用于癌症免疫疗法的重组痘病毒的制作方法

文档序号：25541926发布日期：2021-06-18 20:38阅读：561来源：国知局

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月15日提交的美国临时申请号62/731,876、2018年11月14日提交的美国临时申请号62/767,485和2019年4月3日提交的美国临时申请号62/828,975的权益和优先权，将所述申请的公开文本通过引用以其整体并入本文。

联邦资助研究声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的ai073736、ai095692、ar068118和ca008748下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。

本公开文本的技术总体上涉及肿瘤学、病毒学和免疫疗法领域。具体地，本发明技术涉及痘病毒单独地或与免疫检查点阻断剂、免疫调节剂和/或抗癌药物组合作为免疫治疗和/或溶瘤组合物的用途，所述痘病毒包括：被基因工程化以表达ox40l的包含e3l缺失(mvaδe3l)的重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒(mvaδe3l-ox40l)；被基因工程化以表达ox40l的包含c7l缺失(mvaδc7l)的重组mva病毒(mvaδc7l-ox40l)；被工程化以表达ox40l和hflt3l的重组mvaδc7l(mvaδc7l-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含c7l缺失、e5r缺失并表达hflt3l和ox40l的重组mva(mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含e5r缺失的重组mva(mvaδe5r)；被基因工程化以包含e5r缺失并表达hflt3l和ox40l的重组mva(mvaδe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含e3l缺失、e5r缺失并表达hftl3l和ox40l的重组mva(mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含e5r缺失、c11r缺失并表达hflt3l和ox40l的重组mva(mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r)；被基因工程化以包含e3l缺失、e5r缺失、c11r缺失并表达hflt3l和ox40l的重组mva(mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r)；被基因工程化以表达ox40l的包含c7l缺失(vacvδc7l)的重组痘苗病毒(vacvδc7l-ox40l)；被基因工程化以表达ox40l和hflt3l二者的重组vacvδc7l(vacvδc7l-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含e5r缺失的vacv(vacvδe5r)；被基因工程化以包含e5r缺失、胸苷激酶(tk)缺失并表达抗ctla-4、hflt3l和ox40l的重组vacv(vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含b2r缺失的vacv(vacvδb2r)；被基因工程化以包含e3lδ83n缺失和b2r缺失的vacv(vacve3lδ83nδb2r)；被基因工程化以包含e5r缺失和b2r缺失的vacv(vacvδe5rδb2r)；被基因工程化以包含e3lδ83n缺失、e5r缺失和b2r缺失的vacv(vacve3lδ83nδe5rδb2r)；被基因工程化以包含e3lδ83n缺失、胸苷激酶(tk)缺失和e5r缺失并表达抗ctla-4、hflt3l、ox40l和il-12的vacv(vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12)；被基因工程化以包含e3lδ83n缺失、胸苷激酶(tk)缺失、e5r缺失和b2r缺失并表达抗ctla-4、hflt3l、ox40l和il-12的vacv(vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r)；被基因工程化以包含m31r缺失的myxv(myxvδm31r)；被基因工程化以包含m31r缺失并表达hfl3l和ox40l的重组myxv(myxvδm31r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含m63r缺失的myxv(myxvδm63r)；被基因工程化以包含m64r缺失的myxv(myxvδm64r)；被基因工程化以包含wr199缺失的mva(mvaδwr199)；被基因工程化以包含e5r缺失、wr199缺失并表达hflt3l和ox40l的mva(mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)；或其组合。在一些实施方案中，本公开文本的技术涉及进一步修饰以表达特定目的基因(sg)的前述病毒中的任一种，所述特定目的基因是如编码包括但不限于以下项的以下免疫调节蛋白中的任何一种或多种的基因：hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l。在一些实施方案中，病毒骨架被进一步修饰以包含包括但不限于以下项的基因的缺失或突变：胸苷激酶(tk)、e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、e5r、k7r、c12l(il18bp)、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l和/或wr199。在一些实施方案中，本公开文本的技术涉及前述病毒中的任一种作为疫苗佐剂的用途。具体地，本发明技术涉及mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l和热灭活的mvaδe5r单独地或与免疫检查点阻断(icb)抗体组合作为癌症疫苗中肿瘤抗原的疫苗佐剂以用作癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，本公开文本的技术涉及前述病毒中的任一种作为疫苗载体的用途。具体地，本发明技术涉及mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-ox40l作为癌症疫苗的疫苗载体的用途。在一些实施方案中，本发明技术涉及单独地或与免疫检查点阻断剂、免疫调节剂和/或抗癌药物组合作为免疫治疗和/或溶瘤组合物的选自以下的重组痘病毒：mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-ctla-4和myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-ctla-4或其组合。

背景技术：

提供以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均不被承认是现有技术。

恶性肿瘤(如黑色素瘤)固有地对常规疗法具有抗性，并且提出了重大的治疗挑战。免疫疗法是一个不断发展的研究领域，并且是治疗某些类型的癌症的另外的选择。免疫疗法方法基于如下原理：可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞，并且靶向它们进行破坏。尽管癌细胞呈递抗原，并且存在可能对肿瘤细胞潜在发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定地被抑制。此现象的答案是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫反应影响的能力。肿瘤发展出多种免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫反应。因此，需要改进的免疫治疗方法来增强宿主抗肿瘤免疫并靶向肿瘤细胞进行破坏。

技术实现要素：

在一方面，本公开文本提供了一种重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒，其包含突变型c7基因和编码ox40l的异源核酸分子(mvaδc7l-ox40l)。在一些实施方案中，所述重组mvaδc7l-ox40l病毒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸(mvaδc7l-hflt3l-ox40l)。在一些实施方案中，本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒还包含突变型胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，包含所述突变型tk基因的重组mvaδc7l-ox40l病毒包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的所述异源核酸分子。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码hflt3l的异源核酸分子。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有编码hflt3l的所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换，并且其中所述病毒还包含突变型tk基因，所述突变型tk基因包含用含有编码ox40l的所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对tk基因的至少一部分的替换(mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l)。在一些实施方案中，ox40l从mva病毒基因内表达。在一些实施方案中，ox40l从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达。在一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达，并且hflt3l从c7基因内表达。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。在一些实施方案中，所述重组mva病毒展现出以下特征中的一个或多个：与用相应的mvaδc7l病毒感染的肿瘤细胞相比，诱导增加的肿瘤细胞中的效应t细胞水平；与相应的mvaδc7l病毒相比，诱导增加的效应t细胞的脾产生；以及与和相应的mvaδc7l病毒接触的肿瘤细胞相比，减小与所述重组mvaδc7l-ox40l病毒接触的肿瘤细胞的肿瘤体积。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞包括黑色素瘤细胞。

在另一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物包含药学上可接受的佐剂。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的本发明技术的重组mvaδc7l的组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法包括所述免疫反应的诱导、增强或促进，其包括以下中的一种或多种：与用相应的mvaδc7l病毒感染的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中的效应t细胞水平增加；以及与相应的mvaδc7l病毒相比，效应t细胞的脾产生增加。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种免疫检查点阻断剂。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种免疫检查点阻断剂。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗(arelumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗(lirilumab)、乌瑞鲁单抗(urelumab)、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、瓦利鲁单抗(varlilumab)、加利昔单抗(galiximab)、amp-514、aunp12、吲哚莫德(indoximod)、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，与施用单独的所述mvaδc7l-ox40l或mvaδc7l-hflt3l-ox40l或者所述免疫检查点阻断剂相比，所述mvaδc7l-ox40l或mvaδc7l-hflt3l-ox40l和所述免疫检查点阻断剂的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在另一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明技术的病毒(例如，mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l)或本发明技术的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。

在另一方面，本公开文本提供了一种重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒，其包含突变型e3基因和编码ox40l的异源核酸分子(mvaδe3l-ox40l)。在一些实施方案中，所述重组mvaδe3l-ox40l病毒包含突变型胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，所述突变型tk基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的所述异源核酸分子。在本发明技术的病毒的一些实施方案中，ox40l从mva病毒基因内表达。在本发明技术的病毒的一些实施方案中，ox40l从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在本发明技术的病毒的一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达。在本发明技术的病毒的一些实施方案中，所述病毒包含编码hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、e5r、k7r、c12l(il18bp)、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。在本发明技术的病毒的一些实施方案中，所述重组mva病毒展现出以下特征中的一个或多个：与用相应的mvaδe3l病毒感染的肿瘤细胞相比，诱导增加的肿瘤细胞中的效应t细胞水平；与相应的mvaδe3l病毒相比，诱导增加的效应t细胞的脾产生；以及与和相应的mvaδe3l病毒接触的肿瘤细胞相比，减小与所述重组mvaδe3l-ox40l病毒接触的肿瘤细胞的肿瘤体积。在本发明技术的病毒的一些实施方案中，所述肿瘤细胞包括黑色素瘤细胞。在一些实施方案中，所述突变型e3基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。在一些实施方案中，所述突变型tk基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。

在另一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明技术的重组mvaδe3l-ox40l病毒。在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物包含药学上可接受的佐剂。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的本发明技术的重组mvaδe3l-ox40l病毒的组合物或本发明技术的免疫原性组合物。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述免疫反应的诱导、增强或促进包括以下中的一种或多种：与用相应的mvaδe3l病毒感染的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中的效应t细胞水平增加；以及与相应的mvaδe3l病毒相比，效应t细胞的脾产生增加。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，与施用单独的mvaδe3l-ox40l或所述免疫检查点阻断剂相比，所述mvaδe3l-ox40l和所述免疫检查点阻断剂的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在另一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明技术的病毒(例如，mvaδe3l-ox40l)或本发明技术的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的mvaδe3l-ox40l或所述免疫检查点阻断剂相比，mvaδe3l-ox40l和所述免疫检查点阻断剂的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在另一方面，本公开文本提供了一种重组痘苗病毒(vacv)，其包含突变型c7基因和编码ox40l的异源核酸分子(vacvδc7l-ox40l)。在一些实施方案中，所述病毒包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸(vacvδc7l-hflt3l-ox40l)。在一些实施方案中，所述病毒包含突变型胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，所述突变型tk基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的所述异源核酸分子。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码hflt3l的异源核酸分子。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有编码hflt3l的所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换，并且其中所述病毒还包含突变型tk基因，所述突变型tk基因包含用含有编码ox40l的所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对tk基因的至少一部分的替换(vacvδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l)。在一些实施方案中，ox40l从痘苗病毒基因内表达。在一些实施方案中，ox40l从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达。在一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达，并且hflt3l从c7基因内表达。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、e5r、k7r、c12l(il18bp)、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码hil-12的异源核酸和编码抗huctla-4的异源核酸(vacvδc7l-抗huctla-4-hflt3l-ox40l-hil-12)。在一些实施方案中，所述重组vacvδc7l-ox40l病毒展现出以下特征中的一个或多个：与用相应的vacvδc7l病毒感染的肿瘤细胞相比，诱导增加的肿瘤细胞中的效应t细胞水平；与相应的vacvδc7l病毒相比，诱导增加的效应t细胞的脾产生；以及与和相应的vacvδc7l病毒接触的肿瘤细胞相比，减小与所述重组vacvδc7l-ox40l病毒接触的肿瘤细胞的肿瘤体积。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞包括黑色素瘤细胞。

