸被取代。
[4]根据[3]的核酸分子，其特征在于，所编码的多肽包含的氨基酸序列具有：
(i)丙氨酸(a)，其参照seqidno.45代替第25位的脯氨酸(p)，
(ii)苏氨酸(t)，其参照seqidno.45代替第72位的脯氨酸(p)，和/或
(iii)异亮氨酸(i)，其参照seqidno.45代替第186位的缬氨酸(v)。
[5]根据[3]或[4]的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含的dna序列具有：
(i)鸟嘌呤(g)，其参照seqidno.44代替第73位的胞嘧啶(c)，
(ii)腺嘌呤(a)，其参照seqidno.44代替第214位的胞嘧啶(c)，和/或
(iii)腺嘌呤(a)，其参照seqidno.44代替第556位的鸟嘌呤(g)。
[6]根据[3]或[5]中任一项的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含的编码dna序列还具有：
(i)腺嘌呤(a)，其参照seqidno.44代替第72位的鸟嘌呤(g)，和/或
(ii)腺嘌呤(a)，其参照seqidno.44代替第111位的鸟嘌呤(g)。
[7]多肽，其由根据[1]或[2]或[3]至[6]中任一项的核酸分子编码。
[8]载体或表达盒，其包含根据[1]或[2]或[3]至[6]中任一项的核酸分子，优选地，其中根据[1]或[2]或者[3]至[6]中任一项的核酸分子可操作地连接异源调控元件，优选地，其中所述调控元件是启动子。
[9]细胞，其包含根据[1]或[2]或[3]至[6]中任一项的核酸分子、根据[7]的多肽或根据[8]的载体或表达盒。
[10]植物或其部分，所述植物或其部分内源地或转基因地包含根据[1]或[2]的核酸分子，或如[8]中所定义的作为转基因的包含根据[1]或[2]的核酸分子的载体或表达盒。
[11]根据[10]的植物或其部分，其特征在于，还内源地或转基因地包含介导bnyvv抗性的rz2抗性基因。
[12]根据[10]或[11]的植物的种子或后代，其中所述种子或后代内源地或转基因地包含根据[1]或[2]的核酸分子，或根据[8]的载体或表达盒。
[13]根据[12]的种子，所述种子经过了技术处理，其中所述技术处理选自：
(a)抛光，
(b)拌种(dressing)，优选粒化(pelleting)，
(c)包壳，和
(d)上色。
[14]寡核苷酸或寡核苷酸对，其长度为至少15、16、17、18、19或20、优选至少21、22、23、24或25、特别优选至少30、35、40、45或50、特别优选至少100、200、300或500个核苷酸，其中，所述寡核苷酸或寡核苷酸对
(i)与[3]至[6]中任一项所定义的核苷酸序列特异性杂交，但不与[1]或[2]中所定义的核苷酸序列特异性杂交；
(ii)与[1]或[2]中定义的核苷酸序列特异性杂交，但不与[3]至[6]中任一项定义的核苷酸序列特异性杂交；
(iii)与甜菜基因组中的区域特异性杂交，在甜菜中，所述区域与根据[3]至[6]中任一项的核酸分子共分离和/或与根据[3]至[6]中任一项的核酸分子连同rz2基因一起共分离；和/或
(iv)与甜菜基因组中的区域特异性杂交，在甜菜中，所述区域与根据[1]或[2]的核酸分子共分离和/或与根据[1]或[2]的核酸分子连同rz2基因一起共分离。
[15]根据[14]的寡核苷酸或寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸对选自seqidno.24至seqidno.40。
[16]一种在内源地或转基因地包含介导bnyvv抗性的rz2抗性基因的甜菜物种植物中赋予、恢复或增加对bnyvv的抗性的方法，包括以下步骤：
(i)通过同源定向修复或同源重组(优选地通过定点核酸酶来促进)将根据[1]或[2]的核酸分子整合或渗入到甜菜物种植物的至少一个细胞的基因组中，以及任选地，从所述植物细胞再生植物；或
(ii)提高根据[1]或[2]的核酸分子在植物中的表达，特别是在感染bnyvv后提高，优选地通过修饰天然启动子或通过使核酸分子与异源启动子融合提高，所述异源启动子相较于天然启动子表现出更高的活性；或
(iii)通过修饰根据[1]或[2]的核苷酸分子提高多肽的功能等位基因的活性和/或稳定性，其如[7]中所定义的由根据[1]或[2]的核酸分子编码；
(iv)用根据[1]或[2]的核酸分子或如[8]中所定义的包含根据[1]或[2]的核酸分子的载体或表达盒转化植物细胞，并且任选地从转化的植物细胞再生转基因植物；或
(v)诱变包含根据[3]至[6]中任一项的核酸分子的植物或植物细胞，并分别筛选/选择植物或植物细胞，在所述植物或植物细胞中，恢复了由根据[1]或[2]的核酸分子编码的多肽的功能性等位基因和/或消除了非功能性多肽的表达。
[17]一种用于产生bnyvv抗性植物的方法，所述抗性植物如[10]中所定义的包含根据[1]或[2]的核酸分子，所述方法包括以下步骤：
(i)提供甜菜属的植物或甜菜属的植物细胞，所述植物或植物细胞内源地或转基因地包含介导bnyvv抗性的rz2抗性基因；和
(iia)用根据[1]或[2]的核酸分子或如[8]中所定义的包含根据[1]或[2]的核酸分子的载体或表达盒转化(i)的植物细胞；和
(iib)从所转化的植物细胞再生转基因植物；或
(iiia)将定点核酸酶或切口酶和任选的修复基质或定点碱基编辑器引入植物细胞中，其中所述定点核酸酶能够在细胞基因组中的预定位置产生至少一个dna单链断裂或至少一个dna双链断裂，并且所述修复基质包含根据[1]或[2]的核酸分子，或其中定点碱基编辑器能够在细胞基因组中的预定位置产生至少一个dna单链断裂，并转变至少一个核碱基；和
(iiib)任选地，在允许在预定位置修饰基因组的条件下，培养来自(iiia)的细胞，所述修饰选自
a)替换至少一个核苷酸；
b)缺失至少一个核苷酸；
c)插入至少一个核苷酸；
d)a)至c)的任意组合，
任选地，通过同源介导的修复或同源重组修饰，
其中核酸分子被整合到植物的基因组中；和
(iiic)从(iiib)中修饰的细胞再生植物；或
(iva)使(i)的植物与[10]至[12]中任一项的植物杂交；和
(ivb)鉴定和选择内源地或转基因地包含介导bnyvv的rz2抗性基因和内源地或转基因地包含根据[1]或[2]的核酸分子的植物，其中rz2抗性基因和/或根据[1]或[2]的核酸分子纯合地存在于植物基因组中。
[18]根据[17]的方法，其特征在于，所述预定位置在根据[3]至[6]中任一项的核酸分子中或在距[3]至[6]中任一项的核酸分子的上游或下游最多10.000个碱基对的位置。
[19]一种鉴定包含根据[1]或[2]的核酸分子的甜菜物种植物、其部分或其种子的方法，其中如果存在于所述植物的基因组中，所述植物能够表现出由rz2介导的对bnyvv的抗性，包括：
(i)检测在所述植物、其部分或其种子中，根据[1]或[2]的核酸分子的存在和/或表达，或如[7]所定义由根据[1]或[2]的核酸分子编码的多肽的存在；和/或
(ii)在根据[1]或[2]的核酸分子的核苷酸序列中或其一个或多个共分离区域中检测至少一个标记位点；和
(iii)在(i)和/或(ii)的检测的基础上，鉴定和任选地选择包含根据[1]或[2]的核酸分子的甜菜物种植物、其部分或其种子，如果存在于所述植物的基因组中，所述植物能够表现出由rz2介导的对bnyvv的抗性。
[20]一种鉴定包含根据[3]至[6]中任一项的核酸分子的甜菜物种植物、其部分或其种子的方法，包括：
(i)检测在所述植物、其部分或其种子中，根据[3]至[6]中任一项的核酸分子的存在和/或表达，或如[7]中所定义的由根据[3]至[6]中任一项的核酸分子编码的多肽的存在；和/或
(ii)在根据[3]至[6]中任一项的核酸分子的核苷酸序列中或其一个或多个共分离区域中检测至少一个标记位点；和
(iii)在(i)和/或(ii)的检测的基础上，鉴定和任选地选择包含根据[3]至[6]中任一项的核酸分子的甜菜物种植物、其部分或其种子。
[21]根据[19]或[20]的方法，其中在根据[1]或[2]的核酸分子的核苷酸序列中或在根据[3]至[6]中任一项的核酸分子的核苷酸序列中检测至少一个标记位点包括使用根据权利要求14或15所述的寡核苷酸或寡核苷酸对，其中所述一个或多个共分离区域是甜菜中3号染色体上的基因组区间(interval)，其包含可通过以下标记检测到的位于侧翼的标记位点：
(i)标记s3e5985s01(seqidno.33)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e2247xxx(seqidno.40)，
优选：
(i)标记sxh1002s02(seqidno.34)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和sxn1017s02(seqidno.39)，
更优选：
(i)标记sxh2499s01(seqidno.35)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记sxi0698s01(seqidno.36)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(iii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和sxe7357s01(seqidno.38)，和/或
(iv)标记s3p4351s01(seqidno.29)和sxh8485s01(seqidno.37)，和/或
(v)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(vi)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5800s01(seqidno.32)，和/或
(vii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e4913xxx(seqidno.31)，和/或
(viii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5782s01(seqidno.30)。
[22]根据[19]或[21]的方法，还包括：
(a)检测在植物、其部分或其种子中rz2基因的存在和/或表达或由rz2基因编码的多肽的存在；和/或
(b)检测在rz2基因中或与rz2基因共分离的一个或多个区域中、优选与包含[1]或[2]的核酸分子和rz2基因的染色体区间共分离的一个或多个区域中的至少一个标记位点；
其中，在[19]的(i)或(ii)的检测以及(b)的检测的基础上，在[19]的(iii)中所鉴定和任选选择的植物、其部分或其种子包含根据[1]或[2]的核酸分子和rz2基因。
[23]根据[22]的方法，其中rz2基因的核苷酸序列中的至少一个标记位点可通过标记s3e5853s01(seqidno.26)检测到，并且其中与rz2基因共分离的所述一个或多个区域是甜菜中3号染色体上的基因组区间，该区间包含可通过以下标记检测到的位于侧翼的标记位点：
(i)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和s3e2247xxx(seqidno.40)，
优选：
(i)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxn1017s02(seqidno.39)，
更优选：
(i)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.33)和sxe7357s01(seqidno.38)，和/或
(iii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxh8485s01(seqidno.37)。
[24]根据[22]的方法，其中与包含根据[1]或[2]的核酸分子和rz2基因的染色体区间共分离的一个或多个区域是甜菜中3号染色体上的基因组区间，所述区间包含可通过以下标记检测到的位于侧翼的标记位点：
(i)标记s3e5985s01(seqidno.33)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和s3e2247xxx(seqidno.40)，
优选：
(i)标记sxh1002s02(seqidno.34)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxn1017s02seqidno.39)，
更优选：
(i)标记sxh2499s01(seqidno.35)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记sxi0698s01(seqidno.36)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(iii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxe7357s01(seqidno.38)，和/或
(iv)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxh8485s01(seqidno.37)。
[25]根据[14]或[15]的寡核苷酸或寡核苷酸对用来鉴定和/或选择甜菜物种植物的用途，所述甜菜物种植物能够表现由rz2(如果存在于植物的基因组中)介导的对bnyvv的抗性，或其表现由rz2(如果存在于植物的基因组中)介导的对bnyvv的抗性的能力受损。
[26]一种栽培甜菜物种植物的方法，包括
(i)种植根据[10]或[11]的植物的幼苗或播种根据[12]或[13]的种子，和
(ii)从幼苗或种子长成植物，以及
(iii)任选地，从长成的植物收割甜菜根；
其中所述方法阻碍bnyvv侵染栽培的植物。
[27]根据[1]或[2]的核酸分子或根据[3]至[6]中任一项的核酸分子、根据[7]的多肽、根据[8]的载体或表达盒和/或根据[9]的细胞用于鉴定参与rz2介导的对bnyvv的抗性的核酸分子的用途。
[28]根据[1]或[2]的核酸分子或根据[3]至[6]中任一项的核酸分子、根据[7]的多肽和/或根据[8]的载体或表达盒用于产生bnyvv抗性植物的用途，所述植物优选甜菜物种植物、更优选betavulgarisssp.vulgarisvar.vulgaris，betavulgarisssp.vulgarisvar.conditiva，或betavulgarisssp.vulgarisvar.crassa/alba。
[29]根据[1]至[6]的核酸分子，根据[11]的植物或其部分，根据[14]或[15]的寡核苷酸或寡核苷酸对，根据[16]至[19]和[22]至[24]中任一项的方法以及根据[25]和[27]的用途，其中rz2基因或rz2抗性基因是包含选自以下的核苷酸序列的核酸分子：
a)核苷酸序列，其编码具有根据seqidno.22或seqidno.23的氨基酸序列多肽，
b)核苷酸序列，其包含根据seqidno.21的dna序列的编码序列，
c)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽通过由根据a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的氨基酸的取代、缺失和/或添加衍生自由根据a)或b)的核苷酸序列编码的多肽，
d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与由根据a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，或
e)核苷酸序列，其编码seqidno.22的至少下列的氨基酸位置：第168-227位、第591-613位和第1013-1072位，或编码seqidno.23的至少下列的氨基酸位置：第182-241位、第605-627位和第1027-1086位。
[30]根据[19]的方法，其中根据步骤(i)和/或步骤(ii)的检测基于pcr，优选基于竞争性等位基因特异性pcr(kasp)，其中使用了任选地标记的引物。
[31]根据[20]的方法，其中根据步骤(i)和/或步骤(ii)的检测基于pcr，优选基于竞争性等位基因特异性pcr(kasp)，其中使用了任选地标记的引物。
[32]根据[26]的方法，其中根据(i)的种植是通过机械设备完成的，所述机械设备优选选自撒种机、种植机和播种机。
[33]根据[26]或[32]的方法，其中根据(iii)的收割是通过机械设备完成的，所述机械设备可是收割机，优选甜菜收割机。
[34]根据[26]、[32]或[33]的方法，其中在根据(iii)的收割期间机械去除植物的叶子，其中机械去除优选由[33]中定义的收割机完成。
[35]根据[26]、[32]、[33]或[34]的方法，还包括以下步骤：
(iv)从收割的甜菜根提取糖，优选蔗糖。
[36]根据[25]的用途或根据[14]或[15]的寡核苷酸或寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸对优选用荧光标记，更优选用fam或hex荧光标记。
[37]根据[9]的细胞、根据[10]或[11]的植物或其部分的细胞提取物。
[38]根据[37]的细胞提取物，其包含根据[1]的核酸分子。
[39]根据[37]或[38]的细胞提取物，其中所述细胞提取物包含蔗糖。
[40]根据[37]、[38]或[39]的细胞提取物，其中蔗糖浓度为至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，最优选10％至20％，其中浓度以质量浓度[g/dl]给出。