在另一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明技术的重组vacvδc7l-ox40l病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物包含药学上可接受的佐剂。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的本发明技术的重组vacvδc7l-ox40l病毒的组合物或本发明技术的免疫原性组合物。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述治疗包括所述免疫反应的诱导、增强或促进，其包括以下中的一种或多种：与用相应的vacvδc7l病毒感染的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中的效应t细胞水平增加；以及与相应的vacvδc7l病毒相比，效应t细胞的脾产生增加。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，与施用单独的vacvδc7l-ox40l或vacvδc7l-hflt3l-ox40l或者所述免疫检查点阻断剂相比，所述vacvδc7l-ox40l或vacvδc7l-hflt3l-ox40l和所述免疫检查点阻断剂的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明技术的病毒(例如，vacvδc7l-ox40l或vacvδc7l-hflt3l-ox40l)或本发明技术的免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。

在另一方面，本公开文本提供了一种重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒核酸序列，其中在seqidno:1的位置75,560与76,093之间的核酸序列被包含编码ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，并且其中所述mva还包含c7突变体。在本发明技术的mva病毒的一些实施方案中，在seqidno:1的位置18,407与18,859之间的核酸序列被包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的开放阅读框的异源核酸序列替换。

在另一方面，本公开文本提供了一种重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒核酸序列，其中在seqidno:1的位置75,798至75,868之间的核酸序列被包含编码ox40l或编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的开放阅读框的异源核酸序列替换，并且其中所述mva还包含e3突变体。

在另一方面，本公开文本提供了一种重组痘苗病毒(vacv)核酸序列，其中在seqidno:2的位置80,962与81,032之间的核酸序列被包含编码ox40l或的开放阅读框的异源核酸序列替换，并且其中所述vacv还包含c7突变体。在本发明技术的重组vacv的一些实施方案中，在seqidno:2的位置15,716与16,168之间的核酸序列被包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的开放阅读框的异源核酸序列替换。

在另一方面，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒。

在另一方面，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码本发明技术的重组mvaδe3l-ox40l病毒。

在另一方面，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码本发明技术中任一种的重组vacvδc7l-ox40l病毒。

在另一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒或本发明技术的免疫原性组合物以及使用说明书。

在另一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术中任一种的重组mvaδe3l-ox40l病毒或本发明技术的免疫原性组合物以及使用说明书。

在另一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的重组vacvδc7l-ox40l病毒或本发明技术的免疫原性组合物以及使用说明书。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种重组mvaδc7l-ox40l病毒，其中所述突变型c7基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种重组mvaδc7l-ox40l病毒，其中所述突变型tk基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种重组mvaδe3l-ox40l病毒，其中所述突变型e3基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种重组mvaδe3l-ox40l病毒，其中所述突变型tk基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。在一些实施方案中，本发明技术提供了一种重组vacvδc7l-ox40l病毒，其中所述突变型c7基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种重组vacvδc7l-ox40l病毒，其中所述突变型tk基因至少部分缺失，不表达，表达水平低至无作用，或表达为无功能蛋白。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗原和治疗有效量的佐剂，所述佐剂包含含有突变型c7基因和编码ox40l的异源核酸的重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒(mvaδc7l-ox40l)。在一些实施方案中，所述mvaδc7l-ox40l病毒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸(mvaδc7l-hflt3l-ox40l)。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，所述突变型tk基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的所述异源核酸分子。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有异源核酸的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码hflt3l的异源核酸分子。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有编码hflt3l的所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换，并且其中所述病毒还包含突变型tk基因，所述突变型tk基因包含用含有编码ox40l的所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对tk基因的至少一部分的替换(mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l)。在一些实施方案中，ox40l从mva病毒基因内表达。在一些实施方案中，ox40l从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达。在一些实施方案中，ox40l从tk基因内表达，并且hflt3l从c7基因内表达。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。

在一些实施方案中，所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在与致癌病毒感染相关的肿瘤的情况下的病毒抗原、gpa33、her2/neu、gd2、mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、mum-1、cdk4、n-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、erbb2、癌症抗原125(ca-125)、癌胚抗原(cea)、rage、mart(黑色素瘤抗原)、muc-1、muc-2、muc-3、muc-4、muc-5ac、muc-16、muc-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、pmel17(gp100)、gnt-v内含子v序列(n-乙酰葡糖胺转移酶v内含子v序列)、前列腺癌psm、prame(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、ebna(eb病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(lrp)bcl-2、前列腺特异性抗原(psa)、ki-67、ceacam6、结肠特异性抗原-p(csap)、ny-eso-1、人乳头瘤病毒e6和e7及其任何组合。

在一些实施方案中，所述施用步骤包括以一剂或多剂施用所述抗原和所述佐剂，和/或其中将所述抗原和所述佐剂分开、顺序或同时施用。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用选自以下的免疫检查点阻断剂：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。

在一些实施方案中，将所述抗原和所述佐剂与所述免疫检查点阻断剂的施用分开、顺序或同时递送至所述受试者。

在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导所述肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述免疫反应的诱导、增强或促进包括以下中的一种或多种：(i)与未经处理的对照样品相比，干扰素γ(ifn-γ)在脾、引流淋巴结和/或血清中的t细胞中的表达水平增加；(ii)与未经处理的对照样品相比，抗原特异性t细胞在脾、引流淋巴结和/或血清中的水平增加；以及(iii)与未经处理的对照样品相比，抗原特异性免疫球蛋白在血清中的水平增加。在一些实施方案中，所述抗原特异性免疫球蛋白是igg1或igg2。

在一些实施方案中，将所述抗原和所述佐剂配制为瘤内、肌内、皮内或皮下施用。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤鳞状细胞癌、梅克尔细胞癌、胃癌、肝癌和肉瘤。

在一些实施方案中，将所述mvaδc7l-ox40l病毒以每次施用约10⁵至约10¹⁰个噬斑形成单位(pfu)的剂量施用。

在所述方法的一些实施方案中，所述受试者是人。

在一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含所述抗原和本发明技术的佐剂。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在与致癌病毒感染相关的肿瘤的情况下的病毒抗原、gpa33、her2/neu、gd2、mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、mum-1、cdk4、n-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、erbb2、癌症抗原125(ca-125)、癌胚抗原(cea)、rage、mart(黑色素瘤抗原)、muc-1、muc-2、muc-3、muc-4、muc-5ac、muc-16、muc-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、pmel17(gp100)、gnt-v内含子v序列(n-乙酰葡糖胺转移酶v内含子v序列)、前列腺癌psm、prame(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、ebna(eb病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(lrp)bcl-2、前列腺特异性抗原(psa)、ki-67、ceacam6、结肠特异性抗原-p(csap)、ny-eso-1、人乳头瘤病毒e6和e7及其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含选自以下的免疫检查点阻断剂：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含使用说明书、容器器件和以下各项的单独部分：(a)抗原；和(b)本发明技术的佐剂。在所述试剂盒的一些实施方案中，所述抗原选自肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在与致癌病毒感染相关的肿瘤的情况下的病毒抗原、gpa33、her2/neu、gd2、mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、mum-1、cdk4、n-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、erbb2、癌症抗原125(ca-125)、癌胚抗原(cea)、rage、mart(黑色素瘤抗原)、muc-1、muc-2、muc-3、muc-4、muc-5ac、muc-16、muc-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、pmel17(gp100)、gnt-v内含子v序列(n-乙酰葡糖胺转移酶v内含子v序列)、前列腺癌psm、prame(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、ebna(eb病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(lrp)bcl-2、前列腺特异性抗原(psa)、ki-67、ceacam6、结肠特异性抗原-p(csap)、ny-eso-1、人乳头瘤病毒e6和e7及其任何组合。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含(c)选自以下的免疫检查点阻断剂：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。

在本发明技术的方法的一些实施方案中，所述抗原是选自以下的新抗原：m27(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)(seqidno:17)、m30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl)(seqidno:18)、m48(shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs)(seqidno:19)及其组合。

在本发明技术的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述抗原是选自以下的新抗原：m27(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)(seqidno:17)、m30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl)(seqidno:18)、m48(shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs)(seqidno:19)及其组合。

在本发明技术的试剂盒的一些实施方案中，所述抗原是选自以下的新抗原：m27(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)(seqidno:17)、m30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl)(seqidno:18)、m48(shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs)(seqidno:19)及其组合。

在一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含所述mvaδe5r病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。

在一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的所述mvaδe5r病毒的组合物或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fingolimod)(fty720)；及其任何组合。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(selumitinib)(azd6244)、pd98059、曲美替尼(trametinib)、考比替尼(cobimetinib))、egfr抑制剂(拉帕替尼(lapatinib)(lpn)、埃罗替尼(erlotinib)(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sorafenib)(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼(dabrafenib)、威罗非尼(vemurafenib))、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述mvaδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述mvaδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述mvaδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述mvaδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种核酸，其编码本文所述的工程化mvaδe5r病毒。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本文所述的工程化mvaδe5r病毒以及使用说明书。

在一方面，本公开文本提供了一种痘苗病毒(vacv)，其被基因工程化以包含突变型e5r基因(vacvδe5r)。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码ox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或胸苷激酶(tk)、c7(δc7l)、e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。在一些实施方案中，所述突变型e5r基因包含用含有所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的异源核酸分子(vacvδe5r-ox40l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(vacvδe5r-ox40l-hflt3l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(vacvδe5r-hflt3l)。在一些实施方案中，所述异源核酸从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，所述突变型tk基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型c7基因。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。

在一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含所述vacvδe5r病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。

在一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的所述vacvδe5r病毒的组合物或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述vacvδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述vacvδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述vacvδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述vacvδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种核酸，其编码本发明技术的工程化vacvδe5r病毒。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的工程化vacvδe5r病毒以及使用说明书。

在一方面，本公开文本提供了一种粘液瘤病毒(myxv)，其被基因工程化以包含突变型m31r基因(myxvδm31r)。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码ox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或痘苗病毒胸苷激酶(tk)、c7(δc7l)、e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199的粘液瘤直系同源物中的任何一种或多种的缺失。在一些实施方案中，所述突变型m31r基因包含用含有所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的异源核酸分子(myxvδm31r-ox40l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(myxvδm31r-ox40l-hflt3l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(myxvδm31r-hflt3l)。在一些实施方案中，所述异源核酸从选自以下的痘苗病毒基因的粘液瘤直系同源物内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在一些实施方案中，所述病毒还包含痘苗病毒胸苷激酶(tk)基因的突变型粘液瘤直系同源物。在一些实施方案中，所述突变型tk基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述病毒还包含痘苗病毒c7基因的突变型粘液瘤直系同源物。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。

在一方面，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含所述myxvδm31r病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。

在一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的所述myxvδm31r病毒的组合物或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。

在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述myxvδm31r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述myxvδm31r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述myxvδm31r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述myxvδm31r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种核酸，其编码本发明技术的工程化myxvδm31r病毒。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的工程化myxvδm31r病毒以及使用说明书。

在另一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的本发明技术的重组mvaδc7l的组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，用于治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法包括所述免疫反应的诱导、增强或促进，其包括以下中的一种或多种：与用相应的mvaδc7l病毒感染的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中的效应t细胞水平增加；以及与相应的mvaδc7l病毒相比，效应t细胞的脾产生增加。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种免疫检查点阻断剂。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种免疫检查点阻断剂。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在治疗有需要的受试者的实体瘤的所述方法的一些实施方案中，与施用单独的所述mvaδc7l-ox40l或mvaδc7l-hflt3l-ox40l或者所述免疫检查点阻断剂相比，所述mvaδc7l-ox40l或mvaδc7l-hflt3l-ox40l和所述免疫检查点阻断剂的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在另一方面，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒。

在另一方面，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码本发明技术的重组mvaδe3l-ox40l病毒。

在另一方面，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码本发明技术中任一种的重组vacvδc7l-ox40l病毒。

在另一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒或本发明技术的免疫原性组合物以及使用说明书。

在另一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术中任一种的重组mvaδe3l-ox40l病毒或本发明技术的免疫原性组合物以及使用说明书。

在另一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的重组vacvδc7l-ox40l病毒或本发明技术的免疫原性组合物以及使用说明书。

在一些实施方案中，所述施用步骤包括以一剂或多剂施用所述抗原和所述佐剂，和/或其中将所述抗原和所述佐剂分开、顺序或同时施用。

在一些实施方案中，将所述抗原和所述佐剂与所述免疫检查点阻断剂的施用分开、顺序或同时递送至所述受试者。

在一些实施方案中，将所述抗原和所述佐剂配制为瘤内、肌内、皮内或皮下施用。

在一些实施方案中，将所述mvaδc7l-ox40l病毒以每次施用约10⁵至约10¹⁰个噬斑形成单位(pfu)的剂量施用。

在所述方法的一些实施方案中，所述受试者是人。

在一方面，本公开文本提供了一种改良安卡拉痘苗(mva)病毒，其被基因工程化以包含突变型e5r基因(mvaδe5r)。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码ox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或胸苷激酶(tk)、c7(δc7l)、e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。在一些实施方案中，所述突变型e5r基因包含用含有所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的异源核酸分子(mvaδe5r-ox40l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(mvaδe5r-ox40l-hflt3l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(mvaδe5r-hflt3l)。在一些实施方案中，所述异源核酸从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r基因(wr200)、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型胸苷激酶(tk)基因。在一些实施方案中，所述突变型tk基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型c7基因。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c7基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述mvaδe5r-ox40l-hflt3l病毒还包含突变型c11r基因(mvaδe5r-ox40l-hflt3l-δc11r)。在一些实施方案中，所述突变型c11r基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型c11r基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述mvaδe5r-ox40l-hflt3l病毒还包含突变型wr199基因(mvaδe5r-ox40l-hflt3l-δwr199)。在一些实施方案中，所述突变型wr199基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型wr199基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述mvaδe5r病毒还包含突变型e3l基因(δe3l)。在一些实施方案中，所述突变型e3l基因包含含有异源核酸分子的一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述突变型e3l基因包含用含有异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的全部或至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的异源核酸分子。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述mvaδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述mvaδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种核酸，其编码本文所述的工程化mvaδe5r病毒。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本文所述的工程化mvaδe5r病毒以及使用说明书。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述vacvδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述vacvδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述vacvδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述vacvδe5r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种核酸，其编码本发明技术的工程化vacvδe5r病毒。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的工程化vacvδe5r病毒以及使用说明书。

在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述myxvδm31r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述myxvδm31r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一方面，本公开文本提供了一种核酸，其编码本发明技术的工程化myxvδm31r病毒。

在一方面，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的工程化myxvδm31r病毒以及使用说明书。

在一方面，本公开文本提供了一种痘苗病毒(vacv)，其被基因工程化以包含突变型b2r基因(vacvδb2r)。

在一些实施方案中，所述vacvδb2r病毒还包含编码ox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或胸苷激酶(tk)、c7(δc7l)、e3l(δe3l)、e3lδ83n、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199中的任何一种或多种的缺失。在一些实施方案中，所述vacvδb2r病毒选自vacvδe3l83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacvδe3l83nδe5rδb2r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-hil-12-δb2r中的一种或多种。在一些实施方案中，所述突变型b2r基因包含用含有所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码ox40l的异源核酸分子(vacvδb2r-ox40l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒还包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(vacvδb2r-ox40l-hflt3l)。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)的异源核酸分子(vacvδb2r-hflt3l)。在一些实施方案中，所述异源核酸从选自以下的病毒基因内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b18r(wr200)基因、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含所述vacvδb2r病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的所述vacvδb2r病毒的组合物或所述免疫原性组合物。

在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。

在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。

在一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。

在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述vacvδe5r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述vacvδb2r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述vacvδb2r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述vacvδb2r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种核酸，其编码本发明技术的vacvδb2r病毒。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含本发明技术的vacvδb2r病毒以及使用说明书。

在一方面，本公开文本提供了一种粘液瘤病毒(myxv)，其被基因工程化以包含一个或多个选自以下的突变体：(i)突变型m63r基因(myxvδm63r)；(ii)突变型m64r基因(myxvδm64r)；和(iii)突变型m62r基因(myxvδm62r)。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码ox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的一种或多种的异源核酸分子，和/或痘苗病毒胸苷激酶(tk)、c7(δc7l)、e3l(δe3l)、e3lδ83n、b2r(δb2r)、b19r(b18r；δwr200)、il18bp、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、m1l、n2l或wr199(δwr199)的粘液瘤直系同源物中的任何一种或多种或者粘液瘤m31r(δm31r)的缺失。在一些实施方案中，所述突变型m63r基因、所述突变型m64r基因和/或所述突变型m62r基因包含用含有所述异源核酸分子的一个或多个基因盒对所述基因的至少一部分的替换。在一些实施方案中，所述异源核酸从选自以下的痘苗病毒基因的粘液瘤直系同源物内表达：胸苷激酶(tk)基因、c7基因、c11基因、k3基因、f1基因、f2基因、f4基因、f6基因、f8基因、f9基因、f11基因、f14.5基因、j2基因、a46基因、e3l基因、b2r基因、b18r(wr200)基因、e5r基因、k7r基因、c12l基因、b8r基因、b14r基因、n1l基因、k1l基因、c16基因、m1l基因、n2l基因和wr199基因。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含本发明技术的myxv病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的本发明技术的myxv病毒的组合物或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。在一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。

在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述myxvδm62r、所述myxvδm63r和/或所述myxvδm64r病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述myxvδm62r、所述myxvδm63r和/或所述myxvδm64r病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述myxv病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述myxv病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种核酸，其编码所述myxv病毒。

在一些实施方案中，所述病毒还包含编码hil-12的异源核酸分子。在一些实施方案中，所述病毒包括mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40lδwr199-hil-12。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型c11r基因(mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40lδwr199-hil-12δc11r)。在一些实施方案中，所述病毒还包含编码hil-15/il-15rα的核酸分子。在一些实施方案中，所述病毒还包含突变型δe3l83n、突变型胸苷激酶(δtk)、突变型b2r(δb2r)、突变型wr199(δwr199)和突变型wr200(δsr200)，并且包含编码抗ctla-4的核酸分子和编码il-12的核酸分子(vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200)。在一些实施方案中，所述vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200病毒还包含编码hil-15/il-15rα的核酸分子(vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα)。在一些实施方案中，所述vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200病毒还包含突变型c11r基因(δc11r)(vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200δc11r)。在一些实施方案中，所述vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200δc11r病毒还包含编码hil-15/il-15rα的核酸分子(vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r)。

在一些实施方案中，本发明技术的myxv病毒被基因工程化以包含突变型m62r基因(δm62r)、突变型m63r基因(δm63r)和突变型m64r基因(δm64r)(myxvδm62rδm63rδm64r)。

在一方面，本公开文本提供了一种选自以下的重组痘病毒：mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-ctla-4和myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-ctla-4。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种核酸序列，其编码所述重组痘病毒。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种试剂盒，其包含所述重组痘病毒。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种免疫原性组合物，其包含所述重组痘病毒。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向肿瘤递送包含有效量的所述重组痘病毒的组合物或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。

在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来施用。

在一些实施方案中，所述肿瘤是黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或前列腺癌。

在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述重组痘病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述重组痘病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述肿瘤的治疗中具有协同作用。

在一些实施方案中，本公开文本提供了一种刺激免疫反应的方法，其包括向受试者施用有效量的所述病毒或所述免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者分开、顺序或同时施用一种或多种选自以下的药剂：一种或多种免疫检查点阻断剂；一种或多种抗癌药物；芬戈莫德(fty720)；及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合；和/或所述一种或多种抗癌药物选自mek抑制剂(u0126、塞米替尼(azd6244)、pd98059、曲美替尼、考比替尼)、egfr抑制剂(拉帕替尼(lpn)、埃罗替尼(erl))、her2抑制剂(拉帕替尼(lpn)、曲妥珠单抗)、raf抑制剂(索拉非尼(sfn))、braf抑制剂(达拉非尼、威罗非尼)、抗ox40抗体、gitr激动剂抗体、抗csfr抗体、csfr抑制剂、紫杉醇、tlr9激动剂cpg和vegf抑制剂(贝伐单抗)及其任何组合。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗pd-1抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂包括抗ctla-4抗体。在一些实施方案中，与施用单独的所述重组痘病毒或者所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物或芬戈莫德(fty720)相比，所述重组痘病毒与所述免疫检查点阻断剂、所述抗癌药物和/或芬戈莫德(fty720)的组合在所述免疫反应的刺激中具有协同作用。

附图说明

图1是在质粒dnapcb载体与mvaδe3l病毒基因组dna之间在胸苷激酶基因(tk；j2r)基因座处的同源重组的示意图。使用pcb-gpt质粒将在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下的鼠ox40l基因插入tk基因座中。在这种情况下，药物选择标记(gpt)在痘苗p7.5启动子的控制下。表达盒在每一侧上侧接有tk基因侧翼区域的部分序列(tk-l和tk-r)。

图2a至图2b示出了来自重组病毒mvaδe3l-tk(-)-mox40l的ox40l表达的验证。图2a是mvaδe3l和mvaδe3l-tk(-)-mox40l病毒基因组中mox40l基因和tk基因的pcr扩增的图像。图2b：代表性facs图，其示出了在用mvaδe3l-tk(-)-mox40l感染的b16-f10细胞中mox40l的表达。简言之，将b16-f10鼠黑色素瘤细胞以10的moi感染24小时。然后用pe缀合的抗mox40l抗体对细胞进行染色。

图3a至图3h是数据的一系列图形表示，其显示在b16-f10双侧肿瘤模型中，与mvaδe3l相比，瘤内注射mvaδe3l-ox40l在远端肿瘤中产生更多激活的肿瘤浸润效应t细胞。使用b16-f10鼠黑色素瘤双侧肿瘤植入模型。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，将2x10⁷pfu的mvaδe3l、mvaδe3l-ox40l、或pbs向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射两次，间隔三天。在第二次注射后2天收获肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞。图3a至图3c：用mvaδe3l、mvaδe3l-ox40l或pbs治疗后，未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图3d：cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝3或4)。(**p<0.01，t检验)。图3e至图3g：用mvaδe3l、mvaδe3l-ox40l或pbs治疗后，未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图3h：cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝3或4)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图4a和图4b是代表性elispot印迹和图，其显示与mva相比，瘤内注射mvaδe3l-ox40l在脾中产生更多的抗肿瘤cd8+t细胞。将携带b16-f10的小鼠用2x10⁷pfu的mvaδe3l、mvaδe3l-hflt3l、或pbs的瘤内注射治疗两次，间隔三天。在第二次注射后2天收集脾。通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和经纯化的cd8⁺t细胞(300,000个)来进行elispot测定。图4a：从左到右一式三份样品的elispot的图像。图4b：每300,000个经纯化的cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的图。每个条表示来自单独小鼠的脾样品(n＝3或4)。