[41]根据[19]或[20]的方法，其中将所鉴定的植物或其种子用于根据[26]、[32]、[33]或[34]的方法中。
[42]根据[7]的多肽，其中所述蛋白质包含在seqidno.45的序列中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。
[43]根据[7]的多肽，其中所述多肽是人工化合物，其在自然界中不存在。
[44]一种产生用于鉴定根据[1]的核酸分子的分子标记的方法，包括以下步骤：
a)提供seqidno.54和seqidno.55之间的序列比对，
b)鉴定seqidno.54和seqidno.55之间的至少一个多态性，
c)开发一或多个分子标记，其适用于检测b)中鉴定出的多态性。
[45]根据[44]的方法，其中所述至少一个多态性是单核苷酸多态性。
[46]在根据seqidno.54的核苷酸序列上的分子标记用于鉴定根据[1]的核酸分子或用于鉴定包含根据[1]的核酸分子的植物的用途。
首先，下面将详细解释本申请中使用的一些术语：
结合核苷酸序列的长度说明的术语“大约”是指+/-200个碱基对的偏差，优选地，+/-100个碱基对的偏差，并且特别优选地，+/-50个碱基对的偏差。
“甜菜属植物”属于苋科(amaranthfamily/amaranthaceae)。这些植物中包括betamacrocarpa、甜菜(betavulgaris)、betalomatogona、betamacrorhiza、betacorolliflora、betatrigyna和betanana物种的植物。特别地，甜菜物种的植物是亚种betavulgarissubsp.vulgaris的植物。例如，其中包括betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(狭义上的甜菜)、betavulgarisssp.vulgarisvar.vulgaris(叶用甜菜)、betavulgarisssp.vulgarisvar.conditiva(甜菜根/红甜菜)、betavulgarisssp.vulgarisvar.crassa/alba(饲用甜菜)。
核苷酸序列的“功能片段”是指其功能性与其所源自的完整核苷酸序列的功能性相同或相当的核苷酸序列的区段。因此，功能片段可在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％的长度上与总核苷酸序列相同或同源的核苷酸序列。这也明确涵盖了90-100％的范围。此外，核苷酸序列的“功能片段”还可指例如在转录后或转录基因沉默过程中修饰整个核苷酸序列的功能性的核苷酸序列的片段。因此，核苷酸序列的功能片段可包含总核苷酸序列中的至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，优选至少30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120或140，特别优选至少160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000个连续的核苷酸。这也明确涵盖了21至50个核苷酸的范围。
蛋白质的“功能部分”是指蛋白质区段或编码所述蛋白质的氨基酸序列的一部分，其中所述区段可发挥与植物细胞中完整蛋白质相同或相当的功能。在至少为50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％，94％，96％，97％，98％或99％的长度上，蛋白质的功能部分与该功能部分所源自的蛋白质相同或相似(考虑到保守和半保守的氨基酸交换)的氨基酸序列。
术语“异源”是指引入的多核苷酸源自相同物种或不同物种的具有不同遗传背景的细胞或生物体，或者与原核或真核宿主细胞同源，但是位于不同的遗传环境中，因此与可能天然存在的相应的多核苷酸不同。除了相应的内源基因之外，还可存在异源多核苷酸。
就本发明的意义而言，“同源物”应理解为具有相同系统发生起源的蛋白质；“类似物”应理解为发挥相同功能但具有不同系统发生起源的蛋白质；“直系同源物”应理解为发挥相同功能的来自不同物种的蛋白质；“旁系同源物”应理解为由于复制在物种内出现的蛋白质，其中这种拷贝保留相同的蛋白质功能，改变其表达模板但不改变功能，改变其蛋白质功能，或在两个拷贝之间瓜分(divideup)原始基因功能。
“杂交(hybridizing或hybridization)”应理解为一种过程，其中单链核酸分子结合以最大可能程度与其互补的核酸链，即与其形成碱基对。杂交的标准方法描述于例如sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第三版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001中。由此优选应理解地是，至少60％、更优选至少65％、70％、75％、80％或85％、并且特别优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸分子的碱基与最大可能程度上互补的核酸链形成碱基配对。这种退火的可行性取决于杂交条件的严格性。术语“严格性”与杂交条件有关。当进行碱基配对更困难时，存在高严格性。当碱基配对更容易时，则存在低严格性。例如，杂交条件的严格性取决于盐浓度或离子强度和温度。通常，可通过升高温度和/或降低盐含量来提高严格性。“严格杂交条件”应理解为杂交主要仅在同源核酸分子之间发生而指定的条件。术语“杂交条件”由此不仅涉及在核酸的实际加成中普遍存在的条件，而且还涉及在随后的洗涤步骤中普遍存在的条件。例如，严格的杂交条件主要是指在此类条件下，仅那些具有至少70％、优选地，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列相同性的核酸分子杂交。严格的杂交条件为：例如在65℃下在4xssc中杂交，随后在65℃下在0.1xssc中重复洗涤共约1个小时。杂交优选在严格条件下发生。
对于双链dna形式的核酸，“互补”核苷酸序列是指根据碱基配对规则，与第一dna链互补的第二dna链具有与第一链的碱基对应的核苷酸。互补序列优选与反序列完全互补，因此优选具有相同的长度。
“分离的核酸分子”应理解为是从其天然或原始环境中提取的核酸分子。该术语还包括合成产生的核酸分子。“分离的多肽”被理解为从其天然或原始环境中提取的多肽。该术语还包括合成产生的多肽。
“分子标记”是在植物群体中具有多态性的核酸，并且用作参照或定向点。用于检测重组事件的标记应适合于监测植物群体内的差异或多态性。因此，此类标记能够检测和区分各种等位基因的状态(等位基因)。术语“分子标记”还涉及与基因组序列互补或至少很大程度上互补或同源的核苷酸序列，例如用作探针或引物的核酸。可发现这些dna水平的差异作为标记，并且所述差异是例如多核苷酸序列差异，诸如ssr(简单序列重复)、rflp(限制性片段长度多态性)、flp(片段长度多态性)或snp(单核苷酸多态性)。标记可源自基因组或表达的核酸，例如剪接的rna、cdna或est，并且还可能与用作探针或引物对的核酸有关，因此适用于使用基于pcr的方法扩增序列片段。可使用现有技术中成熟的方法来检测描述遗传多态性(在群体的各个部分之间)的标记(anintroductiontogeneticanalysis，第7版，griffiths，miller，suzuki等人，2000)。例如，其中包括dna测序、基于pcr的序列特异性扩增、验证rflp，通过等位基因特异性杂交(ash)验证多核苷酸多态性，检测植物基因组的扩增可变序列、检测3sr(自主序列复制)、检测ssr、snp、rflp或aflp(扩增的片段长度多态性)。此外，用于检测est(表达序列标签)和源自est序列和rapd(随机扩增的多态dna)的ssr标记的方法也是已知的。根据上下文，说明书中的术语“标记”也可指可在其中发现特定标记(例如，snp)的物种的基因组中的特定染色体位置。
标记还包括可与一个或多个检测分子连接的合成寡核苷酸，其中在验证方法的范畴内，检测分子可用于检测反应或信号的产生。合成的寡核苷酸还包括标记的引物。标记的引物包括荧光标记的引物。荧光标记的引物可用fam或hex标记。合成的寡核苷酸和标记的引物可在聚合酶链式反应(pcr)以及竞争性等位基因特异性pcr中使用。合成的寡核苷酸和标记的引物是人工化合物，其在自然界中不存在，也无法从自然界中分离。这种化合物的产生在下文进行进一步说明。
“启动子”是非翻译的调控dna序列，通常在编码区的上游，其包含rna聚合酶的结合点并起始dna的转录。启动子还包含充当基因表达的调控基因的其它元件(例如，顺式调控元件)。“核心或最小启动子”是具有启动转录所需的基本元件的启动子(例如，tata盒和/或起始子)。
“病原体”是指与植物相互作用而导致植物的一个或多个器官中产生疾病症状的生物体。例如，在这些病原体中包括动物、真菌、细菌或病毒生物或卵菌。
“病原性感染”应理解为病原体与植物宿主组织相互作用的最早时间点。从这个意义上说，“感染”是指病原体与宿主之间发生接触。例如，病毒病原体bnyvv是由土传真菌甜菜多粘菌传播的。多粘菌形成孢子，其可在土壤中存活数十年。所述病毒也在这些孢子中存活。如果这些永久性孢子萌芽产生游动孢子，则病毒可通过这些游动的孢子进入植物宿主组织的细胞并与宿主相互作用(esser(2000)kryptogamen1:cyanobakterienalgenpilzeflechtenpraktikumundlehrbuch.springer-verlag,berlin,heidelberg，第三版)。
植物“器官”是指例如叶子、幼枝(shoot)、茎、根、下胚轴、营养芽、分生组织、胚、花药、胚珠、种子或果实。“植物部分”包括但不限于幼枝或茎(stalk)、叶、花、花序、根、果实和种子以及花粉。术语“植物部分”也指多个器官的结合，例如花或种子，或者器官的一部分，例如贯穿植物幼枝的横截面。植物“组织”例如是愈伤组织、贮藏组织、分生组织、叶组织、芽组织、根组织、植物瘤组织或生殖组织，以及新生组织、薄壁组织、维管组织、厚壁组织和表皮。但是，组织并不限于所列的这些。例如，植物“细胞”应理解为例如具有细胞壁的分离的细胞或其聚集体或原生质体。
可通过确定评分来定性地定义甜菜属植物中例如对bnyvv的抗性水平(甜菜属植物的评分方案是现有技术中已知的，例如糖用甜菜的评分方案，mechelke(1997))。
结合本发明，术语“调控序列”涉及影响特异性和/或表达强度的核苷酸序列，例如因为调控序列赋予定义的组织特异性。例如，在转录但未翻译的前导序列中或在内含子中，此类调控序列可位于最小启动子的转录起始点的上游，但也可位于其下游。
术语“抗性”应作广义地理解，涵盖了从延缓直至完全阻止疾病发展的保护范围。重要的病原体的一个实例是甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)。本发明的抗性植物细胞或本发明的抗性植物优选实现对bnyvv的抗性。对病原体的抗性等同于对这种病原体引起的疾病的抗性；例如，对bnyvv的抗性也是对“根疯病”(丛根病)的抗性。
在国际专利申请wo2014/202044a1中鉴定和描述的“rz2”抗性基因源于海甜菜，登录号wb42，并且已知其在若干品种的甜菜中表达时，提供对丛根病的抗性。此外，已知已鉴定出来自海甜菜的rz3，登录号wb41，其很可能是与rz2相同或非常相似的等位基因变体。因此，rz2和rz3基因以及各自的蛋白质基本相同，并且名称“rz2”和“rz3”可互换使用。
“remorin”是植物特异性蛋白家族，其包含可变的n端区域和保守的c端结构域，并且在各种生物和非生物胁迫(包括宿主-微生物的相互作用)中起作用。本发明区分了编码功能性remorin蛋白的remorin基因和编码非功能性remorin蛋白的remorin基因，所述功能性remorin蛋白即在其中表达该蛋白质的植物中参与建立rz2介导的bnyvv抗性的remorin蛋白，所述非功能性remorin蛋白即在表达该蛋白的植物中干扰rz2介导的bnyvv抗性的remorin蛋白。在本文中，术语“参与”包括增加抗性以及对于在另外包含rz2抗性基因的植物中建立对bnyvv的抗性、特别是对bnyvv的高水平抗性是必不可少的。就不能与rz2基因组合赋予抗性的角度，使用术语“非功能性”。
因此，本发明的术语“功能性形式”、“功能性(remorin)蛋白”、“功能性(remorin)多肽”、“功能性(remorin)变体”、“功能性(remorin)等位基因”、“功能性(remorin)基因”、“功能性核酸分子”可互换使用，本发明的术语“非功能性形式”、“非功能性(remorin)蛋白”、“非功能性(remorin)多肽”、“非功能性(remorin)变体”、“非功能性(remorin)等位基因”、“非功能性(remorin)基因”和“非功能性核酸分子”也可互换使用。
“转基因植物”涉及其基因组中整合有至少一个多核苷酸的植物。因此，它可是异源多核苷酸。优选地，多核苷酸被稳定地整合，这意味着整合的多核苷酸稳定地保存在植物中，并被表达并且还可被稳定地传递给后代。将多核苷酸稳定引入植物基因组中还包括整合到上一亲代植物的基因组中，其中多核苷酸可进一步稳定地传递。术语“异源”是指引入的多核苷酸源自相同物种或不同物种的具有不同遗传背景的细胞或有机体，或者与原核或真核宿主细胞同源，(例如)但是位于不同的遗传环境中，因此与可能天然存在的相应的多核苷酸不同。除了相应的内源基因之外，还可存在异源多核苷酸。
“用于工业制糖的原料”是指可送入专门用于从甜菜中提取糖的制糖设备的植物材料。这种原料通常是收割的甜菜的甜菜主体(主根)。为确保与提取过程的一致性，甜菜主体需要具有足够的质量、体积和圆锥形状，以便可使原料机械切成条(甜菜条)。这些甜菜条可使糖提取的表面积最大化，并且具有低含量的钠、钾和氮，以便有效提取。提取后，将剩余的甜菜粕压榨、干燥并用作动物饲料。
“蔗糖浓度”以根的鲜重的百分比表示。
“单胚”是指种子完全长成一株植物，而多胚(polygerm或multigerm)种子(也称为“种球”)长成几株植物。
“抽苔”是使甜菜产生一根或多根花茎以尝试自然产生种子和繁殖。由于春化作用，即可能在越冬期间发生的低温胁迫，触发了抽苔。但是，在抽苔之前，要收割商业种植的甜菜，因为抽苔过程和随后的结籽降低了甜菜体内的蔗糖含量。
“竞争性等位基因特异性pcr”或“kasp”是指聚合酶链式反应的同系的、基于荧光的基因分型变体。它基于等位基因特异性的寡核苷酸延伸和荧光共振能量转移来产生信号。该化学反应可用于检测基因组dna中的特异性核酸序列。通常，将荧光标记的引物用于pcr。fam和hex可用作荧光标签。
参考所附的(pending)序列和附图，通过示例的方式描述本发明的设计和实施方案。
图1：模型描述了甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)的tgb1蛋白、rz2nbs-lrr受体蛋白与(a)remorin蛋白的功能性变体或(b)remorin蛋白的非功能性变体之间可能的相互作用模式。在变体(a)中，tgb1蛋白结合并修饰功能性remorin蛋白，其可由抗性等位基因的rz2nbs-lrr受体蛋白检测到，因此引发了抗性反应。在变体(b)中，rz2nbs-lrr受体蛋白无法检测到由tgb1修饰的非功能性remorin蛋白，因此不会引发抗性反应。
图2：编码非功能性remorin蛋白的remorin基因的编码dna(cdna)序列与编码功能性remorin蛋白的remorin基因的4个单倍型的cdna序列之间的序列比对，所述非功能性remorin蛋白即干扰其中表达该蛋白的植物中rz2介导的对bnyvv的抗性的remorin蛋白(单倍型1，hap1-orf)，所述功能性remorin蛋白即参与在表达该蛋白的植物中建立rz2介导的对bnyvv的抗性的remorin蛋白(hap2-orf、hap3-orf、hap4-orf和hap5-orf)。多态性用灰色突出显示。
图3：非功能性remorin蛋白(hap1)与4种功能性remorin蛋白之间的蛋白序列比对，所述非功能性remorin蛋白即在其中表达该蛋白的植物中干扰rz2介导的对bnyvv的抗性的remorin蛋白，所述功能性remorin蛋白即参与在表达该蛋白的植物中建立rz2介导的对bnyvv的抗性的remorin蛋白(hap2、hap3、hap4和hap5)。多态性以灰色突出显示。
图4：瞬时试验的示意图，其用于比较甜菜叶组织中源自bnyvv的tgb1基因表达后的细胞死亡反应，所述甜菜叶组织包含rz2的抗性等位基因，并且另外包含remorin的功能性等位基因(rem(f))，或remorin的非功能性等位基因(rem(n-f))。详细的实验在实施方案2中进行了说明。
图5：瞬时试验的示意图，其用于比较甜菜叶组织中源自bnyvv的tgb1基因表达后结合remorin的非功能性等位基因(rem(n-f))或结合remorin的功能性等位基因(rem(f))或结合空载体对照的细胞死亡反应，所述甜菜叶组织包含rz2的抗性等位基因和remorin的功能性等位基因(rem(f))。详细的实验在实施例2中进行了说明。
图6：瞬时试验的示意图，其用于比较甜菜叶组织中源自bnyvv的tgb1基因和rz2的抗性等位基因表达后结合remorin的非功能性等位基因(rem(n-f))或结合remorin的功能性等位基因(rem(f))的细胞死亡反应，所述甜菜叶组织既不包含rz2的抗性等位基因也不包含remorin的功能性等位基因(rem(f))。详细的实验在实施例2中进行了说明。
图7：甜菜的3号染色体的示意图，其中指示了remorin基因和rz2基因的位置以及各种标记的位置。remorin位于3号染色体长臂上距离rz2基因约0.75cm的位置。左：远离remorin、靠近rz2的标记位置，其限定了可用于标记辅助育种(mas)的侧翼区域；右：在remorin基因、rz2基因以及两个基因之间的区域中结合的标记。