图5a和图5b示出了两步同源重组以产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l的示意图。图5a：第一步：在质粒dnapuc57载体与mva病毒基因组dna之间在侧接c7基因座的c6和c8基因处同源重组，以将hflt3l和gfp表达盒插入c7基因座中(替换c7基因)。人flt3l基因在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)的控制下。gfp在痘苗p7.5启动子的控制下。图5b：第二步：在质粒dnapcb载体与mvaδc7l-hflt3l病毒基因组dna之间在tk(j2r)基因基因座处同源重组，以将muox40l和药物选择标记表达盒插入tk(j2r)基因基因座中。鼠ox40l基因在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)的控制下。药物选择标记gpt在痘苗p7.5启动子的控制下。图5c显示，通过pcr分析病毒基因组dna以验证ox40l和hflt3l的表达并确认转基因的插入。

图6是来自facs分析的一系列点图，其展示了在用mvaδc7l-hflt3l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l感染的b16-f10和sk-mel-28细胞系中的hflt3l表达。在抗体染色和facs分析之前，将细胞以10的moi感染24小时。mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l感染的细胞表达gfp标记。

图7是来自facs分析的一系列点图，其展示了在用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l感染的b16-f10和sk-mel-28细胞系中的鼠ox40l表达。在抗体染色和facs分析之前，将细胞以10的moi感染24小时。

图8a至图8c是数据的一系列图形表示，其显示在b16-f10双侧鼠黑色素瘤模型中，与mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或热灭活的mvaδc7l-hflt3l相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l在远端肿瘤中产生更多激活的肿瘤浸润效应cd8⁺t细胞。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，向右侧腹上的较大肿瘤进行两次mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或热灭活的mvaδc7l-hflt3l的瘤内(it)注射(2x10⁷pfu)，间隔三天。在第二次注射后2天收获未注射的远端肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞。图8a：用pbs、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-muox40l或热imvaδc7l-hflt3l治疗后，未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图8b：每克远端未注射肿瘤中cd8⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4或5)。(*p<0.05；**p<0.01；t检验)。图8c：每克远端未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4或5)。(*p<0.05；**p<0.01；t检验)。

图9a至图9c是数据的一系列图形表示，其显示在b16-f10双侧鼠黑色素瘤模型中，与mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或热灭活的mvaδc7l-hflt3l相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l在远端肿瘤中产生更多激活的肿瘤浸润效应cd4⁺t细胞。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，向右侧腹上的较大肿瘤进行两次mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或热灭活的mvaδc7l-hflt3l的瘤内(it)注射(2x10⁷pfu)，间隔三天。在第二次注射后2天收获远端的未注射肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞。图9a：用pbs、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-muox40l或热imvaδc7l-hflt3l治疗后，未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图9b：每克远端未注射肿瘤中cd4⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4或5)。(*p<0.05；**p<0.01；t检验)。图9c：每克远端未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4或5)。(*p<0.05；**p<0.01；t检验)。

图10a和图10b是代表性elispot印迹和图，其显示与mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或热灭活的mvaδc7l-hflt3l相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l在脾中产生更强的抗肿瘤cd8⁺t细胞反应。将携带b16-f10的小鼠用2x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l、或热灭活的mvaδc7l-hflt3l的瘤内注射治疗两次，间隔三天。在第二次注射后2天收集脾。通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和经纯化的cd8⁺t细胞(300,000个)来进行elispot测定。图10a：从左到右一式三份样品的elispot的图像。图10b：每300,000个经纯化的cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的图。每个条表示来自单独小鼠的脾样品(n＝5)。

图11a至图11g是数据的图形表示，其显示在鼠b16-f10黑色素瘤双侧肿瘤植入模型中itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l和全身性递送免疫检查点阻断抗体抗ctla-4或抗pd-l1的组合延迟肿瘤生长并延长存活期。图11a是b16-f10双侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹1x10⁵个)。肿瘤植入后九天，每周向右侧腹上的较大肿瘤进行两次mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40l的瘤内注射(2x10⁷pfu)。腹膜内给予250μg的抗ctla-4或抗pd-l1抗体/小鼠。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。图11b和图11c是数据的图形表示，其示出了在pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗ctla-4抗体、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗后的天数内注射(图11b)和未注射(图11c)肿瘤的体积。图11d和图11e是数据的图形表示，其示出了注射(图11d)和未注射(图11e)肿瘤的初始体积以及在pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗ctla-4抗体、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗后的第7天和第11天的体积。图11f是用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗ctla-4抗体、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗进行治疗的荷瘤小鼠的kaplan-meier存活曲线的图。(n＝10，**p<0.01；***p<0.001；mantel-cox检验)。图11g是用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗ctla-4抗体、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗的小鼠的中位存活期的表。

图12是数据的一系列图形表示，其示出了在b16-f10单侧大肿瘤模型中经治疗的小鼠中的肿瘤生长曲线。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹(5x10⁵个细胞)。植入后十一天，每周两次瘤内注射病毒，并且每周两次腹膜内注射抗ctla-4或抗pd-l1抗体。

图13a和图13b是两步同源重组以产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-huox40l的示意图。图13a：第一步：在质粒dnapuc57载体与mva病毒基因组dna之间在侧接c7基因座的c6和c8基因处同源重组，以将hflt3l和gfp表达盒插入c7基因座中(替换c7基因)。人flt3l基因在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)的控制下。gfp在痘苗p7.5启动子的控制下。图13b：第二步：在质粒dnapuc57δtk-hox40l-mcherry与mvaδc7l-hflt3l病毒基因组dna之间在侧接j2r(tk)基因的j1r和j3r(tk-r和tk-l)基因座处同源重组，以将huox40l和mcherry表达盒插入tk(j2r)基因基因座中。人ox40l基因在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)的控制下。mcherry在痘苗p7.5启动子的控制下。图13c：含有hox40l基因和hflt3l基因插入但缺少tk(j2r)基因的重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-huox40l的三个独立克隆的pcr验证。h1、h2和h3是单独的重组mva。“+”：pcr反应的阳性对照。

图14a和图14b是示出了亲本mva和重组病毒(包括mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l)在原代鸡胚成纤维细胞(cef)中的多步生长的两个图。图14a是这些病毒在cef中的多步生长曲线。简言之，将cef用上述病毒以0.05的moi感染。在1h、24h、48h和72h收集细胞。通过连续稀释和在共聚焦显微镜下计数gfp⁺焦点来在bhk21细胞上确定病毒滴度。图14b示出了感染后72h相对于感染后1h的病毒滴度的对数(倍数变化)。

图15a和图15b是facs数据的一系列代表性点图，其示出了在被mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l病毒感染的bhk21细胞和人单核细胞衍生的树突状细胞(mo-dc)中hox40l的表达。图15a：将bhk21细胞模拟感染，或用mvaδc7l-hflt3l或用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以10的moi感染。在感染后24h收集细胞，并且用pe缀合的抗hox40l抗体进行染色，之后进行facs分析。图15b：将人modc用10μg/ml的聚i:c处理，或用热imva、mvaδc7l-tk(-)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以1的moi感染。在感染后24h，收集细胞并用pe缀合的抗hox40l抗体进行染色，之后进行facs分析。将未经处理的鼠b16-f10黑色素瘤细胞用作阴性对照。

图16a和图16b是数据的一系列图形表示，其示出了mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l感染的bhk21(图16a)和b16-f10细胞(图16b)中的hox40lmrna水平。将bhk21或b16-f10细胞用mva或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以10的moi感染。在感染后8h和16h，收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查病毒e3l基因和hox40l基因的表达。

图17是示出了构建痘苗病毒病毒早期基因表达质粒的工作流程的示意图。选择了72个病毒早期基因。进行pcr以从痘苗病毒基因组中扩增目的基因。通过第二轮pcr将衔接子添加到pcr产物的两端。然后将dna片段克隆到pdonr^tm/zeo中，然后克隆到哺乳动物表达载体pcdna^tm3.2-dest中。随后通过测序验证dna构建体。然后将质粒dna用于与其他质粒一起转染到hek-293t细胞中，这将在下面描述。

图18示出了双萤光素酶筛选策略。在hek293t细胞中，将cgas和sting表达质粒与ifn-β萤光素酶质粒和prl-tk共转染。将病毒基因表达质粒或载体一起转染。24h后，测量萤光素酶信号。通过将萤火虫萤光素酶活性相对于海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。

图19a至图19c示出了抑制cgas/sting依赖性ifnβ-luc活性的痘苗病毒orf的双萤光素酶筛选结果。图19a至图19c：将hek293t细胞用表达ifnβ-luc报告物、鼠cgas、人sting和如所指示的痘苗病毒orf的质粒转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。将腺病毒e1a基因用作阳性对照。

图20a至图20e.痘苗病毒b18、e5、k7、c11和b14抑制cgas/sting诱导的ifnβ启动子活性。将hek293t细胞用如所指示的ifnb萤光素酶报告物、cgas、sting和表达质粒转染，并且在转染后24h测定萤光素酶活性。图20a：将小鼠cgas与表达质粒共转染。图20b：将人cgas与表达质粒共转染。图20c：将小鼠cgas与k7r、e5r、b14r、c11r和b18r的flag标记的痘苗orf共转染。图20d和20e是示出了通过热imva感染(图20d)或isd处理(图20e)在过表达e5、b14、k7或b18的细胞中对ifnb的诱导的图表。

图21示出了抑制cgas/sting依赖性ifnβ-luc活性的痘苗病毒orf的另外的双萤光素酶筛选结果。将hek293t细胞用表达ifnβ-luc报告物、鼠cgas、人sting和如所指示的痘苗病毒orf的质粒转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。将腺病毒e1a基因用作阳性对照。

图22示出了如seqidno:1中列出并由genbank登录号u94848.1给出的mva基因组序列。

图23示出了如seqidno:2中列出并由genbank登录号ay243312.1给出的痘苗病毒(西部保留地(westernreserve)毒株；wr)基因组序列。

图24a和图24b是示出了痘苗病毒和重组病毒(包括e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l和vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l)在鼠b16-f10黑色素瘤细胞中的多步生长的两个图。图24a是这些病毒在b16-f10细胞中的多步生长。简言之，将b16-f10细胞用上述病毒以0.1的moi感染。在感染后1h、24h、48h和72h收集细胞，并且通过在bsc40细胞上滴定来确定病毒产量(logpfu)。将病毒产量对感染后小时数作图。图24b示出了感染后72h相对于感染后1h的病毒滴度的对数(倍数变化)。

图25示出了在e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4或e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l病毒感染的鼠b16-f10黑色素瘤细胞中抗mctla-4抗体、鼠ox40l和人flt3l表达的蛋白质印迹分析。将b16-f10细胞用e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4或e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l病毒以10的moi感染或模拟感染。在感染后7h、24h和48h收集细胞裂解物，并且使用10％sds-page分离细胞裂解物中的多肽。使用hrp缀合的抗小鼠igg(重链和轻链)、抗mox40l抗体和抗人flt3l抗体分别检测抗mctla-4抗体、鼠ox40l和人flt3l蛋白。

图26示出了在e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗mctla-4/c7l^--mox40l病毒感染的鼠b16-f10黑色素瘤细胞中鼠ox40l蛋白的表面表达。简言之，将b16-f10细胞用e3lδ83n-tk^-载体、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^-载体、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗mctla-4/c7l^--mox40l病毒以5的moi感染或模拟感染。在感染后24h收集细胞，并且用pe缀合的抗mox40l抗体进行染色，并且通过facs进行分析。用flowjo软件(flowjo，becton-dickinson，富兰克林湖，新泽西州)分析数据。