图8：针对重组体中rz2抗性基因和remorin基因的不同等位基因组合的存在，对划分群体的2730株植物基于标记的分析的直观图示，其中a表示存在编码非功能性remorin蛋白的remorin基因，b表示存在编码功能性remorin蛋白的remorin基因。h表示该基因型对于非功能性remorin等位基因是杂合的。
图9该图示出了用根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)浸润后的本氏烟草(nicotianabenthamiana)叶。环绕的白色斑点标记了浸润区域，其中每个区域均已使用不同的载体组合进行了浸润。载体组合将在相应的实施例中进行详细说明。
图10测量在转化的甜菜叶盘中的萤光素酶活性。提供了不同的构建体：
1：空载体；2：rz2_c48+空载体；3：bnyvv_tgb1+空载体；4：rz2_c48+bnyvv_tgb1；5：rz2_c48_d491v(自激活变体)；6：p70s-165-176_d80n(自激活cc结构域，阳性对照)
发明详述
尽管存在rz2的抗性等位基因，但在某些甜菜品种中，rz2介导的对甜菜坏死性黄脉病毒(bnyvv)的抗性被削弱或甚至完全丧失，为揭示所观察到的这一效果背后的机理，并将获得的知识用于改善育种过程，进行了广泛的杂交实验以及分子生物学实验，其中包括遗传精细作图、鉴定、分离和表征编码蛋白质的基因，该蛋白质的功能形式对于在植物中建立rz2介导的对bnyvv的抗性非常重要或具有决定性，且该蛋白质的非功能性形式导致抑制所述抗性。
在将要配备rz2抗性的bnyvv抗性变体的育种中，两种等位基因变体的鉴定高度相关，两种等位基因变体即：一种编码功能性蛋白的等位基因变体和另一种编码非功能性蛋白的等位基因变体。一方面，重要的是能够从rz2抗性等位基因中分离出非功能性等位基因，以便使用的甜菜品系显示出降低或丧失的rz2介导的bnyvv抗性，但是在bnyvv抗性甜菜品种的育种中具有良好的育种和农艺特性。另一方面，尤其重要的是理解开发植物中rz2介导的对bnyvv的抗性背后的机制，即识别功能性等位基因，以便有效地产生对bnyvv具有抗性的植物。
因此，本发明通常涉及编码参与rz2介导的对bnyvv的抗性的多肽的核酸分子。在这一背景下，术语“参与”包括增加抗性以及对于建立对bnyvv的抗性、特别是对bnyvv的高水平抗性是必不可少的。因此，本发明的核酸分子和编码的多肽分别修饰了在表达该多肽的植物中rz2介导的对bnyvv的抗性。优选地，本发明的核酸分子增加了对bnyvv的抗性或对于在表达相应多肽的植物中建立对bnyvv的抗性是必不可少的。简化起见，将这种核酸分子称为本发明的“功能形式”、“功能变体”、“功能等位基因”、“功能基因”或“功能核酸分子”。
优选地，本发明的核酸分子修饰植物中rz2介导的对bnyvv的抗性，所述植物属于甜菜属，优选地属于甜菜物种，更优选属于甜菜亚种(betavulgarissubsp.vulgaris)。
本发明还涉及与本发明的核酸分子特异性杂交并编码多肽的非功能性等位基因的核酸分子，即非功能性变体，其在表达该多肽的植物中干扰由rz2抗性基因介导的对bnyvv的抗性。简化起见，将这种核酸分子称为本发明的“非功能形式”、“非功能变体”、“非功能等位基因”、“非功能基因”或“非功能核酸分子”。
具体而言，本发明的非功能核酸分子能够在表达相应多核苷酸的植物中减少或抑制rz2介导的对bnyvv的抗性。优选地，所述植物属于甜菜属，优选属于甜菜物种，更优选属于甜菜亚种(betavulgarissubsp.vulgaris)。
先前在国际专利申请wo2014/202044a1中鉴定和描述的rz2抗性基因起源于海甜菜，登录号wb42，并且已知其在甜菜的几种变体中表达时，提供对丛根病的抗性。相应的核酸序列在wo2014/202044a1中公开，并通过引用方式并入本文中。已鉴定出来自海甜菜的rz3，登录号wb41，其可能是rz2的等位基因形式。因此，rz2和rz3基因基本上是相同的，可谨慎地预期但不限于理论，本发明的核酸分子也参与或干扰rz3介导的对bnyvv的抗性。
如实施例1中所述，已对本发明的核酸分子进行了鉴定和遗传定位。首先聚焦于非功能性等位基因的鉴定和定位。通过遗传作图已显示出非功能性等位基因位于rz2位点附近。但是，该区域仍然包含太多基因，而无法指定特定的候选基因。一个具体的挑战是非功能性等位基因与rz2抗性基因的紧密遗传偶联/连锁。如果它位于另一条染色体上或与rz2基因距离较远，则该效应将以单独的效应呈现在qtl作图中。因此，当使用普通的育种方法时，尽管存在rz2抗性等位基因，却无法解释为什么基因型容易感染丛根病。
在遗传作图的同时，分析了多基因育种材料中分子标记的图案。标记s3e5798s01(参见表5)显示了定位阻遏物效应的最高证据。对该区域的参照序列的分析表明，标记s3e5798s01位于带注释的基因模型(g23238.t1)中。该基因包含一个remorin结构域(c端区域)，并在质膜中表达。remorin是植物特异性蛋白家族，其包含可变的n端区域和保守的c端结构域，并且在各种生物和非生物胁迫(包括宿主-微生物的相互作用)中发挥作用。但是，直到现在，它们的功能还没有被完全理解。
在文献中有迹象表明，remorin可在通过胞间连丝(pd)的病毒传播中发挥作用，尤其是它们可充当病毒运动的负调控因子(raffaele等人，plantcell(2009)，21(5)，1541-1555；perraki等人，femsletters(2014)，588(9)，1699-1705)。通常，胞间连丝可提供细胞间的连接，其能够共质体运输1至60kd的分子。病毒可通过胞间连丝传播以实现局部传播感染，并共质体加载到韧皮部中，从而引发全身性感染。
更详细地，raffaele等人(2009)报道了在马铃薯中，remorin干扰马铃薯病毒x(potatovirusx)的细胞间的运动，并直接结合到病毒运动蛋白tgbp1上(三重基因块1(triplegeneblock)蛋白)。在remorin积聚不足的植物中，已观察到被感染的植物的叶片中病毒积聚显著增加，并且感染灶明显比野生型植物的大。一致地是，在过表达remorin的植物中观察到减少的病毒积聚和较小的感染灶。因此，remorin似乎对病毒传播具有拮抗作用。在这一背景下，perraki等人(2014)已示出，在马铃薯中，remorin基因限制了马铃薯病毒xtgbp1的能力，从而增加了胞间连丝的渗透性。
此外，wetzel和varrelmann最近发表的著作(国际植物免疫研讨会-第一届irtg2172protect研讨会，2018年6月14日至15日在德国哥廷根举行)表明，rz2基因产生的蛋白质即rz2nbs-lrr受体蛋白可能与bnyvv的tgbp1蛋白相互作用，bnyvv这种病毒会引起丛根病。rz2nbs-lrr受体蛋白和bnyvv的tgbp1蛋白之间缺失的连接可能是根据本发明鉴定出的remorin。由此可推导出一种可能的作用方式，如图1a所示。因此，假定但不限于一种理论，本发明的remorin基因具有如上所述的在甜菜中的相似或甚至相同的功能，即它充当bnyvv运动的负调控因子。
根据本发明鉴定的remorin基因的非功能性等位基因看起来是非功能性蛋白。一种可能的作用模式如图1b所示，其中抗性等位基因的rz2nbs-lrr受体蛋白无法检测到bnyvv的tgb1蛋白对这种等位基因的修饰。因此，没有引发抗性反应。
根据本发明进行的进一步实验证实了该假设，其中第一结果表明rz2的抗性等位基因与remorin的非功能性等位基因的结合导致植物仍易感丛根病，而包含rz2的抗性等位基因和remorin的功能性等位基因的植物显示抗性；参见实施例2。
通过对非功能性remorin等位基因的整个鉴定和分析所获得的知识随后已用于鉴定功能性remorin等位基因。具体而言，为鉴定功能性remorin基因的序列，已进行了甜菜品种的基因组序列的比较分析，所述甜菜品种的基因组序列包含非功能性remorin等位基因，因此尽管存在rz2基因和80个其它甜菜基因型序列，但显示没有或降低的bnyvv抗性。
总共发现了五种不同的单倍型(等位基因)。非功能性remorin基因的单倍型(单倍型1)可通过三个kasp标记与其他四个单倍型(即功能性remorin基因)区分开，三个kasp标记分别为：s3p4348s01(seqidno：27；非功能性等位基因：g)，s3p4349s01(seqidno：28；非功能性等位基因：t),s3p4351s01(seqidno：29；非功能性等位基因：t)；参见表5。编码序列，即seqidno：3中示出的非功能性等位基因的开放阅读框(orf)，其具有五个小的核苷酸多态性(snp)，所述5个snp将单倍型(hap1)与其他四个单倍型(hap2-5；seqidno：7、11、15和19)区分开(图2)。因此，hap1的编码序列(cds)在72位用a代替g，在73位用g代替c，在111位处用a代替g，在214位用a代替c且在556位用a代替g；参见表1。seqidno：4中示出的非功能性等位基因的蛋白质序列中有三个氨基酸与其它四个单倍型(seqidno：8、12、16和20)明显不同；参见表2。如图3所示，由非功能性remorin基因编码的翻译的非功能性多肽在25位用丙氨酸(ala)代替脯氨酸(pro)，在第72位用苏氨酸(thr)代替脯氨酸(pro)，且在第186位用异亮氨酸(ile)代替缬氨酸(val)；同样参见表2。
表1：与其他四个单倍型(即功能性remorin等位基因)的orf相比，在非功能性remorin等位基因(＝单倍型1，hap1)的编码序列(orf)中鉴定出的snp。*标记的位置导致氨基酸交换，这可能是remorin不起作用的原因。
表2：与其他四种单倍型(即remorin的功能等位基因)的多肽的预测序列相比，在非功能性remorin等位基因(＝单倍型1)的多肽的预测序列中鉴定出的氨基酸取代。
简化起见，已产生了共有序列，其中一个组合单倍型2至5的cdna序列(seqidno.44)，另一个组合单倍型2至5的氨基酸序列(seqidno.45)。
因此，在一个实施例中，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述核酸分子参与rz2介导的对bnyvv的抗性，其中所编码的多肽的氨基酸序列参照seqidno.45在第25位具有脯氨酸(p)，参照seqidno.45在第72位具有脯氨酸(p)和/或参照seqidno.45在第186位具有缬氨酸(v)。当然，编码的多肽的氨基酸序列可在指示的位置具有所提及的氨基酸中的两个，即，参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)和第72位的脯氨酸(p)；参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)和第186位的缬氨酸(v)；参照seqidno.45，第72位的脯氨酸(p)和第186位的缬氨酸(v)；还可在指示的位置具有三个所提及的氨基酸，即，参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)，第72位的脯氨酸(p)和第186位的缬氨酸(v)。
参照所述核酸分子的编码dna序列，所述编码dna序列参照seqidno.44在第73位具有胞嘧啶(c)，参照seqidno.44在第214位具有胞嘧啶(c)和/或参照seqidno.44在第556位具有鸟嘌呤(g)。当然，编码dna序列可在指示的位置具有提及的氨基酸中的两个，即，参照seqidno.44，第73位的胞嘧啶(c)和第214位的胞嘧啶(c)；参照seqidno.44，第73位的胞嘧啶(c)和第556位的鸟嘌呤(g)；参照seqidno.44，第214位的胞嘧啶(c)和第556位的鸟嘌呤(g)；还可在指示的位置具有三个提及的氨基酸，即，参照seqidno.44，第73位的胞嘧啶(c)，第214位的胞嘧啶(c)和第556位的鸟嘌呤(g)。
在优选的实施例中，本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述核酸分子参与rz2介导的对bnyvv的抗性，其中所述多肽具有seqidno.8、12、16或20的氨基酸序列，或编码所述多肽的核苷酸序列为seqidno.5、6、7、9、10、11、13、14、15、17、18或19，或者编码dna序列是根据seqidno.7、11、15或19的核苷酸序列。
此外，可将取代、缺失、插入、添加和/或任何其他改变单独或组合地引入根据本发明的核苷酸序列中，上述改变实际上确实改变了核苷酸序列，然而其中，经过修饰的核苷酸序列可执行与初始序列相同的功能。本案涉及参与由rz2抗性基因介导的对bnyvv的抗性的氨基酸序列的编码。
因此，在又一实施例中，本发明包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽代表由根据本发明的核苷酸序列编码的多肽的衍生物，或者包括根据本发明的氨基酸序列。具有一个或多个氨基酸的至少一个取代、缺失、插入或添加的衍生氨基酸序列代表多肽的衍生物，其中保留了编码的多肽/蛋白质的功能性。因此，单独或组合进行的取代、缺失、插入、添加和/或任何其他改变可使用常规方法引入核苷酸序列中，这些改变实际上确实改变核苷酸序列但执行与起始序列相同功能，所述常规方法是有技术中已知的，例如通过定位诱变、pcr介导的诱变、转座子诱变、基因组编辑等。
一个氨基酸被具有相同或等同或相似化学/物理性质的不同的氨基酸取代称为“保守取代”或“半保守取代”。氨基酸的物理/化学性质的例子例如疏水性或带电荷性。哪种氨基酸取代表示保守或半保守取代对本领域技术人员而言是已知的。而且，一般的专门知识允许本领域技术人员识别、鉴定和检测哪些氨基酸缺失和添加对抗性蛋白的功能无害，以及在哪些位置是可行的。本领域技术人员知晓，在本发明的功能性remorin蛋白用于修饰氨基酸(取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸)的情况下，必须保留尤其是保守结构域的功能性，且因此仅有有限的上述修饰在这些结构域中是可行的。
因此，本发明包括根据本发明的核苷酸序列的功能片段。因此，术语“片段”包括具有与上述核苷酸序列足够相似的核苷酸序列的基因。术语“足够相似”是指相对于第二核苷酸序列或第二氨基酸序列，第一核苷酸序列或氨基酸序列具有足够或最少数量的相同或等同的核苷酸或氨基酸基团。
关于氨基酸序列，在通过上述方法修饰后，其也具有共同的结构域和/或具有共同的功能活性。本文中，将与根据本发明的核苷酸序列或氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少大约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的相同性的核苷酸序列或氨基酸序列定义为足够相似。这也明确涵盖了90％至100％的范围。对于功能片段，如果核苷酸序列或氨基酸序列通常具有与本发明的先前指定的核苷酸序列或氨基酸序列相同的性质，则建立起足够的相似性。从在整个长度上或至少部分对应于根据本发明的核苷酸序列的初始核苷酸序列直接或间接(例如，通过扩增或复制步骤)产生编码衍生物或用于衍生的氨基酸序列的那些核苷酸序列。
因此，本发明包括在严格条件下能够和与根据本发明的核苷酸序列或编码根据本发明的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
本发明进一步涉及与本发明的核酸分子特异性杂交并编码多肽的非功能性等位基因的核酸分子，所述非功能性等位基因即非功能性变体，其在表达该多肽的植物中干扰由rz2抗性基因介导的对bnyvv的抗性。简化起见，将这种核酸分子称为本发明的“非功能形式”、“非功能变体”、“非功能等位基因”、“非功能基因”或“非功能核酸分子”。
如实施例2所示，特别是在实验2中，非功能性多肽(remorin)等位基因与该多肽的功能性等位基因相比似乎是显性的。因此，在本发明的优选实施例中，由根据[3]的核酸分子编码的非功能性多肽比由根据[1]或[2]的核酸分子编码的多肽的功能等位基因占优势。显性是指在植物的杂合状态下，例如包含多肽的非功能性等位基因和功能性等位基因的植物，所述非功能性等位基因抑制或阻止了抗性的发展，因此所述植物分别易受bnyvv感染和易在植物内传播病毒。
具体而言，本发明的非功能核酸分子能够在表达相应多核苷酸的植物中减少或抑制rz2介导的对bnyvv的抗性。优选地，所述植物属于甜菜属，优选地属于甜菜物种，更优选地属于甜菜亚种(betavulgarissubsp.vulgaris)。
所述非功能性等位基因的核苷酸和氨基酸编码序列的特征在于具有多态性，这将所述非功能性等位基因与功能性等位基因区分开，所述功能性等位基因即本发明的核酸分子，其修饰了在表达该多肽的植物中rz2介导的对bnyvv的抗性。原则上，本发明的非功能性基因的序列和相应的多肽分别基于如上所述的本发明的核酸分子的序列，但是包括上文已定义的导致非功能性变体的一个或多个突变。当然，导致非功能性变体的突变存在很多可能性，并且本领域技术人员一定知道如何引入单个突变以及如何分别检测所产生的基因和多肽是否确实无活性。关于合适方法的细节在本文其它地方有描述。