图27示出了b16-f10鼠黑色素瘤单侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹。肿瘤植入后九天，每周两次瘤内注射4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40l。腹膜内给予250μg的抗pd-l1抗体/小鼠。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。

图28a至图28c是数据的图形表示，其示出了在pbs(图28a)、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(图28b)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体(图28c)治疗后的天数内的肿瘤体积。

图29a和图29b展示了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗的小鼠的存活研究。图29a是用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗进行治疗的荷瘤小鼠的kaplan-meier存活曲线的图。(n＝5～10，**p<0.01；***p<0.001；mantel-cox检验)。图29b是示出了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗的小鼠的中位存活期的表。

图30示出了mc38单侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将5x10⁵个mc38黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹。肿瘤植入后九天，每周两次瘤内注射4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40l。腹膜内给予250μg的抗pd-l1抗体/小鼠。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。

图31a至图31c是数据的图形表示，其示出了在pbs(图31a)、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(图31b)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体(图31c)治疗后的天数内的肿瘤体积。

图32a和图32b展示了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗的小鼠的存活研究。图32a是用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗进行治疗的荷瘤小鼠的kaplan-meier存活曲线的图。(n＝4～8，**p<0.01；***p<0.001；mantel-cox检验)。图32b是示出了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗的小鼠的中位存活期的表。

图33示出了mb49单侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将2.5x10⁵个mb49黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹。肿瘤植入后八天，每周两次瘤内注射4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40l。腹膜内给予250μg的抗pd-l1抗体/小鼠。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。

图34a至图34d是数据的图形表示，其示出了在pbs(图34a)、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(图34b)、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体(图34v)或抗pd-l1抗体(图34d)治疗后的天数内的肿瘤体积。

图35a和图35b展示了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体或抗pd-l1抗体治疗进行治疗的小鼠的存活研究。图35a是用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体或抗pd-l1抗体治疗进行治疗的荷瘤小鼠的kaplan-meier存活曲线的图。(n＝10，*p<0.05，**p<0.01；***p<0.001；mantel-cox检验)。图35b是示出了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体或抗pd-l1抗体治疗的小鼠的中位存活期的表。

图36示出了从雌性mmtv-pyvmt小鼠分离的肿瘤的代表性图。简言之，在以92日龄的平均潜伏期发展出可触及的乳腺肿瘤后，每周两次用pbs、4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的瘤内注射对小鼠进行治疗。每周两次腹膜内给予250μg的抗pd-l1抗体/小鼠。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。

图37是数据的图形表示，其示出了在pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1抗体治疗后的天数内的肿瘤体积。(p0–pbs；v1–mvaδc7l-hflt3l-muox40l；c1、c2、c3–mvaδc7l-hflt3l-muox40l+抗pd-l1)。

图38示出了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l+抗pd-l1抗体治疗后，注射和未注射肿瘤中cd8⁺和cd4⁺t细胞的代表性点图。

图39示出了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l+抗pd-l1抗体治疗后，注射和未注射肿瘤中cd8⁺cd69⁺cd103⁺t细胞的代表性点图。

图40示出了用pbs、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l+抗pd-l1抗体治疗后，注射和未注射肿瘤中cd4⁺cd69⁺cd103⁺t细胞的代表性点图。

图41a和图41b是示出了b16-f10-hflt3l或b16-f10-mox40l稳定细胞系对hflt3l(图41a)或mox40l(图41b)的表达的代表性facs图。

图42是b16-f10双侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹，并且将5x10⁵个b16-f10-hflt3l黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹。肿瘤植入后九天，每周两次向两个侧腹上的肿瘤瘤内注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l。第二次注射后2天收获肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞(til)。

图43a至图43d是数据的图形表示，其示出了在pbs或mvaδc7l治疗后的天数内c57b/6j小鼠右侧腹或左侧腹中肿瘤的体积。

图44a至图44e是在pbs或mvaδc7l治疗后肿瘤浸润cd8⁺(图44a)、cd8⁺颗粒酶b⁺(图44b)、cd4⁺(图44c)、cd4⁺颗粒酶b⁺(图44d)和cd4⁺foxp3⁺(图44e)t细胞百分比的图。(n＝5，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；单因素方差分析)。

图45a至图45e是在pbs、mvaδc7l治疗后肿瘤浸润cd8⁺(图45a)、cd8⁺颗粒酶b⁺(图45b)、cd4⁺(图45c)、cd4⁺颗粒酶b⁺(图45d)、cd4⁺foxp3⁺(图45e)t细胞绝对数量/克肿瘤的图。(n＝5，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；单因素方差分析)。

图46是b16-f10双侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹，并且将5x10⁵个b16-f10-ox40l黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹。肿瘤植入后九天，每周两次向两个侧腹上的肿瘤瘤内注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l。第二次注射后2天收获肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞(til)。

图47a至图47d是数据的图形表示，其示出了在pbs或mvaδc7l治疗后的天数内c57b/6j小鼠右侧腹或左侧腹中肿瘤的体积。

图48a至图48e是在pbs、mvaδc7l治疗后肿瘤浸润cd8⁺(图48a)、cd8⁺颗粒酶b⁺(图48b)、cd4⁺(图48c)、cd4⁺颗粒酶b⁺(图48d)、cd4⁺foxp3⁺(图48e)t细胞百分比的图。(n＝5，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；单因素方差分析)。

图49a至图49e是在pbs、mvaδc7l治疗后肿瘤浸润cd8⁺(图49a)、cd8⁺颗粒酶b⁺(图49b)、cd4⁺(图49c)、cd4⁺颗粒酶b⁺(图49d)、cd4⁺foxp3⁺(图49e)t细胞绝对数量/克肿瘤的图。(n＝5，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；单因素方差分析)。

图50a和图50b示出了fty720的作用机制及其化学结构。图50a改编自gong等人front.immunol.(2014),tcellscirculatebetweenlymphoidorgansandblood的附图。感染或肿瘤植入后，抗原呈递细胞呈递抗原以引发同源t细胞，所述同源t细胞然后增殖并分化为效应t细胞和记忆t细胞。效应t细胞被募集到感染或肿瘤的部位，并且记忆t细胞再循环。鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂fty720(图50b)阻断淋巴细胞自淋巴器官的离去。

图51是b16-f10单侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹。肿瘤植入后九天，两次瘤内注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l。从第一次mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l注射前1天开始，在治疗期间每日腹膜内给予25μg的fty720/小鼠。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。

图52a至图52d是数据的图形表示，其示出了在使用或不使用fty720治疗的情况下在pbs或mvaδc7l治疗后的天数内c57b/6j小鼠中肿瘤的体积。

图53a和图53b是数据的图形表示，其示出了在使用或不使用fty720治疗的情况下在pbs或mvaδc7l治疗后的天数内c57b/6j小鼠中肿瘤的体积。

图53c和图53d是在使用或不使用fty720的情况下用pbs或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l治疗的荷瘤小鼠的kaplan-meier存活曲线的图(n＝5～10，**p<0.01；***p<0.001；mantel-cox检验)。

图54a和图54b示出了痘病毒家族中痘苗e5的结构域组构和序列保守性。图54a是痘苗e5的示意图。e5是328个氨基酸的蛋白质，其由n末端结构域接着是两个ben结构域构成。ben因其在banp/smar1、痘病毒e5r和nac1中的存在而得名。含ben结构域的蛋白质参与染色质组构、转录调控，并可能参与病毒dna组构。图54b是证明痘苗e5在痘病毒家族中高度保守的示意图。

图55a至图55c显示，vacvδe5r在鼻内感染模型中高度减毒。图55a示出了用于通过在痘苗基因组的侧接e5r基因的e4l和e6r基因座处的同源重组而产生vacvδe5r病毒的方案。图55b示出了用wtvacv(2x10⁶pfu)、vacvδe5r(2x10⁶pfu)或vacvδe5r(2x10⁷pfu)鼻内感染后的天数内的重量减轻。图55c示出了用wtvacv(2x10⁶pfu)或vacvδe5r(2x10⁶pfu或2x10⁷pfu)感染的小鼠的kaplan-meier存活曲线。

图56a和图56b证明，用vacvδe5r感染bmdc诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。图56a示出了在以10的moi感染mva、vacv或vacvδe5r的bmdc的rt-pcr结果。在感染后8h收集细胞。提取rna并进行rt-pcr。图56b显示，将bmdc以10的moi感染mva、vacv或vacvδe5r。在感染后21h收集上清液。通过elisa确定ifn-β蛋白水平。

图57a至图57d示出了在bmdc和bmdm中通过mvaδe5r和mvaδk7r进行的ifnb基因诱导。图57a示出了用于通过在mva基因组的侧接e5r基因的e4l和e6r基因座处的同源重组而产生mvaδe5r病毒的方案。图57b示出了用于通过在mva基因组的侧接k7r基因的k5,6l和f1l基因座处的同源重组而产生mvaδk7r病毒的方案。图57c显示，将bmdc用mva、mvaδe5r或mvaδk7r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。通过rt-pcr测量ifnb基因表达。图57d显示，将bmdm用mva、mvaδe5r或mvaδk7r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。通过rt-pcr测量ifnb基因表达。

图58a至图58c显示，将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。通过定量rt-pcr确定ifna(图58a)、ccl4(图58b)和ccl5(图58c)基因表达。

图59a至图59c显示，bmdc的mvaδe5r感染从bmdc诱导高水平的ifnb和病毒e3r基因表达和ifn-β蛋白分泌。图59a和图59b示出了通过mvaδe5r或热灭活的mvaδe5r(“热imvaδe5r”)诱导的ifnb(图59a)和病毒e3r(图59b)基因表达的实时定量pcr(rt-pcr)分析。通过在mgm-csf存在下培养骨髓细胞产生bmdc。将细胞用mvaδe5r或热imvaδe5r病毒以0.25、1、3或10的moi感染。1h感染后洗涤细胞并添加新鲜培养基。在感染后14h收集细胞。通过rt-pcr确定ifnb和e3基因表达。图59c将bmdc用mvaδe5r或热imvaδe5r病毒以0.25、1、3或10的moi感染。在感染后14h收集上清液。通过elisa测量上清液中ifn-β的浓度。

图60a至图60d显示，mvaδe5r诱导的ifnb基因表达和ifn-β分泌依赖于cgas。图60a示出了在wt和cgas^-/-bmdc中通过mvaδe5r进行的ifna诱导。图60b示出了在wt和cgas^-/-bmdc中通过mvaδe5r进行的ifna诱导。图60c示出了在用mvaδe5r感染的wt和cgas^-/-bmdc中的痘苗e3r基因表达。将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。提取rna。进行实时定量pcr分析。图60d显示，与热imva或热imvaδe5r相比，mvaδe5r诱导更高水平的ifn-β蛋白分泌，并且所述诱导完全依赖于cgas。将wt或cgas^-/-bmdc用mva、mvaδe5r以10的moi感染，用热imva或热imvaδe5r以moi的等效量感染。在感染后8h和16h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β蛋白水平。

图61a和图61b显示，mvaδe5r诱导的来自bmdc的ifnb基因表达和蛋白质分泌依赖于sting。图61a显示，将来自wt或sting^gt/gt小鼠的bmdc用mva、mvaδe5r或热imvaδe5r感染。在感染后8h收集细胞并进行rt-pcr分析。示出了ifnb基因表达的倍数诱导。图61b显示，通过在m-csf(巨噬细胞集落刺激因子)存在下培养来自wt和sting^gt/gt小鼠的骨髓细胞来产生骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)。将bmdm用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后16h收集上清液，并且通过elisa测量ifn-β蛋白水平。