在优选的实施例中，本发明的非功能性核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有根据seqidno.4的氨基酸序列的多肽，或编码具有与seqidno.4具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少99％或100％相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽包含具有至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，所述氨基酸取代是由于核苷酸序列中的一个或多个突变所致，优选地，其中参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)、第72位的脯氨酸(p)和/或第186位的缬氨酸(v)被另一个氨基酸取代。当然，氨基酸序列可在所示位置具有1、2或3个氨基酸取代。因此，在一个实施例中，参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)、第72位的脯氨酸(p)和/或第186位的缬氨酸(v)被另一个氨基酸取代。在另一个实施例中，参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)和第72位的脯氨酸(p)被另一个氨基酸取代；或参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)和第186位的缬氨酸(v)被另一个氨基酸取代；或参照seqidno.45，第72位的脯氨酸(p)和第186位的缬氨酸(v)被另一个氨基酸取代。或者，参照seqidno.45，第25位的脯氨酸(p)、第72位的脯氨酸(p)和第186位的缬氨酸(v)被另一个氨基酸取代。
在优选的实施例中，本发明的非功能性remorin多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列参照seqidno.45，第25位用丙氨酸(a)代替脯氨酸(p)，参照seqidno.45，第72位用苏氨酸(t)代替脯氨酸(p)，和/或参照seqidno.45，第186位用异亮氨酸(i)代替缬氨酸(v)。当然，如上所述，氨基酸序列可在所示位置具有1个、2个或全部3个氨基酸取代。
针对编码dna序列，在优选的实施例中，本发明的非功能性remorin基因包含核苷酸序列，所述核苷酸序列：包含根据seqidno.3的编码dna序列；包含与根据seqidno.3的dna序列具有至少70％相同性的编码dna序列；或在严格条件下与seqidno.3的互补序列杂交，其中所述核苷酸序列包含至少一个核酸取代，所述核酸取代由于导致氨基酸取代的至少一个突变所造成，优选地，其中一个或多个核苷酸参照seqidno.44在第73-75位、第214-216位和/或第556-558位被取代。当然，编码dna序列可在所示的一个、两个或全部三个位置上具有取代的核苷酸。因此，在一个实施例中，参照seqidno.44，第73-75位、第214-216位或第556-558位上的一个或多个核苷酸被取代。在另一个实施例中，参照seqidno.44，第73-75位和第214-216位上的一个或多个核苷酸被取代；或参照seqidno.44，第73-75位和第556-558位上的一个或多个核苷酸被取代；或参照seqidno.44，第214-216位和第556-558位上的一个或多个核苷酸被取代。或者，参照seqidno.44，第73-75位、第214-216位和第556-558位上的一个或多个核苷酸被取代。
在优选的实施例中，参照seqidno.44，编码dna序列第73位的胞嘧啶(c)被鸟嘌呤(g)取代，参照seqidno.44，第214位的胞嘧啶(c)被腺嘌呤(a)取代，和/或参照seqidno.44，第556位的鸟嘌呤(g)被腺嘌呤(a)取代。当然，如上所述，编码dna序列可在所示的一个、两个或全部三个位置上具有取代的核苷酸。
任选地，此外，参照seqidno.44，编码dna序列第72位的鸟嘌呤(g)被腺嘌呤(a)取代，和/或参照seqidno.44，第111位的鸟嘌呤(g)被腺嘌呤(a)取代。
但是，如上所述，关于功能性remorin等位基因，本领域技术人员当然知道可单独或组合引入进一步的取代、缺失、插入、添加和/或任何其它改变，这些改变实际上确实改变了核苷酸序列，但是执行与初始序列相同的功能-这里的初始序列是指编码remorin基因的非功能性变体的核苷酸序列。
根据本发明的核酸分子，包括参与赋予对病原体bnyvv的抗性的核酸分子和干扰所述抗性的相应的非功能性变体，可是单独的核酸分子。优选为dna，特别优选为cdna(编码dna)。功能性remorin蛋白参与对引起植物疾病丛根病的病原体bnyvv赋予抗性，更优选地，其修饰了在表达该蛋白质的植物中rz2介导的对bnyvv的抗性，即其增加了对bnyvv的所述抗性，或者对于建立所述抗性至关重要。非功能性morin蛋白会干扰所述抗性。此外，尤其是在甜菜属植物中，所述多肽分别参与对这种病原体赋予抗性以及干扰所述抗性。所述植物优选是甜菜物种的植物-特别优选地是亚种betavulgarissubsp.vulgaris的植物；其中有例如品种甜菜、甜菜根、饲料甜菜、叶用甜菜和瑞士叶用甜菜。
除非另有说明，否则如果涉及本发明的核酸分子或多肽，则分别包括参与rz2介导的对bnyvv的抗性的核酸分子和多肽(即功能性remorin基因和功能性remorin多肽/蛋白质)，以及干扰rz2介导的对bnyvv的抗性的核酸分子和多肽(即非功能性remorin基因和非功能性remorin多肽/蛋白质)。
修饰rz2介导的抗性或编码能够修饰rz2介导的抗性的多肽的这种基因从现有技术中尚不可知。如上所述，在市场上先前可用的品种中，已观察到某些遗传背景导致对bnyvv的抗性减弱或丧失，尽管相应的植物中存在rz2的抗性等位基因。随着鉴定出负责这一效果的基因(即remorin基因的非功能性变体，其允许生成合适的标记)，由于其独特的单倍型，现在可诊断这种非功能性remorin等位基因。此外，对rz2基因和remorin基因的遗传和物理位置的确切了解允许首次鉴定出这两个基因之间的重组体，并因此可将非功能性remorin基因与rz2抗性等位基因分离。在带有位于remorin和rz2之上的标记或两者之间的标记的新杂交中，可选择显示杂交伴侣的功能性等位基因的重组子。此外，鉴定功能性remorin等位基因允许将该基因掺入植物中，所述植物例如具有rz2抗性基因但由于存在remorin的非功能性变体而不再对bnyvv具有抗性的高产量品种。
因此，通过在所述植物中掺入本发明的核酸分子，即功能性remorin基因，任选地结合去除非功能性remorin基因，例如通过完全抑制非功能性remorin基因的表达，或通过突变非功能性remorin基因以建立功能性变体来去除，现在可非常迅速地开发出对bnyvv产生恢复的抗性的高产量品种。因此，在本发明的框架中，首次提供了具有由rz2基因和根据本发明的功能性remorin基因介导的对bnyvv的抗性的甜菜植物、叶用甜菜植物(chardplant)、红甜菜或甜菜根植物、饲料甜菜植物，且上述植物因此包含在本发明中。由于列出的植物都是栽培植物，因此适合于农业栽培并且具有本发明抗性的农作物或植物是本发明的一部分。特别地，如下此类作物是本发明的一部分：其包含可用作糖的制品、原料或工业来源的地下储藏器官，并且包含根据本发明的抗性，构成本发明的另一方面。储存器官可是例如糖用甜菜的含糖甜菜体，红甜菜的可食用甜菜体或饲料甜菜的可喂食甜菜体。地下储藏器官的总和可能高达50％以上，而对于甜菜而言其总和甚至超过成年植物总质量的70％。此外，这些植物的种子或播种材料也是本发明的一部分。种子或播种材料可按如下所述进行技术处理。
此外，本发明涉及重组和/或异源dna分子，其包含根据本发明的核酸分子的序列，分别是参与rz2介导的对bnyvv的抗性的核酸分子和干扰所述抗性的核酸分子。此外，该dna分子优选具有调控序列。因此，它可与该调控序列可操作地连接或受到该调控序列的影响。调控序列优选是启动子序列和/或转录或翻译控制元件的其他序列，例如顺式元件。控制包括本发明的核酸分子的基因的表达的调控序列，优选是而能够赋予或调节由于病原体感染造成的表达的序列。该启动子优选地能够控制特别是在植物根中的dna序列的表达。调控序列可与表达序列异源。这种方法的优点在于，本领域技术人员因为选择了最适合各自使用情形的调控序列，因此可更好地调节表达序列的表达率、表达发生的组织以及表达发生的时间点。异源dna序列优选包括编码植物病原体防御的组分的核苷酸序列(例如：抗性基因(r-基因)或编码参与信号传递的酶的基因，例如激酶或磷酸酶，对于g-蛋白，或编码致病性效应子(称为无毒基因(avr)))。异源dna序列可是根据本发明的dna序列中之一。异源dna序列还可另外编码植物病原体防御的其他组分。因此，可设计异源dna序列，使得在其转录后产生多顺反子mrna。
本发明还涉及可由根据本发明的核酸分子编码的多肽及其功能性和/或免疫活性片段，以及与该多肽或其片段特异性结合的抗体。所述多肽特别优选地具有根据seqidno.4、8、12、16和20中任一个的氨基酸序列。蛋白质、多肽和片段的重组生产是本领域技术人员所熟悉的(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001,或wingfield,p.t.,2008,productionofrecombinantproteins,currentprotocolsinproteinscience,52:5.0:5.0.1–5.0.4)。根据本发明的蛋白质的多克隆或单克隆抗体可由本领域技术人员根据已知方法产生(例如harlow等人编辑，antibodies:alaboratorymanual(1988))。产生单克隆抗体以及同样可用于蛋白检测方法的fabf(ab')2可通过各种常规方法进行(goding，monoclonalantibodies:principlesandpractice，第98-118页，newyork：academicpress(1983))。然后，抗体可用于筛选表达cdna文库，以便通过免疫学筛选鉴定相同、同源或异源的基因(sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,1989，或ausubel等人,1994,“currentprotocolsinmolecularbiology.”johnwiley&sons)，或可用于蛋白质印迹分析。
特别地，本发明涉及抗体，所述抗体选择性地检出由参与rz2介导的对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子(即功能性remorin等位基因)编码的多肽，并且基本上不检出由干扰所述抗性的本发明的核酸分子(非功能性remorin等位基因)编码的多肽。具体而言，它们检测到的由相应的非功能性remorin等位基因编码的多肽比由功能性remorin等位基因编码的多肽少2倍、优选少5倍、更优选少10倍或更多倍。在另一实施例中，本发明涉及抗体，所述抗体选择性地检出由干扰rz2介导的对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子(即非功能性remorin等位基因)编码的多肽，并且基本上不检出由参与所述抗性的本发明的核酸分子(即功能性remorin等位基因)编码的多肽。具体而言，它们检测到的由相应的功能性remorin等位基因编码的多肽比由非功能性remorin等位基因编码的多肽少2倍、优选少5倍、更优选少10倍或更多倍。
在优选的实施例中，根据本发明的抗体的特征在于它是在自然界中不存在的合成多肽。
此外，根据本发明的抗体可与荧光染料连接，以便可用于例如免疫组织化学方法中，并引起抗体染色。荧光染料可是荧光色素。根据本发明的抗体也可与其他信号分子连接存在。其中包括例如生物素、放射性同位素、报告酶(例如碱性磷酸酶)或寡核苷酸。
本发明的另一主题是载体或表达盒，其包括根据本发明的核酸分子或重组dna分子-这些分子可能在调控元件的控制下，并且尤其在植物中的功能性调控元件的控制下，所述载体或表达盒还包括阴性和/或阳性选择标记。因此，载体主链与根据本发明的核酸分子是异源的，这意味着此类载体在自然界中不存在，并且不能从自然界中分离出来。载体是质粒、粘粒、噬菌体或表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体；它可是双链或单链，线性或环状；或者它可通过整合到其基因组中或在染色体外转化原核或真核生物体。在表达载体或表达盒中的根据本发明的核酸分子或dna分子优选地与一种或多种调控节序列可操作地连接，所述调控序列允许在原核或真核细胞中转录和任选地表达；(sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第三版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001)。这些调控序列优选是启动子或终止子，特别是转录起始起点、核糖体结合位置、rna加工信号、转录终止位置和/或聚腺苷酸化信号。例如，核酸分子在这里处于适合的启动子和/或终止子的控制之下。适合的启动子可是组成型启动子(例如：来自花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus)的35s启动子(odell等人，nature313(1985)，810-812)；病原诱导的那些启动子尤其适合(例如：来自欧芹的pr1启动子(rushton等人，emboj.15(1996)，5,690-5,700))。特别适合的病原诱导型启动子是自然界不存在的合成或嵌合启动子，其由多种元件组成，并含有最小启动子，并且在最小启动子上游具有至少一个顺式调控元件，其中至少一个顺式调控元件用作特殊转录因子的结合位置。嵌合启动子根据需求设计，并通过不同的因子加以诱导或抑制。这种启动子的实例存在于wo00/29592、wo2007/147395和wo2013/091612中。例如，适合的终止子是是nos终止子(depicker等人，j.mol.j.mol.appl.genet.1(1982),561-573)。适合的启动子和终止子也可是天然启动子和天然终止子。载体或表达盒另外包含常规指示/报告基因或抗性基因，以用于检测所需载体或dna分子/核酸分子的转移，以及用于选择包含载体或dna分子/核酸分子的个体，因为通过基因表达进行直接检测多半相当困难。
指示/报告基因的实例例如为荧光素酶基因和编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。此外，这些指示/报告基因还允许测试基因启动子的活性和/或调控。抗性基因-特别是用于植物转化-的实例是新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因，或编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因。另外的阳性选择标记可是酶，其相对于未转化植物提供转化植物选择的优势-特别是营养优势，例如甘露糖-6-磷酸异构酶或木糖异构酶。然而，这并不排除本领域技术人员已知的其它的指示/报告基因或抗性基因。在优选的实施例中，载体是植物载体。此外，表达盒可整合到植物基因组中的形式存在。
另一方面，本发明涉及包括根据本发明的载体、重组dna分子和/或核酸分子的细胞。本发明意义上的细胞可是原核细胞(例如，细菌)或真核细胞(例如，植物细胞或酵母细胞)。所述细胞优选为农杆菌，例如根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)或发根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)、大肠杆菌(escherichiacoli)细胞或植物细胞；所述植物细胞特别优选为甜菜属植物、甜菜物种或甜菜亚种(betavulgarissubsp.vulgaris)的细胞。细胞也可作为培养物存在。因此，本发明还包括了含有这种细胞的细胞培养物。所述细胞培养物优选是纯培养物或不含其它类型细胞的分离物。
本领域技术人员已知的是多种方法，例如缀合或电穿孔，利用这些方法，他可将根据本发明的核酸分子、重组dna分子和/或本发明的载体或表达盒引入农杆菌中，以及诸如各种转化方法的方法(生物转化、农杆菌介导的转化)，利用这些转化方法，他可将根据本发明的核酸分子、dna分子和/或本发明的载体引入植物细胞中(sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001)。
此外，本发明涉及一种植物-优选地，甜菜亚种(betavulgarissubsp.vulgaris)或其部分-其包含参与对bnyvv的抗性的根据本发明的核酸分子，即功能性remorin基因。本发明的核酸分子可引入或渗入植物的基因组中。在一个实施例中，本发明的核酸分子对植物而言是外来的，即，它是异源核酸分子。
因此，本发明的植物可包含作为转基因或内源基因的本发明的核酸分子，或者可包含作为转基因的包含所述核酸分子的本发明的载体或表达盒。此外，本发明的植物可包含分别携带本发明的载体和本发明的核酸分子的本发明的细胞。在优选的实施例中，本发明的植物对于本发明的核酸分子而言是杂合的或优选纯合的。
在一个实施例中，本发明的植物进一步内源地或转基因地包含介导对bnyvv抗性的rz2抗性基因。因此，在本发明的框架中，首次提供了具有由rz2基因和根据本发明的功能性remorin基因介导的对bnyvv的抗性的甜菜植物、叶用甜菜植物(chardplant)、红甜菜或甜菜根植物、饲料甜菜植物。
因此，本发明的植物的一部分可是细胞、组织、器官或多个细胞、组织或器官的组合。多个器官的组合例如为花或种子。与确实包含rz2基因但不包含根据本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)，和/或确实包含干扰rz2介导的对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子(remorin的非功能性变体)的相应植物(对照植物)相比，包含rz2基因和功能性remorin基因的本发明植物显示对bnyvv具有更高的抗性。理想地是，对照植物具有与转基因植物相同的基因型，并且已在相同的条件下培养，但是不包含参与rz2介导的对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子和/或确实包含干扰rz2介导的对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子。
包含根据本发明的核酸分子的本发明的植物细胞或植物或其部分-特别是甜菜属植物，与不包含根据本发明的核酸分子或包含干扰rz2介导的bnyvv抗性的本发明的核酸分子的相应的植物细胞或植物或其部分相比，优选显示对病原体特别是对bnyvv具有较高的抗性。
在转基因植物细胞或植物或其部分的情况下，其包含根据本发明的核酸分子或dna分子(即功能性remorin基因)作为转基因或本发明的载体或表达盒。这种转基因植物细胞或植物或其部分例如是优选用所述核酸分子、dna分子或用相应的载体或表达盒稳定转化的。在优选的实施例中，核酸分子与一种或多种调控序列可操作地连接，所述调控序列允许在植物细胞中转录和任选地表达。那么，由所述核酸分子和调控序列组成的总结构代表转基因。此类调控序列例如是启动子或终止子。本领域技术人员已知适用于植物的许多功能性启动子和终止子。
本发明还包括根据本发明的细胞的液泡，以及存储在其中的内容物。
此外，本发明还涉及来自细胞的细胞提取物，细胞优选植物细胞，尤其优选甜菜细胞，并且特别优选来自以下作物之一的细胞：糖用甜菜、叶用甜菜(chard)或甜菜根。从细胞提取物不能再生任何植物。
同样地，本发明包括含有根据本发明的核酸的植物基因组，即功能性remorin基因。从细胞基因组不能再生任何植物。本发明还包括细胞提取物用于生产糖(蔗糖)或用于生产果汁-优选甜菜根汁的用途。同样地，本发明包括糖-特别是蔗糖-其包含在根据本发明的细胞中或细胞的液泡中。
本发明的另一个方面是原种，其包含含有根据本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)的种子。所述核酸分子可是转基因或内源性存在的。原种和种子可经过技术处理。因此，本发明还包含技术处理过的原种和技术处理过的种子。以下详细说明了技术处理过的原种的各种实施例，其中术语原种也包括种子。技术处理过的原种可抛光的形式存在。种子的最外层因此被去除，使得种子呈现更圆的形式。这在播种中很有帮助，在播种时，最佳的均匀形状导致原种颗粒的均匀分布。经过技术处理的原种还包括粒化的原种。藉此将原种埋入粒化物质(pelletingmass)中，以保护其中所含的原种并导致更大的质量，从而使粒化的原种对风漂移表现出更大的抵抗能力，因此不易被风吹跑，同时可在播种过程中实现更精确的定位。在本发明的优选实施例中，指定出售的批次或单位的所有丸粒化原种谷粒具有基本相同的形状和相同的质量。直径和质量的偏差可为5％。然而，偏差优选不超过1％。作为主要组分之一，丸粒化团块可包含例如矿物化合物，诸如粘土、膨润土、高岭土、腐殖质和/或泥炭。可添加像聚丙烯酰胺此类粘合剂材料。在us4,067,141中引用了其他可能的组分。此外，丸粒化团块可包含在实践中对栽培产生积极影响的其它化学试剂。这些可能是计入施肥剂的物质。其中包括富含以下一种或多种元素的化合物：氮、磷和钾(大量营养素)。因此，施肥成分可包含例如硝态氮、铵态氮、硝酸镁、硝酸铵钙、磷酸一铵、磷酸一钾和硝酸钾。此外，丸粒化团块可能含有杀菌剂，杀虫剂和/或拒食剂。杀菌剂可是福美双(thiram)和/或恶霉灵(hymexazol)和/或其它杀菌剂。杀虫剂可能是新烟碱类物质。新烟碱类的物质优选为吡虫啉(atc代码：qp53ax17)和/或噻虫胺(cas号：210880-92-5)。此外，杀虫剂还可是氟氯氰菊酯(cas号：68359-37-5)、高效氟氯氰菊酯或七氟菊酯。值得一提的是，包含在拌种剂或粒化物质中的化合物被植物吸取并显示出全身作用，从而对整株植物提供适当的保护。因此，由包含一种或多种杀虫剂的粒化种子产生的植物与天然植物不同，并且在生物胁迫条件下显示出更好的性能。在这一背景下，本发明还包括根据本发明的粒化物质和种子的混合物。此外，本发明还包括用于生产根据本发明的粒化种子的方法，其包括以下步骤：
a)提供包含根据本发明的核酸的糖用甜菜植物种子，所述核酸即功能性remorin基因，
b)将所述糖用甜菜植物种子埋入粒化物质中，以及
c)使粒化物质干燥，其中所述种子可任选地是经预备的(primed)或预发芽的种子，或者可允许所述种子在步骤b)期间预备。
粒化原种是经拌种的原种的特定实施例。在这一背景下，经过技术处理的原种也包括经拌种的原种。然而，本发明不限于粒化原种，而是可任何形式的经拌种的原种施用。因此，本发明还涉及经拌种的原种，其包括粒化原种，但并不限于此。因此，还包括干拌种、湿拌种和悬浮拌种。因此，所述拌种剂还可包含至少一种染料(染色)，使得所述经拌种的原种可与未经拌种的原种快速区分开，而且确保在播种后在环境中有良好的可见度。拌种剂还可包含在粒化物质的上下文中描述的那些农用化学品。因此，本发明包括这样经拌种的原种，藉此所述拌种含有至少一种抗食剂，例如杀虫剂和/或至少一种杀真菌剂。任选地，可采用所谓的电拌种(通过施加电能进行拌种)。但是，电拌种并不是严格意义上的拌种。
经过技术处理的原种的另一种形式是包壳原种。在这种情况下，也提出了所谓的包衣以及用包衣处理的原种。与丸粒化原种的区别在于，籽粒保持其原始形状，其中该方法特别经济。例如，该方法描述于ep0334258a1中。经过技术处理的原种的另一种形式是发芽或经预备的原种。发芽原种通过催芽进行预处理，而经预备的原种已通过预备(“萌芽”)进行预处理。催芽和经预备的原种优势在于出苗时间短。同时，播种后出苗的时间点更加同步。这使得在栽培过程中，尤其是在收获过程中，能够更好地进行农业技术加工，此外，还增加了产量。催芽时，原种发芽直到胚根离开原种外壳，随后停止该过程。在引发时，在胚根离开原种外壳之前停止该过程。与催芽的原种相比，已过引发的原种对再干燥的压力不敏感，并且在再干燥之后，与催芽的原种相比，其存储寿命更长，催芽的原种通常不建议再干燥。在这种情况下，经过技术预处理的原种还包括引发的和再干燥的原种。催芽的过程在us4,905,411a中进行了说明。在ep0686340a1中说明了引发的各种实施例。除此之外，还可在一个过程中同时进行粒化和预备原种。该方法描述于ep2002702b1中。本发明包括此外进行粒化的经预备的原种。
经技术处理的原种可另外提供一种或多种上述除草剂抗性。这允许进一步改善农业技术栽培，因为经过技术处理的原种可部署在以前用除草剂处理过而因此无杂草的田地上。
除此之外，本发明还包括含有根据本发明的原种或根据本发明的种子和如上定义的拌种的混合物。因此，拌种团块优选实施为如上所述的丸粒化团块。
对于根据本发明的原种的储存，优选选择不会对原种的稳定性或储存寿命产生负面影响的储存条件。湿度的波动在这里尤其会产生不利影响。本发明的一部分是一种通过同时防水和透气的袋子或容器将原种储存在其中的方法。这种袋子或容器可设计为纸盒或包装。这种纸盒或包装可任选地具有内部水气阻挡层。如果将纸盒或包装设计为双层纸箱，则其稳定性会增加。包含根据本发明的原种或根据本发明的技术处理过的原种的容器、袋、纸盒或包装同样是本发明的一部分。同样，将根据本发明的原种或根据本发明的技术处理过的原种储存在此类袋、容器、包装或纸盒中也是本发明的一部分。
在一个实施例中，根据本发明的植物是杂交植物或双单倍体植物。杂交植物和双单倍体植物不会在自然界出现，也无法从自然界中分离。在根据本发明的植物的另一个实施例中，参与rz2介导的对bnyvv的抗性的根据本发明的核酸分子以杂合形式存在，或更优选以纯合形式存在。本发明还包括含有所述核酸分子或相应多肽的杂交种子和双单倍体种子。
本发明的另一个实施例包含一种植物，优选地是甜菜物种，其特征在于该植物中对bnyvv的抗性进一步增加。例如，这可通过“基因叠加”来实现，即使用这种剂量效应来增加抗性。为此，含有赋予bnyvv抗性的rz2基因和参与rz2介导的抗性的本发明的核酸分子的根据本发明的植物用至少后一种或提及的两种基因过度转化，以增加植物中基因的转录量。在包含rz2抗性基因的甜菜属植物中赋予、恢复或增加对bnyvv的抗性的其它可行的方法如下所述。
本发明的另一个实施例涉及糖用甜菜植物或其部分或这种植物的粒化种子，所述植物在抽苔之前是可收获的，因为在第一个10、11、12、13、14或15个月期间没有甜菜植物没有发生抽苔，甜菜体的发育在此期间完成。
在本发明的一个实施例中，糖用甜菜植物或其部分或这种植物的粒化种子具有基因组，其允许甜菜体发育成其质量总和达到成熟植物的总质量的至少50％、60％、70％、80％或甚至90％。
在本发明的另一个实施例中，甜菜植物或其部分或这种植物的粒化种子具有基因组，其允许甜菜体通过光合作用发育成具有最小质量为200g、250g、300g、350g、400g、450g或500g，以及具有最大质量为1000g、1100g、1200g、1300g、1400g、1500g、1600g、1700g、1800g、1900g或甚至2000g。
本发明的另一个实施例涉及糖用甜菜植物或其部分或这种植物的粒化种子，其中糖用甜菜植物的基因组允许甜菜体发育成具有至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或甚至20％的蔗糖浓度。
本发明进一步包括在内源性或转基因地包含介导bnyvv抗性的rz2抗性基因的甜菜物种植物中，赋予、恢复或增加对bnyvv的抗性的方法。以下列出了赋予、恢复或增加所述抗性的可行的方法，但不限于这些方法。
赋予、增加和/或恢复对bnyvv的抗性可通过将根据本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)整合到甜菜物种植物的至少一个细胞的基因组中进行，而且可从该植物细胞中再生植物。可通过有性杂交(例如，使内源地或转基因地包含介导bnyvv抗性的rz2抗性基因的甜菜物种植物与包含本发明的功能性remorin基因的植物杂交，后者任选地结合rz2抗性基因)，随后进行选择来进行整合，和通过同源定向修复或同源重组的方式来进行整合。所述的后两种方法优选地通过定点核酸酶支持，所述定点核酸酶可选自但不限于以下：crispr核酸酶(包括cas9、casx、casy或cpf1核酸酶)、tale核酸酶、锌指核酸酶、大范围核酸酶、argonaut核酸酶、限制性内切酶(包括foki或其变体、重组酶或两个位点特异性的切刻内切酶)。
赋予、增加和/或恢复对bnyvv的抗性的另一种方式可通过用根据本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)、相应的重组dna分子，或用本发明的载体或表达盒转化植物细胞来实现，并从所转化的植物细胞中再生转基因植物。
通常，可通过修饰功能性remorin基因和/或其天然启动子的核酸序列，来增加由修饰rz2介导的对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)编码的多肽的活性和/或稳定性以及相应核酸分子的表达。
导致所述修饰的突变可在生物体本身内进行，或者可在分离状态下化学修饰相应的核酸以实现所需的效果。后一种方法的优点是可更精确地编辑化合物。
产生包含根据上述给定的实施例[1]或[2]的核酸分子的突变形式和/或天然启动子的突变形式的生物体的方法包括以下步骤：
(i)提供包含核酸分子和/或启动子的生物体或细胞；
(ii)增加生物体或细胞的突变率或
生物体或细胞的诱变；
(iii)表型选择生物体，所述生物体由于突变而表现出对bnyvv的改变的抗性或改变的抗性水平，或基因型选择生物体或细胞，所述生物体或细胞包含核酸分子和/或启动子中的突变，其中，所述突变是通过步骤(ii)产生的；
以及，任选地
(iv)从通过步骤(iii)获得的细胞再生生物体。
生物体可是植物。优选地，所述植物是甜菜。但是，也可使用单细胞生物如细菌。这种细菌可是大肠杆菌。如果生物体是植物，则该方法可在体内和体外应用。如果生物体是植物并且该方法在体外应用，则可建立植物的细胞培养物，并且可在细胞培养物中提高突变率或诱变。提高突变率包括例如使用诱变剂，例如5-溴尿嘧啶或甲基磺酸乙酯(ems)，或使用物理诱变剂，例如电离辐射或紫外线。诱变还包括靶向诱变。可通过如基因编辑的精确的方法来实现靶向诱变(如下文进一步解释)。在细胞生物学的各种标准参考文献中解释了从细胞中再生生物体。例如在标准参考文献“plantbiotechnology:comprehensivebiotechnology,第二增刊”(michaelw.fowler,grahamwarren,murraymoo-young–pergamonpress-1992)中对植物的再生进行了说明。在lindsey&gallois(1990)中描述了从细胞培养物再生甜菜。
这些参考文献还描述了如何建立植物细胞培养物。核酸分子和启动子各自的突变形式优选地由于本发明的核酸分子的表达率(即由于突变功能性remorin基因而增加)而自我表现。这种效应也可依赖于几个突变的存在。例如，可在启动子或核酸分子中引入两个、三个、四个、五个或更多个突变。
通过引入突变，可在细胞中构建赋予更多抗性的蛋白质或蛋白质具有更好的效果。因此，与包含根据本发明的未改变的核酸分子(即功能性remorin基因)的对照植物相比，抗性可增加例如至少1％、2％、3％、4％、5％或更多。可如下文进一步所述测量这一增长。此外，由于一个或多个突变引起的抗性可增加至少一个评级分数。评级分数的确定在本文的其他地方进行了说明。此外，修饰rz2介导的抗性的蛋白质可-由于突变-而赋予改变的作用，并且在某些情况下可对本身已适应初始抗性机制的此类病原体表现出作用。在这种情况下，本发明还包括根据本发明的核酸的这种突变体和根据本发明的蛋白质的突变体。优选地，本发明包括此类变体，其在自然界中不存在并且不能从自然界中分离，以确保病原体没有机会使其自身适应此类变体。上述用于产生包含核酸分子的突变形式的生物体的方法还可包括另外的步骤，其中鉴定那些由于一个或多个突变而具有进一步增加的抗性的那些生物体或各自的植物。如果抗性已增加，则可通过本文所述的评级分数或测量抗性水平来确定。
如前所述，除了上述用于产生包含核酸分子或启动子的突变形式的生物体的方法之外，还可在分离状态下化学修饰相应的核酸，以实现所需的效果。为此，提供以下方法：
产生根据上述给定的实施例[1]或[2]的化学修饰的核酸分子和/或化学修饰的启动子包括以下步骤：
(i)以分离形式提供上述核酸分子；
(ii)通过以下步骤之一对核酸分子或启动子进行化学修饰：
(iia)诱变，
(iib)基因编辑，
(iic)分别限制和连接，插入或缺失。
此外，在等位基因变体的情况下，可通过如本文其它地方所述的方法产生化学修饰。在步骤(ii)中给出的基因编辑等于术语“基因组编辑”。任选地，所述化学修饰的核酸分子或所述化学修饰的启动子可随后引入细胞中或进行稳定地整合。在这种细胞的帮助下，化学修饰的核酸分子和修饰的启动子可在细胞增殖的背景下繁殖。随后可将它们大量分离，并可进行表达分析。当化学修饰涉及启动子时，表达分析特别适合。可收获细胞并分离化学修饰的抗性蛋白以进行化学分析。如果包含化学修饰的核酸分子或修饰的启动子的细胞是植物细胞，则可从该细胞中再生出完整的植物。在本段中描述的方法可在上面给出的用于产生核酸分子的修饰形式和/或修饰的启动子的方法之后进行，并且所获得的变体也是本发明的一部分。此外，包含化学修饰的核酸分子或修饰的启动子的植物也是本发明的一部分。因此，本发明还涉及通过该方法获得的植物。此外，本发明还涉及通过该方法获得的化学修饰的核酸分子和所编码的多肽。这些化合物可是原始(未修饰的)化合物的优化版本，其中所获得的抗性水平(如上文进一步解释的)可增加至少1％、2％、3％、4％、5％或更多百分比，或者可增加至少一个评级分数。在这方面，用于产生化学修饰的核酸分子的方法也是用于优化核酸分子的方法。优化的方法还可包含另外的步骤，其中鉴定核酸分子的那些修饰的变体，与未修改的变体相比，修饰的变体导致植物中的抗性增加。
在一个实施例中，增加对bnyvv的所述抗性可通过增加本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)的表达来进行，所述核酸分子在植物中修饰rz2介导的对bnyvv的抗性。这可通过修饰天然启动子进行，其中所述修饰优选通过基因编辑或定点诱变(其通过定点核酸酶介导)和任选的修复模型进行。上文已列举这种核酸酶的例子。使核酸分子与异源启动子融合可同样提高根据本发明的核酸分子的表达，所述异源启动子相较于天然启动子特别是在感染bnyvv后表现出更高的活性。融合同样可通过定点核酸酶和修复模型进行，也可通过在双链断裂后直接插入进行。
如上所述，增加bnyvv抗性的方法也可通过增加根据本发明的多肽的活性和/或稳定性来进行，可通过修饰根据本发明的核酸分子的核苷酸序列来进行，并且可通过本领域技术人员已知的技术进行。下面将详细说明这种方法。
所有提到的涉及将本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)引入目标植物的基因组中或通过修饰所述核酸分子以增加其表达和相应蛋白质的稳定性/活性的方法，可任选地与抑制非功能性remorin等位基因的表达相结合进行。
或者，赋予、恢复或增加对bnyvv抗性的方法可通过诱变包含干扰bnyvv抗性的本发明的核酸分子(即非功能性remorin等位基因)的植物或植物细胞、并筛选和任选地选择植物或植物细胞来进行，在所述植物或植物细胞中，由功能性remorin等位基因编码的多肽的功能性等位基因已恢复和/或非功能性多肽的表达已废除。这可通过非功能性remorin基因的核酸序列的随机或定向诱变来进行。表1和表2中呈现了区分敏感等位基因与抗性等位基因的多态性示例。