图62a至图62d显示，mvaδe5r诱导的ifn-β蛋白分泌需要irf3、irf7和ifnar。图62a显示，将wt或irf3^-/-bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后8h和16h收集上清液。通过elisa确定ifn-β水平。图62b显示，将wt或irf3^-/-bmdm用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后8h和16h收集上清液。通过elisa确定ifn-β水平。图62c显示，将wt或irf7^-/-bmdc用mvaδe5r以10的moi感染。在感染后21h收集上清液。通过elisa确定上清液中的ifn-β水平。图62d显示，将wt、cgas^-/-或ifnar^-/-bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后16h收集上清液。通过elisa确定ifn-β水平。

图63a至图63c证明，wtvacv诱导的cgas降解是通过蛋白酶体依赖性途径介导的。图63a显示，将鼠胚胎成纤维细胞用环己酰亚胺(chx)、蛋白酶体抑制剂mg132、泛半胱天冬酶抑制剂z-vad或akt1/2抑制剂viii预处理30min。然后将mef在每种药物存在下用wtvacv感染。在感染后6h收集细胞。用抗cgas和抗gapdh抗体进行蛋白质印迹分析。图63b显示，将mef用dmso或mg132处理。在处理后2h、4h和6h收集细胞。用抗cgas和抗gapdh抗体进行蛋白质印迹分析。图63c证明，bmdc的wtvacv感染导致cgas降解，而vacvδe5r并没有。在mg132存在下，wtvacv诱导的cgas降解被阻断。将bmdc在存在或不存在mg132的情况下用wtvacv或vacv以10的moi感染。在感染后2h、4h和6h收集细胞。使用抗cgas和抗gapdh抗体进行蛋白质印迹分析。

图64证明，mva中的e5r基因在介导bmdc中的cgas降解中是重要的。将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后2h、4h、6h、8h和12h收集细胞。使用抗cgas和抗gapdh抗体进行蛋白质印迹分析。

图65证明，与mva相比，mvaδe5r诱导更高水平的磷酸化stat2。将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后2h、4h、6h、8h和12h收集细胞。使用抗磷酸-stat2、抗stat2和抗gapdh抗体进行蛋白质印迹分析。

图66显示，mvaδe5r在感染的bmdc中诱导高水平的cgamp产生。将2.5x10⁶个bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后2h、4h、6h和8h收集细胞。通过将细胞裂解物与透化分化的thp1-dual^tm细胞一起孵育来测量cgamp浓度，所述细胞通过稳定整合两种诱导型报告构建体而衍生自人thp-1单核细胞细胞系。在24h收集上清液，并且测量萤光素酶活性(作为irf途径激活的指示)。通过与cgamp标准品进行比较来计算cgamp水平。

图67a和图67b显示，mvaδe5r从浆细胞样树突状细胞诱导ifn-β蛋白分泌。图67a显示，将从脾细胞中分选的1.2x10⁵个pdc(b220⁺pdca-1⁺)用mva、热imva或mvaδe5r感染。包括未感染的脾细胞作为对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。图67b显示，将从flt3l-bmdc中分选的4x10⁵个pdc(b220⁺pdca-1⁺)用mva、热imva或mvaδe5r感染。包括未感染的分选pdc作为对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。

图68显示，mvaδe5r诱导的来自pdc的ifn-β分泌依赖于cgas。从获自wt、cgas^-/-或myd88^-/-小鼠的flt3l培养的bmdc(b220⁺pdca-1⁺)中分选pdc。将2x10⁵个细胞用mva或mvaδe5r感染。包括nt对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。

图69显示，mvaδe5r感染通过cgas依赖性途径从cd103⁺dc诱导ifn-β蛋白分泌。从获自wt、cgas^-/-或myd88^-/-小鼠的flt3l培养的bmdc(cd11c⁺cd103⁺)中分选cd103⁺dc。将2x10⁵个细胞用mva或mvaδe5r感染。包括nt对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。

图70显示，与mva相比，bmdc的mvaδe5r感染导致更低水平的细胞死亡。将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。感染后16h收获细胞，并且用live/dead可固定活力染料进行染色，并且进行流式细胞术分析。

图71a和图71b显示，mvaδe5r感染以cgas依赖性方式促进dc成熟。将来自wt和cgas^-/-小鼠的bmdc用mva-ova或mvaδe5r-ova以10的moi感染。在感染后16h收集细胞，并且针对dc成熟标记cd40(图71a)和cd86(图71b)进行染色。

图72a至图72g显示，bmdc的mvaδe5r感染促进抗原交叉呈递，如通过t细胞激活所测量的。将bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r以3的moi感染3h，然后与ova一起孵育3h。将ova洗掉，然后将细胞与ot-i细胞(其识别ova257-264siinfekl肽)一起孵育3天。将ot-1细胞用抗cd69和抗cd8抗体进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。收集上清液并通过elisa确定ifn-γ水平。点图展示了表达cd69的cd8+细胞。

图73显示，bmdc的mvaδe5r感染促进抗原交叉呈递，如通过激活的t细胞的ifn-γ产生所测量的。将bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r以3的moi感染3h，然后与ova一起孵育3h。将ova洗掉，然后将细胞与ot-i细胞(其识别ova257-264siinfekl肽)一起孵育3天。将ot-1细胞用抗cd69和抗cd8抗体进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。收集上清液并通过elisa确定ifn-γ水平。图73示出了bmdc:t细胞共培养物的上清液中的ifn-γ水平。

图74显示，bmdc的vacvδe5r感染促进抗原交叉呈递，如通过激活的t细胞的ifn-γ产生所测量的。将bmdc用mva、mvaδe5r或vacvδe5r以3的moi感染3h；或者将bmdc与cgamp或模拟对照一起孵育3h。随后将bmdc与ova一起孵育3h，然后将ova洗掉。然后将细胞与ot-i细胞(其识别ova257-264siinfekl肽)一起孵育3天。收集上清液并通过elisa确定ifn-γ水平。

图75a至图75c显示，从mva中缺失e5r基因改善疫苗接种功效。图75a是疫苗接种策略的方案。在第0天，通过皮肤划痕或皮内注射用2x10⁷pfu的mva-ova或mvaδe5r-ova对c57bl/6j小鼠进行疫苗接种。一周后从被实施安乐死的小鼠中收获脾，并且将其与ova257-264(siinfekl)肽(10μg/ml)脉冲处理的bmdc共培养12h。然后通过流式细胞术测量cd8⁺t细胞中的细胞内ifn-γ水平。(*p<0.05；**p<0.01)。图75b示出了通过皮肤划痕用mva-ova或mvaδe5r-ova疫苗接种后的激活的cd8⁺t细胞。图75c示出了通过皮内注射疫苗接种mva-ova或mvaδe5r-ova后的激活的cd8⁺t细胞。

图76a和图76b显示，mvaδe5r感染以cgas依赖性方式从鼠原代成纤维细胞诱导ifnb基因表达和ifn-β分泌。从雌性wt和cgas^-/-c57bl/6j小鼠产生皮肤真皮成纤维细胞。将细胞用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后16h收集细胞和上清液。图76a示出了wt和cgas^-/-细胞中ifnb基因表达的rt-pcr结果。图76b示出了感染wt和cgas^-/-细胞的上清液中的ifn-β蛋白水平，如通过elisa所测量的。

图77a至图77d显示，mvaδe5r获得在cgas或ifnar1缺陷型皮肤原代真皮成纤维细胞中复制其dna的能力。将来自wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-小鼠的皮肤原代真皮成纤维细胞用mva或mvaδe5r以3的moi感染。在感染后1h、4h、10h和24h收集细胞。通过定量pcr确定病毒dna拷贝数。图77a示出了mva感染的wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-皮肤真皮成纤维细胞中的dna拷贝数。图77b示出了与在用mva感染后1h的dna拷贝数相比的倍数变化。图77c示出了mvaδe5r感染的wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-皮肤真皮成纤维细胞中的dna拷贝数。图77d示出了与在用mvaδe5r感染后1h的dna拷贝数相比的倍数变化。

图78a至图78d显示，mvaδe5r获得在cgas缺陷型皮肤原代真皮成纤维细胞中产生感染性后代病毒的能力。将来自wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-小鼠的皮肤原代真皮成纤维细胞用mva或mvaδe5r以0.05的moi感染。在感染后1h、24h和48h收集细胞。通过在bhk21细胞上滴定来确定病毒滴度。图78a示出了在wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-皮肤真皮成纤维细胞中感染后随时间推移的mva滴度。图78示出了与在用mva感染后1h的病毒滴度相比的倍数变化。图78c示出了在wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-皮肤真皮成纤维细胞中感染后随时间推移的mvaδe5r滴度。图78d示出了与在用mvaδe5r感染后1h的病毒滴度相比的倍数变化。

图79a和图79b显示，鼠黑色素瘤细胞的mvaδe5r感染以sting依赖性方式诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。图79a示出了在wtb16-f10鼠黑色素瘤细胞和sting^-/-b16-f10细胞中通过mvaδe5r进行的ifnb诱导的rt-pcr结果。将wt和sting^-/-b16-f10细胞用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后18h收集细胞。提取rna并进行定量实时pcr分析。图79b示出了在感染后18h收集的用mva或mvaδe5r感染的wt和sting^-/-b16-f10细胞的上清液中ifn-β蛋白水平的elisa结果。

图80显示，鼠黑色素瘤细胞的mvaδe5r感染诱导atp释放，其是免疫原性细胞死亡的标志。将b16-f10细胞用wt痘苗、mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后48h收集上清液。通过使用atplite1步发光atp检测测定系统(perkinelmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)确定atp水平。

图81示出了通过在mva基因组的e4l和e6r基因座处的同源重组而产生表达hflt3l和hox40l的重组mvaδe5r的方案。使用puc57载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达hflt3l和hox40l二者的单一表达盒。hflt3l和hox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列的盒分隔开。在e4l和e6r基因座处发生的同源重组导致hflt3l和hox40l的表达盒的插入。

图82a和图82b显示，重组mvaδe5r-hflt3l-hox40l病毒具有预期插入，如通过pcr分析所确定的。泳道1示出了fermentas1kbplusdna梯状标志。泳道2示出了使用f0/r5引物对的预期大小为1120bp的条带。泳道3示出了使用f2/r2引物对的预期大小为1166bp的条带。泳道4示出了使用f5/r0引物对的预期大小为1136bp的条带。

图83a至图83c显示，mvaδe5r-hflt3l-hox40l病毒在感染的细胞的表面上表达hflt3l和hox40l二者。图83a是用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染24h的bhk21细胞的hflt3l表达(在y轴上)和hox40l表达(在x轴上)的facs分析的点图。将细胞以10的moi感染。包括模拟感染即无病毒对照。图83b是用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染24h的鼠b16-f10黑色素瘤的hflt3l表达(在y轴上)和hox40l表达(在x轴上)的facs分析的点图。将细胞以10的moi感染。包括模拟感染即无病毒对照。图83c是用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染24h的人黑色素瘤细胞sk-mel28的hflt3l表达(在y轴上)和hox40l表达(在x轴上)的facs分析的点图。将细胞以10的moi感染。包括模拟感染即无病毒对照。