例如，非功能性等位基因可通过基因突变来修饰，所述基因突变通过tale核酸酶(talen)或锌指核酸酶(zfn)以及crispr/cas系统进行，crispr/cas系统在wo2014/144155a1(使用crispr/cas系统工程化植物基因组(engineeringplantgenomesusingcrispr/cassystems))和osakabe&osakabe，plantcellphysiol.，56(2015)，389-400中以实例的方式进行了描述。这也可通过使用命名为tilling(定向诱导基因组局部突变技术，targetedinducedlocallesionsingenomes)的方法来实现，其中例如在德国专利申请de102013101617中描述了如何在敏感基因中引起点突变，然后选择表现出适合的(赋予抗性的)突变的植物，例如，对黄花叶病毒具有抗性的大麦；参见de102013101617第4、8和12页，第[0014]、[0026]和[0038]段。tilling方法也详细描述于henikoff等人的出版物中(henikoff等人,plantphysiol.135,2004,630–636)。
为能够在预定的靶位点处断裂，用于靶向诱变的酶优选包括结合/识别结构域和切割结构域。能够诱导双链或单链断裂的具体的酶是核酸酶或切口酶(dsbi-双链断裂诱导酶或ssbi-单链断裂诱导酶)及其变体，包括不再包含核酸酶或切口酶功能而作为识别分子与另一种酶组合操作的此类分子。近年来，已开发了许多合适的核酸酶，尤其是定制的核酸内切酶，包括大范围核酸酶、锌指核酸酶、tale核酸酶、例如源自格氏嗜盐碱杆菌(gregoryinatronobacteriumgregoryi)的argonaute核酸酶，以及crispr核酸酶，所述crispr核酸酶包括例如cas9、cpf1、csm1、casx或casy核酸酶作为成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)系统的一部分。因此，在本发明的一个优选方面，基因组工程组件包含dsb或ssb诱导酶或其变体，其选自crispr/cas核酸内切酶，优选crispr/cas9核酸内切酶、crispr/cpf1核酸内切酶或crispr/csm1核酸内切酶、锌指核酸酶(zfn)、归巢核酸内切酶、大范围核酸酶和tal效应物核酸酶。
稀有切割核酸内切酶是dsbi/ssbi酶，其具有优选约14至70个连续核苷酸的识别位点，因此即使在较大的基因组(例如大多数植物基因组)中，其也具有很低的切割频率。归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶，构成了这种稀有切割核酸内切酶的家族。它们可由内含子、独立基因或间插序列编码，并具有惊人的结构和功能特性，使它们与更经典的限制酶(通常源自细菌限制性修饰ii型系统)区分开来。它们的识别位点具有普遍的不对称性，这与大多数限制性内切酶识别位点的特征性二元对称性相反。由内含子或内蛋白编码的几种归巢核酸内切酶已显示可促进其各自的遗传元件归巢到等位基因的无内含子或无内蛋白位点中。通过在无内含子或无内蛋白等位基因中进行位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生重组末端，这些末端参与基因转换过程，该过程复制编码序列并导致在dna水平上插入内含子或间插序列。其他一系列稀有切割大范围核酸酶及其各自的识别位点在wo03/004659(第17至20页)的表i中提供(通过引用方式并入本文中)。
此外，可使用方法来设计定制的稀有切割核酸内切酶，这些酶基本上识别所选择的任何靶核苷酸序列。简而言之，嵌合限制酶可使用设计用于识别特定核苷酸序列的锌指结构域与来自天然限制酶(例如foki)的非特异性dna切割结构域之间的杂交来制备。这些方法已描述于例如下列文献中：wo03/080809、wo94/18313或wo95/09233和isalan等人(2001),arapid,generallyapplicablemethodtoengineerzincfingersillustratedbytargetingthehiv-1promoter.naturebiotechnology,19(7):656；liu等人(1997),designofpolydactylzinc-fingerproteinsforuniqueaddressingwithincomplexgenomes.proceedingsofthenationalacademyofsciences,94(11):5525-5530。
定制的核酸内切酶的另一个实例包括tale核酸酶(talen)，其基于与核酸酶(例如foki或其变体)的催化结构域融合的来自细菌属黄单胞菌(xanthomonas)的转录激活因子样效应蛋白(tale)。这些tale的dna结合特异性由串联排列的34/35个氨基酸重复单元的重复可变的双连残基(rvd)定义，使得一个rvd特异性地识别靶dna中的一个核苷酸。这些重复单元可组装以识别基本上任何的靶序列，并与核酸酶的催化结构域融合，以产生序列特异性核酸内切酶(例如，boch等人，(2009).breakingthecodeofdnabindingspecificityoftal-typeiiieffectors.science,326(5959),1509-1512；moscou&bogdanove(2009).asimpleciphergovernsdnarecognitionbytaleffectors.science,326(5959),1501-1501；以及wo2010/079430、wo2011/072246、wo2011/154393、wo2011/146121、wo2012/001527、wo2012/093833、wo2012/104729、wo2012/138927、wo2012/138939)。wo2012/138927进一步描述了具有各种催化结构域及其组合的单体(致密型)talen和tale。
最近，已描述了一种新型的可定制的核酸内切酶系统；称为crispr/cas系统。在其自然环境中的crispr系统描述了一种分子复合体，其包含至少一种小的单独的非编码rna与cas核酸酶或另一种crispr核酸酶(如cpf1核酸酶或csm1核酸酶)的组合(zetsche等人，“cpf1isasinglerna-guidesendonucleaseofaclass2crispr-cassystem”，cell，163，第1-13页，2015年10月；us2017/0233756a1)，其可产生特定的dna双链断裂。目前，crispr系统分成2类，包含5种类型的crispr系统，例如使用cas9作为效应物的ii型系统和使用cpf1作为效应物分子的v型系统(makarova等人，naturerev.microbiol.，2015)。在人工crispr系统中，合成的非编码rna和crispr核酸酶和/或任选的修饰的crispr核酸酶(其经修饰以充当切口酶或缺乏任何核酸酶功能)，可与结合crrna和/或tracrrna的功能的至少一种合成或人工向导rna或grna组合使用(makarova等人，2015，同上)。在自然系统中由crispr/cas介导的免疫应答应需要crispr-rna(crrna)，其中控制crispr核酸酶特异性激活的这种向导rna的成熟在迄今已表征的各种crispr系统之间差异很大。首先，入侵的dna(也称为间隔区)整合在crispr基因座近端的两个相邻重复区域之间。ii型crispr系统编码cas9核酸酶作为干扰步骤的关键酶，该系统既包含crrna又包含反式激活rna(tracrrna)作为向导基序。这些杂交并形成双链(ds)rna区域，这些区域被rnaseiii识别并可切割以形成成熟的crrna。然后这些又与cas分子结合，以便将核酸酶特异性地引导至靶核酸区域。重组grna分子既可包含可变dna识别区域还可包含cas相互作用区域，因此可独立于特定的靶核酸和所需的cas核酸酶而进行特别的设计。
作为进一步的安全机制，pam(前间区序列邻近基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是直接来自cas9/rna复合体识别的dna的dna序列。来源于化脓性链球菌的cas9的pam序列已被描述为“ngg”或“nag”(标准iupac核苷酸代码)(jinek等人，aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity，science2012,337:816-821)。来源于金黄色葡萄球菌的cas9的pam序列为“nngrrt”或“nngrr(n)”。另外的变体crispr/cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)的cas9在pam序列nnnngatt处切割。嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)的cas9在pam序列nnagaaw处切割。最近，已针对空肠弯曲菌的crispr系统描述了又一pam基序nnnnryac(wo2016/021973a1)。对于cpf1核酸酶，已描述了不含tracrrna的cpf1-crrna复合体有效地识别和切割前置有短的富含t的pam的靶dna，这不同于cas9系统所识别的通常富含g的pam(zetsche等人，同上)。此外，通过使用修饰的crispr多肽，可获得特定的单链断裂。cas切口酶与各种重组grna的组合使用还可通过双dna切口诱导高度特异性的dna双链断裂。此外，通过使用两个rna，可优化dna结合的特异性，并因此优化dna切割。其它的crispr效应子，如最初用于描述细菌的casx和casy效应子，同时是可用的，并代表可用于基因组工程目的另外的效应子(burstein等人，newcrispr-cassystemsfromuncultivatedmicrobes，nature，2017，542，237-241)。
dsbi/ssbi酶的切割位点与dna或rna上诱导断裂的确切位置有关。切割位点可包含或可不包含在dsbi/ssbi酶的识别位点中(与之重叠)，因此据信dsbi/ssbi酶的切割位点位于其识别位点处或附近。dsbi/ssbi酶的识别位点(有时也称为结合位点)是通过dsbi/ssbi酶(特异性)识别的核苷酸序列并确定其结合特异性。例如，talen或znf单体具有分别由其rvd重复或zf重复确定的识别位点，而其切割位点由其核酸酶结构域(例如foki)确定，并且通常在识别位点之外。在为二聚talen或zfn的情况下，切割位点位于各自单体的两个识别/结合位点之间，其中发生切割的该间隔dna或rna区域被称为间隔区。
本领域技术人员能够选择识别特定的识别位点并在预选/预定位点处或其附近的切割位点处诱导dsb或ssb的dsbi/ssbi酶，或者设计此类dsbi/ssbi酶。或者，可使用任何常规的转化方法或通过与基因组中具有dsbi/ssbi酶识别位点的生物体杂交，将dsbi/ssbi酶识别位点引入靶基因组中，然后，可在该dsbi/ssbi酶的切割位点处或附近引入任何所需的核酸。
如本文所用，“双链dna断裂诱导酶”、“诱导双链断裂的酶”或“dsbi酶”是能够在称为“识别位点”或“预定位点”或“预定位置”的特定核苷酸序列处诱导双链dna断裂的酶。相应地，“单链dna断裂诱导酶”、“诱导单链断裂的酶”或“ssbi酶”是能够在称为“识别位点”或“预定位点”或“预定位置”的特定核苷酸序列处诱导单链dna或rna断裂的酶。
如本文中所用，“修复核酸分子”或“修复基质(matrix)”是单链或双链dna分子或rna分子，其用作修饰在预选位点处的基因组dna或rna的模板，所述预选位点在切割位点附近或切割位点处。如本文所用，“用作修饰基因组dna的模板”是指修复核酸分子通过在位于预选位点侧翼的靶基因组中的侧翼区域与相应的同源区域之间的同源重组，任选地与在修复核酸分子的两个末端之一处的非同源末端连接(nhej)结合(例如，在只有一个侧翼区域的情况下)，在预选位点被复制或整合。
如本文所用，“基因组的修饰”是指基因组在至少一个核苷酸中或通过至少一个表观遗传编辑被改变。
如本文所用，“预选位点”、“预定位点”或“预定义位点”表示基因组(例如，细胞核基因组或叶绿体基因组)中的特定核苷酸序列，在该位置处希望插入、替换和/或缺失一个或多个核苷酸。
在各种实施例中，根据本发明的至少一个碱基编辑器暂时或永久地与至少一个位点特异性dsbi/ssbi酶复合体或至少一个修饰的位点特异性dsbi/ssbi酶复合体连接，或任选地与所述至少一个位点特异性dsbi/ssbi酶复合体的组分连接。该连接可是共价的和/或非共价的。本文公开的任何碱基编辑器或位点特异性dsbi/ssbi酶复合体、或其催化活性片段、或碱基编辑器复合体或位点特异性dsbi/ssbi酶复合体的任何组分均可作为核酸片段引入细胞中，所述核酸片段表示或编码dna、rna或蛋白质效应子，或其可作为dna、rna和/或蛋白质或其任何组合引入。
碱基编辑器是具有介导靶向碱基修饰的能力的蛋白质或其片段，即，转变感兴趣的碱基，以获得感兴趣的点突变。优选地，在本发明的背景下，所述至少一种碱基编辑器暂时或永久地与至少一种dsbi/ssbi酶、或任选地与至少一种dsbi/ssbi的组分融合。该融合可是共价的和/或非共价的。多个出版物显示了使用crispr/cas9切口酶或与胞苷脱氨酶结构域连接的非功能性核酸酶(载脂蛋白bmrna编辑催化样多肽(apobec1)，例如源自大鼠的apobec)进行靶向碱基转化，主要是从胞苷(c)转化为胸腺嘧啶(t)。胞嘧啶(c)的脱氨基化由胞苷脱氨酶催化，并产生尿嘧啶(u)，尿嘧啶(u)具有碱基配对胸腺嘧啶(t)的特性。大多数已知的胞苷脱氨酶对rna起作用，并且已知接受dna的少数例子需要单链(ss)dna。对dcas9-靶向dna复合体的研究表明，在形成cas9-向导rna-dna的“r环”复合体时，被移位的dna链的至少9个核苷酸(nt)不成对(jore等人，nat.struct.mol.biol.,18,529-536(2011))。实际上，在cas9r环复合体的结构中，被移位的dna链上的前间隔序列的前11个核苷酸是无序的，这表明它们的运动不受严格限制。还推测，在非模板链中cas9切口酶诱导的胞嘧啶的突变可能是由于细胞的胞嘧啶脱氨酶的可及性引起的。据推测，r环中的ssdna的这一片段的子集可作为dcas9连接的(tethered)胞苷脱氨酶的有效底物，以实现dna中c到u的直接、可编程的转化(komor等人，同上)。最近，goudelli等人在programmablebaseeditingofa·ttog·cingenomicdnawithoutdnacleavage,nature,2017,551(7681),464中描述了介导基因组dna中a·t到g·c的转化的腺嘌呤碱基编辑器(abe)。
这些方法优选地导致抗性提高至少一个评级分数，特别优选地，提高至少两个、三个或更高的评级分数。在诱变植物细胞随后从诱变的植物细胞再生植物后，或在诱变植物后，可鉴定在内源性核酸分子中表现出一种或多种突变的植物，如表1和2所示。在这一背景下，已提及的根据本发明的植物的特征在于抗性提高至少一个评级分数，优选提高至少两个或更高的评级分数。或者，与对照植物相比，根据本发明的植物的抗性可增加例如至少1％、2％、3％、4％、5％或更多，所述对照植物不包含根据本发明的核酸和/或包含其非功能性变体。可通过在一个健康的叶子上接种病原体的分离物并在15天后确定受感染的表面来测量所述增加。受侵染表面减少5％对应于抗性增加5％。可从下面给出的实施例“抗性测试”中得出用于进行测量的其它参数。
替代地，用于生产包含本发明的核酸分子即功能性remorin基因的bnyvv抗性植物的方法，如上所述包括：提供甜菜属植物或供甜菜属植物或甜菜属植物细胞甜菜属植物细胞，其内源性或转基因地包含介导对bnyvv的抗性的rz2抗性基因，用本发明的核酸分子即功能性remorin基因或相应的载体或表达盒转化所述植物细胞，以及从转化的植物细胞再生转基因植物。
在替代性实施例中，用于生产bnyvv抗性植物的方法包括：提供甜菜属植物或甜菜属植物细胞，所述植物或植物细胞内源地或转基因地包含介导对bnyvv抗性的rz2抗性基因，将定点核酸酶或切口酶和任选的修复基质或定点碱基编辑器引入植物的细胞中，其中所述定点核酸酶能够在细胞基因组中，优选在干扰bnyvv抗性的本发明的核酸分子即非功能性remorin中或在所述核酸分子的上游或下游，产生dna的至少一个单链断裂或dna的至少一个双链断裂，且所述修复基质包含根据本发明的参与bnyvv抗性的核酸分子-即功能性remorin基因，或其中所述定点碱基编辑器能够在所提及的位置之一处产生dna的至少一个单链断裂，并且能够转化至少一个核碱基。将优选被转化的核碱基列于上表1中。所述方法还任选地包括在允许在所提及位置修饰基因组的条件下培养所产生的细胞，其中所述修饰可是至少一个核苷酸的置换、缺失和/或插入。修饰可任选地通过同源定向修复或同源重组进行，其中将核酸分子整合到植物的基因组中。但是，用碱基编辑器例如crispr工具也能发生单核苷酸的取代；因此修复基质不是必需的。此外，还包括从修饰的植物细胞再生植物。
生产包含本发明的核酸分子即功能性remorin基因的bnyvv抗性植物的方法也可包括：使内源地或转基因地包含介导bnyvv抗性的rz2抗性基因的甜菜属植物与包含本发明的功能性remorin基因的植物杂交，后者任选地结合rz2抗性基因，并且鉴定和任选地选择内源地或转基因地包含rz2抗性基因和本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)两者的植物，其中rz2抗性基因和/或本发明的所述核酸分子纯合地存在于该植物的基因组中。
本发明同样涉及鉴定并且可能提供包含本发明的核酸分子即功能性remorin基因的甜菜物种植物、其部分或其种子的方法，所述植物能够表现出由rz2基因介导的对bnyvv的抗性，其特征在于，所述方法包括检测在所述植物或其样品、其部分或种子中所述核酸分子或编码的多肽的存在和/或表达的步骤。因此，所述核酸分子的存在和表达分别表明植物能够表现出rz2介导的对bnyvv的抗性。或者，分别不存在和缺乏所述核酸分子的表达，和/或干扰对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子即非功能remorin基因的存在和/或表达，表明该植物不能够表现出rz2介导的对bnyvv的抗性或表现rz2介导的对bnyvv的抗性受损。此外，该方法可包括鉴定和任选地选择包含本发明的核酸分子即功能性remorin基因的甜菜物种的植物、其部分或种子，如果在于植物基因组中，其能够表现出rz2介导的对bnyvv的抗性。