图84示出了在mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染的bhk21细胞中hflt3l和hox40l的表达的蛋白质印迹结果。将bhk21细胞模拟感染，或用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染。在感染后24h收集细胞裂解物。使用抗hflt3l和抗hox40l抗体进行蛋白质印迹分析。

图85a和图85b示出了产生vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l的方案。图85a示出了具有单一表达盒的pcb载体的示意图，所述单一表达盒被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达抗体的重链和轻链。9d9的重链(muigg2a)和轻链的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，以使得能够进行核糖体跳跃。pcb质粒含有在任一侧上侧接有胸苷激酶(tk)基因的在痘苗pse/l控制下的抗mu-ctla-4基因以及在痘苗p7.5启动子控制下的大肠杆菌(e.coli)黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。通过在pcb质粒dna与病毒基因组dna之间在tk基因座处的同源重组来产生从tk基因座表达抗mu-ctla-4的重组病毒。图85b是使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)在单一表达盒中表达作为融合蛋白的人flt3l和鼠ox40l二者的示意图。人flt3l和鼠ox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开。构建了含有在任一侧上侧接有e4l和e6r基因的人flt3l和鼠ox40l融合基因的puc57质粒。通过在puc57质粒与病毒基因组dna之间在e4l和e6r基因座处的同源重组来产生从e5r基因座表达人flt3l和鼠ox40l融合蛋白的重组病毒。

图86a至图86c示出了用于验证重组痘苗病毒vacv-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l的pcr分析的方案和结果，以及关于用重组病毒感染的细胞的抗ctla-4抗体表达的蛋白质印迹结果。图86a示出了用于从puc57表达质粒的插入表达盒中扩增不同基因片段的引物的示意图。使用引物对f1/r1产生2795bppcr片段，其含有整个表达盒。还使用该引物对检查重组病毒的纯度。使用引物对f0/r5确认将表达盒插入病毒基因组中的正确位置中。使用引物对f1/r3或fo/r2从vacv-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l扩增人flt3l基因。使用引物对f4/r1产生鼠ox40l基因。最后，使用pcb-r4和tk-f5引物对从vacv-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l或mva-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l重组病毒产生插入tk基因座中的抗mu-ctla-4基因。图86b示出了使用图86a中描述的引物对的pcr结果的凝胶图像和展示用引物对扩增的dna片段的预测大小的表。图86c示出了模拟感染或用e3lδ83n-tk^-载体、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4-c7l^--mox40l、vacv、vacv-tk^--抗muctla-4-c7l^--mox40l或vacv-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l以10的moi感染的人sk-mel-28黑色素瘤细胞的蛋白质印迹结果。在感染后24小时收集细胞裂解物，并且使用10％sds-page分离多肽。使用hrp连接的抗小鼠igg(重链和轻链)抗体检测抗muctla-4抗体的全长(fl)、重链(hc)和轻链(lc)。

图87示出了来自痘病毒家族的多个成员的e5直系同源物的蛋白质序列比对。

图88a示出了来自痘苗病毒和改良安卡拉痘苗病毒(mva)的e5的蛋白质序列比对。图88b示出了来自痘苗病毒和粘液瘤病毒的e5的蛋白质序列比对。

图89a和图89b显示，粘液瘤病毒m31r抑制cgas和sting诱导的ifn-β途径。图89a显示，将hek293t细胞用表达鼠cgas、人sting的质粒与表达e5r、m31r或pcdna载体对照的质粒一起转染。24h后，确定萤光素酶信号。图89b显示，将hek293t细胞用表达鼠sting的质粒与表达e5r、m31r或pcdna载体对照的质粒一起转染。24h后，确定萤光素酶信号。

图90a和图90b显示，痘苗e5促进cgas泛素化。图90a显示，将hek293t细胞用flag-cgas和ha-泛素转染。24h后，将细胞用wtvacv或vacvδe5r感染。6h后收集细胞裂解物。用抗flag抗体免疫沉淀cgas，并且通过抗ha抗体检测泛素化。图90b示出了全细胞裂解物(wcl)中cgas和β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析。

图91a至图91c是数据的图形表示，其显示在鼠b16-f10黑色素瘤单侧肿瘤植入模型中itmvaδe5r延迟肿瘤生长并延长存活期。图91a是b16-f10单侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹。肿瘤植入后八天，每周两次瘤内注射pbs、4x10⁷pfu的mva、mvaδe5r或热imva。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活。图91b是用pbs、mva、mvaδe5r或热imva治疗进行治疗的荷瘤小鼠的kaplan-meier存活曲线的图。(n＝5，*p<0.05；**p<0.01；mantel-cox检验)。图91c是示出了用pbs、mva、mvaδe5r或热imva治疗的小鼠的中位存活期的表。

图92a至图92e显示，与mvaδe5r相比，bmdc的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染导致更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。图92a至图92c示出了产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r病毒的示意图。第一步涉及通过在c8l和c6r基因座处同源重组，从而用在pse/l启动子控制下的hflt3l替换c7l基因来产生mvaδc7l-hflt3l(图92a)。第二步涉及通过在tk基因座处同源重组，从而用在pse/l启动子控制下的mox40l替换tk基因来产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(图92b)。所得病毒在图5a和图5b中描述。第三步是通过在e4l和e6r基因座处同源重组，从而用在p7.5启动子控制下的mcherry替换e5r基因来产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r(图92c)。图92d示出了在用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染的bmdc中ifnb基因表达的rt-pcr结果。将wt和ifnar^-/-bmdc模拟感染或用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r以10的moi感染。在感染后16h收集细胞并进行rt-pcr。图92e示出了在用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染的bmdc的上清液中ifn-β蛋白水平的elisa结果。将wt和ifnar^-/-bmdc模拟感染或用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r以10的moi感染。在感染后16h收集上清液，并且进行elisa以测量ifn-β蛋白水平。

图93a和图93b示出了产生mvaδc7lδe5r-hflt3l-mox40l和mvaδc7l-ova-δe5r-hflt3l-mox40l的方案。图93a示出了产生mvaδc7lδe5r-hflt3l-mox40l的方案。构建puc57质粒，以使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)在单一表达盒中表达作为融合蛋白的人flt3l和鼠ox40l二者。人flt3l和鼠ox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开。通过在puc57质粒与mvaδc7l病毒基因组之间在e4l和e5r基因座处的同源重组来产生从e5r基因座表达人flt3l和鼠ox40l融合蛋白的重组病毒。图93b示出了产生mvaδc7l-ova-δe5r-hflt3l-mox40l的方案。通过在puc57质粒与mvaδc7l-ova病毒基因组之间在e4l和e5r基因座处的同源重组来产生从e5r基因座表达人flt3l和鼠ox40l融合蛋白的重组病毒。

图94a和图94b.图94a：用isre-萤火虫萤光素酶报告物、表达海肾萤光素酶的对照质粒prl-tk与表达粘液瘤m62r、粘液瘤m62r-ha、粘液瘤m64r、粘液瘤m64r-ha、痘苗c7l的或对照质粒一起转染的hek293t细胞的双萤光素酶测定。转染后24h，将细胞在收获之前再用ifn-β处理24h。图94b：用ifnb-萤火虫萤光素酶报告物、表达海肾萤光素酶的对照质粒prl-tk和表达sting的质粒与表达粘液瘤m62r、粘液瘤m62r-ha、粘液瘤m64r、粘液瘤m64r-ha、痘苗c7l的或对照质粒一起转染的hek293t细胞的双萤光素酶测定。转染后24h收获细胞。

图95示出了通过在mva基因组的e4l和e6r基因座处的同源重组而产生表达hflt3l和mox40l的重组mvaδe5r的方案。使用puc57载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达hflt3l和mox40l二者的单一表达盒。hflt3l和mox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列的盒分隔开。在e4l和e6r基因座处发生的同源重组导致hflt3l和mox40l的表达盒的插入。

图96a和图96b显示，mvaδe5r-hflt3l-mox40l病毒在感染的细胞的表面上表达hflt3l和mox40l二者。图96a示出了bhk21细胞、鼠黑色素瘤细胞b16-f10或人黑色素瘤细胞sk-mel28的hflt3l表达(在y轴上)和mox40l表达(在x轴上)的facs分析的点图。将细胞用mva或mvaδe5r-hflt3l-mox40l以10的moi感染24h。包括无病毒模拟感染对照。图96b示出了在用mva、mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs感染的感染bhk21、b16-f10和sk-mel28细胞上人flt3l和鼠ox40l的中等荧光强度(mfi)的图。

图97至图102是数据的一系列图形表示，其显示在b16-f10双侧肿瘤模型中，与mva、mvaδe5r或热imva相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l在注射和未注射的远端肿瘤中以及在脾中产生更多激活的肿瘤浸润效应t细胞。图97示出了实验方案。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，将2x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l、mva、mvaδe5r、等效量的热imva、或pbs向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射两次，间隔三天。在第二次注射后2天收获脾，进行elispot分析以评价脾中的肿瘤特异性t细胞。还分离了注射和未注射肿瘤二者，并且通过facs分析了肿瘤浸润淋巴细胞。

图98a至图98b.通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和脾细胞(1,000,000个)来进行elispot测定。图98a示出了从左到右一式三份样品的elispot的图像。图98b示出了每1,000,000个经纯化的cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的图。每个条表示来自单独小鼠的脾样品(n＝3-8)(*p<0.05；**p<0.01，t检验)。

图99a至图99c.图99a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图99b示出了cd3⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图99c示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图100a至图100c.图100a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图100b示出了cd3⁺细胞中cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(*p<0.05；t检验)。图100c示出了cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图101a至图101c.图101a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图101b示出了cd3⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(****p<0.000，t检验)。图101c示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)(*p<0.05；****p<0.0001，t检验)。

图102a至图102c.图102a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图102b示出了cd3⁺细胞中cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(**p<0.01，t检验)。图102c示出了cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)(*p<0.05；**p<0.01；****p<0.0001，t检验)。

图103a至图104c是数据的一系列图形表示，其显示瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l减少了注射肿瘤中的foxp3⁺cd4⁺调节性t细胞，但未减少未注射肿瘤中的。图103a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，注射肿瘤中foxp3⁺cd4⁺细胞的代表性点图。图103b示出了cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图103c示出了foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(*p<0.05，t检验)。图104a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中foxp3⁺cd4⁺细胞的代表性点图。图104b示出了cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。图104c示出了foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。

图105a至图109c是数据的一系列图形表示，其显示瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l优先减少注射肿瘤中的ox40⁺foxp3⁺cd4⁺调节性t细胞。图105a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺细胞的代表性点图。图105b示出了注射肿瘤中的cd4⁺细胞中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图105c示出了ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(*p<0.05，t检验)。

图106a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺细胞的代表性点图。图106b示出了cd4⁺细胞中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。图106c示出了ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。

图107a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中ox40⁺foxp3^-cd4⁺细胞的代表性点图。图107b示出了cd4⁺细胞中ox40⁺foxp3^-cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。图107c示出了ox40⁺foxp3^-cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。

图108示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、热imva或pbs治疗后，未注射肿瘤中ox40⁺cd8⁺细胞的代表性点图。

图109a至图109c是数据的一系列图形表示，其显示与mvaδe5r相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中foxp3⁺cd4⁺调节性t细胞的更多减少。图109a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、mvaδe5r或pbs治疗后，注射肿瘤中foxp3⁺cd4⁺细胞的代表性点图。图109b示出了注射肿瘤中的cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(*p<0.05；**p<0.01，t检验)。图109c示出了foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-9)。(**p<0.01，t检验)。