以同样的方式，本发明涉及鉴定和任选地选择包含干扰对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子即非功能remorin基因的甜菜物种植物的方法，其特征在于，所述方法包括检测在所述植物或其样品、其部分或其种子中所述核酸分子或编码的多肽的存在和/或表达的步骤。
根据本发明的核酸分子或根据本发明的多肽的存在和/或表达可通过本领域技术人员已知的标准方法，例如通过pcr、rt-pcr、或蛋白质印迹法来测试。
通过精细作图，已确定了remorin基因在betavulgarissubsp.vulgaris基因组中的位置，并且已鉴定了基因本身和周围的序列区域。具体来说，remorin位于3号染色体长臂上距rz2基因约0.75cm处的位置。这进而代表在靶区域开发dna杂交探针或遗传标记的基础，从而允许区分包含功能性remorin等位基因的植物和包含非功能性remorin等位基因的植物，并允许在可用于鉴定基因之间的重组体的一个或多个共分离区域开发标记，并因此将阻遏等位基因与rz2抗性等位基因分离。彼此相关的两个基因的遗传位置如图7所示。
dna杂交探针可源自remorin基因的序列，并用于筛选所需生物体的基因组和/或cdna库。探针可用于通过已知的聚合酶链式反应(pcr)过程扩增鉴定的同源基因，并检查remorin基因是否内源性地存在于生物体中，或是否已成功地通过异源引入。
本领域技术人员在这里可采取常规的杂交、克隆和测序方法，其例如列在sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001中。本领域技术人员还可合成并使用寡核苷酸引物来扩增remorin基因的序列。为实现特异性杂交，这种探针应该是特异性的，并且具有至少15个核苷酸的长度，优选具有至少20个核苷酸的长度。关于核酸杂交的详细指南可在以下文献中找到：tijssen,laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes,第一部分,第二章,“overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays.”elsevier,newyork(1993)；以及currentprotocolsinmolecularbiology,第二章,ausubel等人编辑,greenepublishingandwileylnterscience,newyork(1995)。
因此，在一个实施例中，本发明涉及寡核苷酸，所述寡核苷酸与参与rz2介导的对bnyvv的抗性的根据本发明的核酸分子的核苷酸序列特异性杂交，或者与干扰对bnyvv的抗性的根据本发明的核酸分子的核苷酸序列特异性杂交，或与和这两个核酸序列都互补的核酸分子的核苷酸序列特异性杂交，寡核苷酸的长度为至少15、16、17、18、19或20、优选至少21、22、23、24或25、特别优选至少30、35、40、45或50且特别优选至少100、200、300、500或1,000个核苷酸。此外，本发明涉及一对核酸分子-优选为寡核苷酸的形式-其适于作为正向和反向引物附着到对所述核酸分子中的一个具有特异性的区域，并且适于在聚合酶链式反应(pcr)中扩增这些核酸分子。
因此，本发明还涉及作为寡核苷酸-特别是引物寡核苷酸的标记。这些标记包含长度至少为15个核苷酸的核酸分子，其与前述定义的核苷酸序列特异性杂交。
具体而言，本发明包括一对核酸分子-优选地为寡核苷酸的形式或包含这对寡核苷酸的试剂盒的形式-其适于作为正向和反向引物与对根据本发明的核酸分子特异性的区域杂交，并且适于在聚合酶链式反应(pcr)中扩增这一区域，或者适合作为正向和反向引物与甜菜基因组中的区域杂交，该区域在甜菜中表现出与根据本发明的参与rz2介导的对bnyvv的抗性的核酸分子即功能性remorin基因共分离，或与干扰对bnyvv的抗性的根据本发明的核酸分子即非功能性remorin基因共分离。可替代地或另外地，所述寡核苷酸或所述寡核苷酸适于与甜菜基因组中的区域杂交，该区域在在甜菜中与功能性remorin基因连同rz2基因一起共分离，或与非功能性remorin基因连同rz2基因一起共分离。
表3：remorin和rz2基因侧翼的标记，如图7所示。
在一个优选的实施例中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸对选自seqidno.24至seqidno.40。具体地，已在remorin和rz2之间鉴定了74个标记，其中三个示例于图7中:s3e5782s01(seqidno：30；非功能性等位基因：t)，s3e4913xxx(seqidno：31；非功能性等位基因：t)和s3e5800s01(seqidno：32；非功能性等位基因：t)。图7还示出了远离remorin且靠近rz2的标记位置，其限定了可用于标记辅助育种(mas)的侧翼区域，目的是引入功能性remorin。这些标记及其各自的遗传和物理位置如表3至表5所示。
表4：位于remorin和rz2基因之间的标记，如图7所示。
表5：位于remorin基因中的标记，如图7所示。
此外，根据本发明的寡核苷酸可与荧光染料连接，以便在例如通过相应波长的光的激发下产生荧光信号。荧光染料可是荧光色素。根据本发明的寡核苷酸可与适于产生信号的其它化合物偶联。这种寡核苷酸在自然界中并不存在，也不能从自然界中分离出来。执行以下操作以产生这样标记的寡核苷酸：dna可进行生物正交标记。为此，可在体内或体外用核苷类似物标记dna，其随后可例如在每个staudinger反应中与荧光团偶联。除此之外，dna还可能通过化学方式提供荧光团。寡核苷酸可用例如用于qpcr、dna测序和原位杂交中的荧光团通过亚磷酰胺合成来标记。此外，dna可在与荧光核苷酸的聚合酶链式反应过程中酶促产生，或者用连接酶或末端脱氧核苷酸转移酶标记。还可通过生物素化和荧光抗生物素蛋白间接检测dna。为偶联，荧光素、荧光镧系元素、金纳米粒子、碳纳米管或量子点等被用作荧光团。最常用的荧光物质之一是fam(羧基荧光素)。因此，本发明包括寡核苷酸以及特别是具有fam标记的引物。fam优选地以6-fam的形式存在，其中，根据发射和激发的期望波长，也可使用其它fam变体，例如5-fam。其他荧光标记的例子是alexafluor、atto、dabcyl、hex、rox、tet、texasred和yakimayellow。根据使用领域的不同，可提供修饰了碱基或糖磷酸骨架的寡核苷酸。其中包括氨基-dt、叠氮-dt、2-氨基嘌呤、5-br-dc、2'-脱氧肌苷(ino)、3'-脱氧-a,c,g、5-met-dc、5-oh-met-dcn6-met-da等。
因此，根据本发明的鉴定方法还包括通过使用检测一种或多种多态性的分子标记，检测功能性remorin基因和非功能性remorin基因之间的至少一种多态性，即检测在参与rz2介导的对bnyvv的抗性的根据本发明的核酸分子的序列与干扰所述抗性的根据本发明的核酸分子的变体的序列之间的至少一种多态性，来检测根据本发明的核酸分子即功能性remorin基因。这些多态性的实例在表1中给出。因此，在本发明的核酸分子的核苷酸序列(即功能性remorin基因)中或在共分离区域中存在至少一个标记位点，表明所述植物能够表现出rz2介导的对bynvv的抗性。或者，在所述核酸分子中不存在标记位点和/或在干扰对bnyvv的抗性的本发明的核酸分子的核苷酸序列-即非功能remorin基因中存在至少一个标记位点，表明该植物不能够表现出rz2介导的对bnyvv的抗性或表现rz2介导的对bnyvv的抗性受损。此外，该方法可包括鉴定和任选地选择包含本发明的核酸分子即功能性remorin基因的甜菜物种的植物、其部分或种子，如果在于植物基因组中，其能够表现出rz2介导的对bnyvv的抗性。
遵循相同的原理，可鉴定包含干扰bnyvv抗性的根据本发明的核酸分子(即非功能性remorin基因)的植物。
在本发明的一个优选实施例中，非功能性remorin变体包含分别如上定义的核酸和氨基酸序列，即具有分别如表1和2所示以及图2和3所示的特定的核酸和氨基酸取代。因此，根据本发明的方法的优选实施例包括使用检测多态性-特别是诊断多态性的分子标记检测图2中呈现的至少一种多态性。该检测优选每个多态性(特别是每个诊断多态性)使用至少一个分子标记进行。本领域技术人员知道应用哪些标记技术来检测相应的多态性，以及为此如何构建分子标记(参见advancesinseedscienceandtechnology，第i卷,vanangamudi等人，2008)。
如上所述，本发明的鉴定方法包括在与本发明的核酸分子共分离的区域中检测至少一个标记位点的步骤。优选地，共分离区域是甜菜中3号染色体上的一个基因组区间，该区间包含可通过以下标记检测到的位于侧翼的标记位点：
(i)标记s3e5985s01(seqidno.33)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e2247xxx(seqidno.40)，
优选：
(i)标记sxh1002s02(seqidno.34)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和sxn1017s02(seqidno.39)，
更优选：
(i)标记sxh2499s01(seqidno.35)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记sxi0698s01(seqidno.36)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(iii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和sxe7357s01(seqidno.38)，和/或
(iv)标记s3p4351s01(seqidno.29)和sxh8485s01(seqidno.37)，和/或
(v)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(vi)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5800s01(seqidno.32)，和/或
(vii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e4913xxx(seqidno.31)，和/或
(viii)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5782s01(seqidno.30)。
标记的位置示于图7中。
用于鉴定包含本发明的核酸分子(即功能性remorin基因，并且其如果存在于植物的基因组中则能够表现出由rz2基因介导的对bnyvv的抗性)的甜菜物种植物的本发明的方法的特征在于：任选地还包括检测植物、其部分或其种子中，rz2基因的存在和/或表达或由rz2基因编码的多肽的存在；和/或检测rz2基因中或与rz2基因共分离的一个或多个区域中、优选与包含本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)和rz2基因的染色体区间共分离的一个或多个区域中的至少一个标记位点。因此，所鉴定的和任选选择的植物、其部分或其种子包含所述核酸分子和rz2基因。
在所述方法的优选实施例中，其中rz2基因的核苷酸序列中的至少一个标记位点可通过标记s3e5853s01(seqidno.26)检测到，并且其中与rz2基因共分离的一个或多个区域是是甜菜中3号染色体上的基因组区间，所述区间包含可通过以下标记检测到的位于侧翼的标记位点：
(i)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和s3e2247xxx(seqidno.40)，
优选：
(i)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxn1017s02(seqidno.39)，
更优选：
(i)标记s3p4351s01(seqidno.29)和s3e5853s01(seqidno.26)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.33)和sxe7357s01(seqidno.38)，和/或
(iii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxh8485s01(seqidno.37)。
在所述方法的另一优选的实施例中，其中与包含本发明的核酸分子(即功能性remorin基因)和rz2基因的染色体区间共分离的一个或多个区域是甜菜中3号染色体上包含的基因组区间，所述区间包含可通过以下标记检测到的位于侧翼的标记位点：
(i)标记s3e5985s01(seqidno.33)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和s3e2247xxx(seqidno.40)，
优选：
(i)标记sxh1002s02(seqidno.34)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxn1017s02(seqidno.39)，
更优选：
(i)标记sxh2499s01(seqidno.35)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(ii)标记sxi0698s01(seqidno.36)和s3p4348s01(seqidno.27)，和/或
(iii)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxe7357s01(seqidno.38)，和/或
(iv)标记s3e5853s01(seqidno.26)和sxh8485s01(seqidno.37)，
本发明的寡核苷酸或寡核苷酸对用来鉴定和/或选择甜菜物种植物，所述甜菜物种植物能够表现由rz2(如果存在于植物的基因组中)介导的对bnyvv的抗性，或其表现由rz2(如果存在于植物的基因组中)介导的对bnyvv的抗性的能力受损。
此外，本发明还涉及一种标记芯片(“dna芯片”或微阵列)，其包含适于检测的根据本发明的至少一种寡核苷酸。该标记芯片适合应用于根据本发明的一种或多种检测方法。
本发明同样包括生产根据本发明的蛋白质的方法。该方法包括提供或培养含有本发明的核酸分子的细胞培养物，本发明的核酸分子分别是功能性和非功能性的remorin基因，以及相应蛋白质的后续表达。
此外，本发明还涉及一种bnyvv抗性植物或其部分，其通过如上所述的方法鉴定，并且如果适用地话则被选定。特别地，本发明涉及包含植物的植物群体，所述植物可根据如上所述的本发明的方法之一获得，并且优选地对丛根病即对bnyvv侵染具有抗性，并且其特征在于存在根据本发明的核酸分子，即功能性remorin基因，所述核酸分子参与赋予rz2介导的针对bnyvv的抗性。该群体优选具有至少10株，优选至少50株，更优选至少100株，特别优选至少500株，并且特别在农业耕作中，优选至少1,000株植物。群体中不携带所述核酸分子、而携带干扰bnyvv抗性(即非功能性remorin)和/或易受bnyvv影响的根据本发明的核酸分子的植物的比例优选低于25％-优选低于20％，更优选地低于15％，甚至更优选地为10％，并且特别地，优选低于5％，如果存在的话。
通过本发明也可实现甜菜属的新的抗性植物品系的育种和培育的以下优点。序列信息以及鉴定出的多态性-所述多态性允许在所公开的基因的功能性和非功能性变体之间，即在参与rz2介导的对bnyvv的抗性的等位基因和干扰所述抗性的等位基因之间作出区分，使得能够在上述基因中以及上游和下游区域直接开发标记，这对于植物育种者而言代表了重要改进-特别是针对没有“连锁累赘”的优化的核心品系的开发而言。此外，关于序列结构的知识可用于鉴定例如同源或直系同源的其它remorin或类remorin基因。
因此，本发明还包括用于鉴定编码多肽或其它蛋白质的其它核酸分子的方法，所述多肽或其它蛋白质参与在表达多肽的植物中rz2介导的对bnyvv的抗性。因此，本领域技术人员可使用数据库，采用合适的搜索简档和计算机程序来筛选同源序列或进行序列比较。此外，通过常规的分子生物学技术，本领域技术人员可自己获得编码remorin蛋白的其它dna序列，并在本发明的范围内使用这些序列。例如，适合的杂交探针可源自根据本发明的核酸序列，并可用于筛选所需生物体的基因组和/或cdna库。本领域技术人员在这里可采取常规的杂交、克隆和测序方法，其例如列在sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual,第三版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001中。使用已知序列，本领域技术人员还可合成和使用寡核苷酸引物来扩增以下核酸分子的序列：参与rz2抗性的核酸分子、编码参与植物中rz2介导的对bnyvv的抗性的多肽或其它蛋白质的核酸分子，或编码其它或新的remorin等位基因的核酸分子。
在一个实施例中，本发明因此还包括用于鉴定编码多肽的核酸分子的方法，所述多肽参与在表达该多肽的甜菜物种植物中赋予对bnyvv的抗性。因此，所述方法包括在甜菜物种的基因型中，将根据本发明的多肽的氨基酸序列与来自序列数据库的氨基酸序列，或与根据本发明的多肽的等位基因变体的序列进行比较。此外，根据本发明的方法包括鉴定与根据本发明的多肽的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列或等位基因变体，以及在包含rz2抗性基因的甜菜物种植物中引入编码所鉴定的氨基酸序列或等位基因变体的核酸分子；在所述植物中表达核酸分子；以及任选地，随后验证对bnyvv的抗性。
如前所述，可通过经典的生物信息学方法(数据库搜索和用于筛选同源序列的计算机程序)来鉴定参与rz2介导的对bnyvv的抗性的其它蛋白质或其编码基因，即与由根据本发明的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列至少70％相同-优选至少80％，特别优选至少90％，特别优选至少95％，或者甚至98％相同的同源物、类似物和直系同源物。
因此，术语同源物意味着有关的基因(来自两种不同的植物物种)具有基本上相同的功能和共同的祖先，因此通常在其核酸或编码的氨基酸序列中显示出显著的相同性。然而，也有许多基因彼此同源，但没有产生有意义的配对比对(pairedalignment)的蛋白质序列。与此相反，术语类似物描述的基因或蛋白质(同样)具有相同或相似的功能，但不是由相同的结构产生的，即没有共同的祖先。在这种情况下，通常在它们的核酸或编码的氨基酸序列中，或者在最佳情况下，在特定的功能结构域中，不能建立显著的相同性。
在基因组测序的背景下，为标注，对同源物进行更精细地分类。为此引入了术语：直系同源和旁系同源。直系同源物是通过物种形成事件连接的基因。旁系同源物是追溯复制事件的基因。
在本发明的意义上，如果基因参与赋予植物中rz2介导的bnyvv抗性，则其基本上是同源物或类似物或直系同源物。为验证这一点，使用前面已描述的并且本领域技术人员已知的方法，例如，将鉴定的同源物或类似物或直系同源物通过pcr扩增，在表达载体中克隆，引入靶植物或植物细胞中，然后检查抗性。
本发明还涉及本发明的核酸分子(即功能性remorin等位基因)在与可能赋予植物农学上有利的特性的其它遗传元件的遗传或分子叠加中的用途。因此，栽培植物的经济价值可显著提高，因为例如与具有相同遗传基因但未提供所述核酸分子或其包含本发明的核酸分子的非功能性变体的植物相比，产量表现增加。具体地，本发明涉及鉴定的remorin基因在甜菜属植物的农业或园艺栽培中控制病原体bnyvv侵染的方法中的用途，包括借助于前述方法之一鉴定和选择甜菜属植物和/或栽培如此选择的植物或其后代。因此，本发明包括一种用于栽培甜菜物种植物的方法，包括在第一步骤中，提供根据本发明的具有bnyvv抗性的甜菜物种植物，或者借助于根据本发明的生产方法生产甜菜物种植物，或者借助于前面描述的根据本发明的鉴定方法鉴定和选择甜菜物种植物，其中，所述提供可包括种植相应的幼苗或播种相应的本发明的种子；以及包括，在第二步骤中，培养来自所述第一步骤的植物，或者部署来自第一步骤的植物的原种，或者养育来自第一步骤的植物。所述栽培方法因此阻碍了bnyvv侵染所栽培的植物。栽培方法可是生产糖的方法的一部分。生产糖的方法包括栽培方法的步骤，此外还包括，收割栽培植物作为倒数第二步骤，以及从上述植物中提取糖作为最后的步骤。
栽培方法可是生产原种的方法的一部分。生产原种的方法包括栽培方法的步骤，此外还包括，春化所栽培的植物作为倒数第二步骤，以及从上述植物中提取种子作为最后的步骤。
提取的种子可任选地粒化，以获得甜菜物种的粒化原种。在这种情况下，这是一种生产丸粒化原种的方法。此外，生产原种的方法可设计成用于生产bnyvv抗性原种的方法。生产bnyvv抗性原种的方法包括上述生产原种的方法的步骤，此外还包括根据本文所述的方法，在所提取的种子的至少一个中，优选在所提取的种子的至少0.1％或至少1％中，验证根据本发明的核酸即功能性remorin基因作为最后的步骤。特别优选实施验证，以使种子保持可萌芽。这意味着从种子中提取验证所需的dna不会中和种子的可萌芽性。在这种情况下，对根据本发明的核酸的验证可在所有提取的种子中以特别大的比例进行。例如，验证可在所有提取的种子的至少2％中-优选地，至少3％中，特别优选地，至少4％中进行。
根据本发明的植物、它们的细胞或根据本发明的种子或原种可具有另外在农艺学上有利的特性，或者提供这些特性。一个例子是对除草剂如草甘膦、草铵膦或als抑制剂的耐受性或抗性。优选对草甘膦或als抑制剂除草剂的耐受性。在us7,335,816b2中公开了草甘膦抗性的具体实施例。这种草甘膦抗性例如可从存储在ncimb，aberdeen(苏格兰，英国)的原种中获得，其登录号为ncimb41158或ncimb41159。可使用此类种子来获得耐草甘膦的糖用甜菜植物。草甘膦抗性也可通过杂交引入到甜菜属的其他物种中。
在wo2012/049268a1文件中公开了als抑制剂除草剂抗性的特定实施例。例如，这种als抑制剂除草剂抗性可从英国ncimb,aberdeen的保藏中获得，登录号为ncimb41705。此外，这种als抑制剂抗性可通过tilling或定点诱变(例如，通过基因编辑)产生，基因编辑例如通过使用crispr/cas、crispr/cpf1、talens或锌指核酸酶进行。本领域技术人员可从现有技术中获知许多其它的除草剂和它们的适用性。他可诉诸于现有技术，以便了解为在植物中实现相应的耐受性，哪些遗传元件将以何种方式使用。
农学上有利的特性的其它实例是其它的病原体抗性，耐冷性或耐冻性以及水的使用效率、氮的使用效率和产量，其中病原体可是其它昆虫、病毒、线虫、细菌或真菌。这里，本领域技术人员还可诉诸于现有技术来寻找合适的遗传元件。
除了涉及根据本发明的植物外，本发明还涉及在通常由可持续原料制造的产品的生产中和在化学工业用的材料或物质的生产中的植物的种子或后代、或其器官或植物部分、组织或细胞，所述可持续原料例如食品和动物饲料-优选糖或糖浆(糖蜜)，其中糖蜜还用于工业应用中，例如用于酒精生产或用作生产生物技术产品的生长基质，所述化学工业用的材料或物质例如精炼化学制品、药物或其前体，诊断剂、化妆品、生物乙醇或沼气。申请案de102012022178a1中描述了沼气厂使用甜菜作为生物原料的例子；例如参见第10段。
以下实例解释了本发明，但不限制本发明的主题。除非另有说明，否则使用标准分子生物学方法。参见，例如，sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第三版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny,2001；fritsch等人，coldspringharborlaboratorypress:1989；mayer等人，immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology,eds.,academicpress,london,1987；以及weir等人，handbookofexperimentalimmunology，第i-iv卷，blackwel编辑，1986。
下面将详细说明根据本发明的一些最重要的序列：
seqidno.2-非功能性remorin基因的基因组序列(haplotyp1)
seqidno.3-非功能性remorin基因的开放阅读框(haplotyp1)
seqidno.4-非功能性remorin多肽的氨基酸序列(haplotyp1)
seqidno.6-功能性remorin基因的基因组序列(haplotyp2)
seqidno.7-功能性remorin基因的开放阅读框(haplotyp2)
seqidno.8-功能性remorin多肽的氨基酸序列(haplotyp2)
seqidno.10-功能性remorin基因的基因组序列(haplotyp3)
seqidno.11-功能性remorin基因的开放阅读框(haplotyp3)
seqidno.12-功能性remorin多肽的氨基酸序列(haplotyp3)
seqidno.14-功能性remorin基因的基因组序列(haplotyp4)
seqidno.15-功能性remorin基因的开放阅读框(haplotyp4)
seqidno.16-功能性remorin多肽的氨基酸序列(haplotyp4)
seqidno.18-功能性remorin基因的基因组序列(haplotyp5)
seqidno.19-功能性remorin基因的开放阅读框(haplotyp5)
seqidno.20-功能性remorin多肽的氨基酸序列(haplotyp5)
seqidno.51-编码rz2的核苷酸序列
seqidno.52-rz2变体a的氨基酸序列
seqidno.53-rz2变体b的氨基酸序列
seqidno.54-包括功能性remorin基因(haplotyp5)、侧翼区和rz2的核苷酸序列
seqidno.55-包括非功能性remorin基因(haplotyp1)、侧翼区和rz2的核苷酸序列
实施例
实施例1：对参与rz2介导的bnyvv抗性的基因(即功能性remorin基因)以及干扰所述抗性的变体(即非功能性remorin基因)进行鉴定和遗传作图。
为定位非功能性remorin基因，已进行了遗传作图，所述非功能性remorin基因在表达相应多肽后导致抑制甜菜物种植物中rz2介导的对bnyvv的抗性。为此目的，将包含rz2抗性等位基因的两种甜菜品系杂交，其中一个亲本品系包含非功能性remorin基因，并且另一亲本品系对丛根病有抗性。然后，可将感兴趣的基因遗传定位在rz2基因座附近的后代群体中。然而，此区域仍含有过多基因而无法指定特定的候选基因。
在遗传作图的同时，分析了多基因育种材料中分子标记的图案。对带有含有非功能性remorin基因的预测基因座与rz2基因之间的重组的五个基因型进行了自花授粉。从后代的20株植物中收集了表型抗性数据。进行方差分析并确定标记。标记s3e5798s01(等位基因x：a，等位基因y：g；引物等位基因x(seqidno：24)，引物等位基因y(seqidno：25))显示了remorin基因定位的最高证据。标记的遗传位置是遗传图谱的3号染色体上的40.99598509cm。参比序列(sbkv7)上的相关的snp的物理位置在3号染色体上的8,887,000bp。
因此，此标记在遗传上距离rz-2抗性基因仅约0.75cm且物理上距离约381kbp，其例如可通过在3号染色体上的遗传位置41.7471132cm(物理位置:9,268,704bp)处的标记s3e5853s01(seqidno：26)检测。
对此区域的参考序列的分析表明，标记s3e5798s01(seqidno.24和25)位于所注释的基因模型(g23238.t1)中，其中该基因含有remorin结构域(c末端区域)。
此外，已进行了遗传精细作图以更好地解析感兴趣的区域。具体地，搜索了显示rz2(bnyvv抗性)和remorin(非功能等位基因的存在-是(a)/否(b)；图8)的不同等位基因组合的重组体。为此目的，用标记分析划分群体的2730株植物。rz2基因和识别的remorin基因之间存在足够的遗传标记以可靠地鉴定此类重组体；参见图8。然后在抗性测试中再次测试这些重组体：在子代测试中，h位置的基因型(＝非功能性等位基因的杂合)1:2:1(a:h:b)分裂。a和b后代在抗性测试中作为对照进行测试。
实施例2：remorin基因的功能验证
优选在叶片组织上进行功能分析的瞬时测定的数种变型。这些是基于测试构建体(例如质粒，其中待测试的基因在植物中具有活性的启动子的表达控制下)的瞬时基因表达以及作为触发抗性反应的代用指标(proxy)的超敏反应(细胞死亡反应)的后续测量。为将测试构建体转移到植物组织中，例如使用粒子轰击或通过农杆菌渗透的局部转化。细胞死亡反应可通过视觉(细胞塌陷、泛黄、在紫外光下有荧光性)或通过测量共转化的报告基因(例如荧光素酶)的报告基因活性来测量。报告基因活性的降低与细胞死亡活性的增加有关。
试验1：在包含rz2的抗性等位基因的两种基因型中tgb1基因表达后细胞死亡反应的比较(图4)
测试的两种基因型均包含rz2的抗性等位基因。基因型1包含remorin的功能性等位基因，基因型2包含remorin的非功能性等位基因。在将甜菜坏死黄静脉病毒(bnyvv)(seqidno：41,42)的tgb1基因或同源tgb1基因(例如来自甜菜土壤传播的花叶病毒(beetsoilbornemosaicvirus)(seqidno：43；wetzel和varrelmann(2018)))转移到两种基因型中后，基因型1中能测出细胞死亡反应。在基因型2中，与基因型1相比，没有发生相应的细胞死亡反应或其表现显著降低。
该测试还可用于筛选rz2和remorin的功能性等位基因或等位基因组合的新基因型。它也潜在地适用于筛选具有干扰rz2介导的bnyvv抗性的其它基因的基因型。
试验2：在包含rz2的抗性等位基因的基因型中tgb1基因和remorin基因表达后细胞死亡反应的比较(图5)
包含rz2的抗性等位基因和remorin的功能等位基因的基因型用于试验。在该基因型中，tgb1瞬时表达结合remorin的非功能性等位基因。为进行比较，进行tgb1瞬时表达结合空载体对照或tgb1瞬时表达结合remorin的功能性等位基因。在后两种组合中，可测出细胞死亡触发。相比之下，tgb1结合非功能性remorin等位基因的细胞死亡触发的程度降低或完全不存在。
这些结果表明，非功能性remorin等位基因与remorin的功能性等位基因相比是显性的。显性意味着即使在杂合状态下(一个染色体组上的非功能性等位基因/另一个染色体组上的功能性remorin等位基因)，它也会发挥其全部功效，即在任何情况下，非功能性等位基因都会抑制或阻止抗性的发展。相反，这意味着rz2只有在功能性remorin基因是纯合的情况下才能发挥其抗性作用。
试验3：在与remorin等位基因和rz2组合的tgb1基因表达后细胞死亡反应的比较(图6)
tgb1、rz2和remorin的功能性或非功能性等位基因的瞬时表达可在没有rz2的基因型或在替代的测试系统(例如烟草属)中进行。当使用功能性remorin时，与使用非功能性remorin相比，可测量出更高的细胞死亡率。
该测试还可修改形式用于比较具有remorin或rz2的等位基因变异的基因型。具有要检查的各自基因的测试构建体被排除在瞬时表达之外，并且仅瞬时表达其它成分。细胞死亡反应的表达可用作变异的等位基因功能性的量度。
实施例3：本氏烟草(nicotianabenthamiana)中rz2编码的多肽与tgb1编码的多肽之间相互作用的证明
为证明rz2多肽与tgb1病毒多肽之间的相互作用，选择了浸润法。每株植物都有两片叶子已进行浸润。
材料
1)构建体
提供了以下构建体：
2)植物材料
提供发芽后四到五周龄的本氏烟草植物作为植物材料。
3)浸润介质
通过以下步骤提供了100ml浸润介质：将100mmmgcl2溶液与0.5mmes/kohph5.6以及0.05m乙酰丁香酮混合，随后通过添加无菌h2o将最终体积调节至100ml。
方法步骤
-提供了几种含有上述构建体的根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)培养物。每种培养物在体积为3ml的lb培养基中。根据上述给定的构建体所编码的抗性添加抗生素，其选自：利福平、壮观霉素、庆大霉素和卡那霉素。温育在28℃下在180rpm的振荡器上过夜进行。
-18小时后，确定每种培养物的od600值。每种液体培养物以2500g在室温下离心15分钟。将沉淀重新悬浮在没有抗生素的lb培养基中。将体积调整为浸润所需的od值：1.
-再悬浮后，将培养物在28℃下在振荡器上以180rpm温育1小时。之后，如上所述将培养物离心，并将沉淀重悬于浸润介质中(上面给出了这种介质的组成)。针对rz-2_c48+空载体；rz-2_c48+bnyvv_tgb1；空载体+bnyvv_tgb1的组合中的每一个，将体积调整为浸润所需的od值：1:1。
-细菌悬浮液在室温下放置2小时。随后，将不同的细菌悬浮液以适合浸润的关系混合：1:1。通过1ml胰岛素注射器在叶片的下表面进行浸润。标记浸润部位以及浸润的叶子。
-浸润后，将植物于室温下在黑暗中放置过夜。之后，将浸润的植物在气候箱中进行温育。每天22℃下光照16小时，19℃下8小时不见光。
结果
结果显示在图9中。虽然rz2_c48+空载体组合和bnyvv_tgb1+空载体组合不会导致浸润斑变色，但rz2_c48+bnyvv_tgb1组合会由于坏死而导致浸润斑变色。坏死表明，由于触发了抗性反应，植物防御机制已被激活。
实施例4：甜菜中通过rz2编码的多肽与通过tgb1编码的多肽之间相互作用的证明
甜菜品种danicia的叶盘通过具有不同构造组合的粒子轰击而瞬时转化。之后，在蛋白质提取物中确定了报告蛋白荧光素酶的活性。可证明，rz2_c48与bnyvv_tgb1的组合会触发免疫反应，该反应伴随着细胞死亡和荧光素酶报告蛋白的活性降低。单独的rz2_c48的转化或单独的bnyvv-tgb1的转化没有显示出此类反应，这应解释为此类单一组分不足以触发免疫应答。然而，这两个因子的结合允许相互作用并引发抗性反应。结果显示在图10中。
实施例5：bnyvv_tgb1和g23238_remorin之间蛋白质相互作用的证明
已提供了用于双分子荧光互补(bifc)的质粒。这些质粒编码具有荧光蛋白venus的分割部分的融合蛋白。在本氏烟草中，我们能够在bnyvv-tgb1构建体与包含编码remorin的功能性变体的等位基因的构建体的组合共表达后观察到荧光信号。两种单独构建体中的任何一种表达后均未观察到该荧光信号。所得数据证明了remorin的功能性变体与病毒蛋白tgb1之间的化学相互作用。
该实验表明g23238_remorin和bnyvv_tgb1之间存在蛋白质-蛋白质相互作用，bnyvv_tgb1是激活rz2_c48抗性的病毒蛋白。该结果支持在通过rz2_c48对bnyvv_tgb1的检测中有g23238_remorin参与的数据。