图110至图115c是数据的一系列图形表示，其显示在b16-f10双侧鼠黑色素瘤模型中，与wt小鼠相比，在ox40^-/-小鼠中瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l在注射和未注射的远端肿瘤中产生更多激活的肿瘤浸润效应cd8⁺和cd4⁺t细胞。图110示出了实验方案。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后十天，向右侧腹上的较大肿瘤进行两次mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs的瘤内注射(4x10⁷pfu)，间隔三天。在第二次注射后2天收获注射和未注射的远端肿瘤二者，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞。

图111a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图111b示出了cd3⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图111c示出了cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图111d示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图111e示出了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。

图112a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图112b示出了cd3⁺细胞中cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图112c示出了cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图112d示出了cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图112e示出了颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。

图113a显示，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l未能减少来自ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中的foxp3⁺cd4⁺t细胞。用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图113b示出了cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。

图114a至图115c证明，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l减少来自wt小鼠的注射肿瘤中的ox40⁺foxp3⁺cd4⁺和ox40⁺foxp3^-cd4⁺t细胞。图114a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图114b示出了cd4⁺细胞中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图114c示出了ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。

图115a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中ox40⁺foxp3^-cd4⁺t细胞的代表性点图。图115b示出了cd4⁺细胞中ox40⁺foxp3^-cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。图115c示出了ox40⁺foxp3^-cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝4-10)。

图116a至图119c是数据的一系列图形表示，其显示与wt小鼠相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致在来自ox40^-/-小鼠的远端未注射肿瘤中肿瘤浸润效应cd8⁺和cd4⁺t细胞的更多增殖和激活。图116a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图116b示出了cd45⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图116c示出了cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图116d示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图116e示出了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。

图117a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的未注射肿瘤中ki67⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图117b示出了cd8⁺细胞中ki67⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图117c示出了ki67⁺cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。

图118a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的未注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图118b示出了cd45⁺细胞中cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图118c示出了cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图118d示出了cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图118e示出了颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。

图119a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs治疗后，来自wt和ox40^-/-小鼠的未注射肿瘤中ki67⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图119b示出了cd4⁺细胞中ki67⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。图119c示出了ki67⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5-10)。

图120至图124b是数据的一系列图形表示，其显示瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l能够诱导抗肿瘤作用，而不从淋巴器官募集t细胞。图120示出了实验方案。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后九天，向右侧腹上的较大肿瘤进行两次(在第9天和第12天)mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs的瘤内注射(4x10⁷pfu)。在第二次注射后2天收获注射肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞。在第7天、第9天、第11天和第13天向小鼠腹膜内给予阻断淋巴细胞从淋巴器官外出的fty720(25μg)。

图121(上图)示出了注射和未注射肿瘤二者随时间推移的肿瘤体积的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。图121(下图)示出了在第一次注射后第6天注射和未注射肿瘤二者的肿瘤体积的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。

图122a至图122d示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs与腹膜内递送fty720或dmso的组合治疗后，来自小鼠的注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图122b示出了cd45⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。图122c示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。图122d示出了cd8⁺细胞中ki67⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。

图123a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs与腹膜内递送fty720或dmso的组合治疗后，来自小鼠的注射肿瘤的tdln中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图123b示出了cd3⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。图123c示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。

图124a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs与腹膜内递送fty720或dmso的组合治疗后，来自小鼠的注射肿瘤的tdln中ki67⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图124b示出了cd8⁺细胞中ki67⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝7-8)。

图125至图129c是数据的图形表示，其显示瘤内递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l在鼠at3乳腺癌脂肪垫植入模型中的注射肿瘤中延迟肿瘤生长、激活cd8⁺t细胞并减少foxp3⁺cd4⁺t细胞。图125是鼠乳腺癌at3脂肪垫植入模型的肿瘤植入和治疗的方案。简言之，将at3细胞(1x10⁶个)植入c57b/6j小鼠的第4脂肪垫中。肿瘤植入后14天，进行两次mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或热imva、或pbs的瘤内注射(6x10⁷pfu)，间隔三天。测量注射肿瘤并将其收获以进行facs分析。

图126a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或热imva、或pbs治疗后，注射at3肿瘤随时间推移的肿瘤体积的图。数据是平均值±sem(n＝5)。在第一次注射后第6天注射肿瘤的肿瘤重量的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图126b示出了在第6天的肿瘤重量。*＝p<0.05。

图127a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或热imva、或pbs治疗后，注射at3肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图127b示出了cd3⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图127c示出了cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图127d示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图127e示出了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5)。

图128a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或热imva、或pbs治疗后，注射at3肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图128b示出了cd3⁺细胞中cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图128c示出了cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图128d示出了cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图128e示出了颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5)。

图129a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或热imva、或pbs治疗后，注射at3肿瘤中foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图129b示出了cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5)。图129c示出了foxp3⁺cd4⁺t细胞绝对数量/克肿瘤的图。数据是平均值±sem(n＝5)。

图130至图131b是数据的图形表示，其显示在双侧b16-f10黑色素瘤植入模型中，瘤内递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l和腹膜内递送抗pd-l1的组合导致增强的治疗功效。

图130示出了实验方案。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹1x10⁵个)。肿瘤植入后七天，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射4x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs。一组小鼠还与itmvaδe5r-hflt3l-mox40l结合每周两次接受抗pd-l1抗体(250μg)。监测肿瘤体积和小鼠存活。

图131a示出了用pbs或mvaδe5r-hflt3l-mox40l瘤内治疗，或用itmvaδe5r-hflt3l-mox40l+ip抗pd-l1的组合治疗的小鼠中注射和未注射肿瘤二者的肿瘤体积。图131b示出了三个组的kaplanmeier存活曲线。

图132a至图134b是数据的图形表示，其显示bmdc的mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌；用mvaδe5r-hflt3l-hox40l离体感染人肿瘤(乳房外佩吉特病)导致颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的增加和foxp3⁺cd4⁺t细胞的减少。

图132a示出了用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l以10的moi感染的bmdc的rt-pcr结果。在感染后6h收集细胞。提取rna并进行rt-pcr。图132b示出了用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l以10的moi感染的bmdc中的ifn-β蛋白水平。在感染后19h收集上清液。通过elisa确定ifn-β蛋白水平。

图133a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs感染两天后，人肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图133b示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs感染两天后，人肿瘤中foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。

图134a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs对照感染两天后，cd8⁺细胞中颗粒酶⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝3)。图134b示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs对照感染两天后，cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝3)。

图135a至图137b是数据的图形表示，其显示与mvaδe5r或mvaδe3l相比，mvaδe3lδe5r在bmdc和b16-f10黑色素瘤细胞中诱导更高水平的i型ifn。

图135a至图135c示出了通过在mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40l基因组的e2l和e4l基因座处的同源重组而产生重组mvaδe3lδe5r和mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l的方案。在e2l和e4l基因座处发生的同源重组导致e3l基因从mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40l基因组中缺失。

图136显示，与mvaδe5r、mva或热imva相比，bmdc的mvaδe3lδe5r感染诱导更高水平的ifnb基因表达。将来自wt或cgas^-/-小鼠的bmdc用mva、热imva、mvaδe5r或mvaδe3lδe5r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。

图137a至图137b显示，与mvaδe3l或mvaδe5r相比，鼠b16-f10黑色素瘤细胞的mvaδe3lδe5r感染诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。图137a示出了关于用mvaδe3l、或mvaδe5r或mvaδe3lδe5r以10的moi感染的wt或mda5^-/-、或sting^-/-mda5^-/-b16-f10细胞的定量rt-pcr分析。在感染后16h收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。图137b示出了在用mvaδe3l、或mvaδe5r或mvaδe3lδe5r以10的moi感染的wt或mda5^-/-、或sting^-/-mda5^-/-b16-f10细胞中的ifn-β蛋白水平。在感染后24h收集上清液，并且通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平。

图138至图139b是数据的图形表示，其显示mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在b16-f10黑色素瘤细胞中表达人flt3l和鼠ox40l转基因，并且瘤内递送mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在b16-f10鼠黑色素瘤模型中诱导更强的全身性抗肿瘤t细胞反应。

图138示出了facs数据，其展示了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或用mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l感染的b16-f10细胞上的mox40l和hflt3l表达。将b16-f10细胞用mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或用mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l、或用mvaδe3lδe5r以10的moi感染。1h后洗涤细胞，并且在感染后24h收获细胞。用抗mox40l或抗hflt3l抗体对细胞进行染色以进行facs。

图139a至图139b显示，与mvaδe5r-hflt3l-mox40l相比，瘤内注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在脾中产生更强的抗肿瘤特异性t细胞。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，将2x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l、等效量的热imva、或pbs向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射两次，间隔三天。在第二次注射后2天收获脾，进行elispot分析以评价脾中的肿瘤特异性t细胞。通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和脾细胞(1,000,000个)来进行elispot测定。图139a示出了来自同一治疗组中小鼠的合并脾细胞的一式三份样品的elispot的图像。图139b示出了每1,000,000个脾细胞的ifn-γ⁺斑点的图。每个点表示来自单独小鼠的脾细胞样品(n＝5-6)(*p<0.05；**p<0.01，t检验)。

图140至图141b是数据的图形表示，其显示瘤内递送mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l延迟wt和β2m^-/-b16-f10肿瘤细胞二者的生长。

图140示出了实验方案。简言之，将wt或b2m^-/-b16-f10肿瘤细胞(2x10⁵个)(其在诸位发明人实验室中通过crispr-cas9技术产生)皮内植入到c57bl/6j小鼠的右侧腹。肿瘤植入后10天，每周两次向肿瘤注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l。测量肿瘤体积并监测小鼠存活。

图141a示出了用pbs或mvaδe5r-hflt3l-mox40l瘤内治疗的小鼠中注射的wt和b2m^-/-b16-f10肿瘤的肿瘤体积。图141b示出了四个组的kaplanmeier存活曲线。

图142至图148是数据的一系列图形表示，其显示在at3双侧肿瘤植入模型中，与mvaδe5r-hflt3l-mox40l相比，瘤内注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在注射肿瘤中产生更多激活的肿瘤浸润效应t细胞并减少巨噬细胞和dc的百分比。

图142示出了实验方案。简言之，将10⁵个at3乳腺癌细胞植入c57b/6j小鼠的第4脂肪垫中。肿瘤植入后十二天，将6x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l、或pbs向两个侧腹上的肿瘤中瘤内(it)注射两次，间隔三天。分离注射肿瘤。通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞和髓样细胞。

图143a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗后，注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图143b示出了cd45⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图143c示出了cd8⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图143d示出了cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图143e示出了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图144a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗后，注射肿瘤中ki67⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图144b示出了cd8⁺细胞中ki67⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图144c示出了ki67⁺cd8⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图145a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗后，注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图145b示出了cd3⁺细胞中cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图145c示出了cd4⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图145d示出了cd4⁺细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图145e示出了颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±t细胞。数据ap<0.01；***p<0.001，t检验)。

图146a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗后，注射肿瘤中foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图146b示出了cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图146c示出了foxp3⁺cd4⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem。数据是p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图147a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗后，注射肿瘤中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图147b示出了foxp3⁺cd4⁺细胞中ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图147c示出了ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图148a至图148h是一系列数据，其显示瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l减少注射肿瘤中巨噬细胞和dc的百分比。图148a示出了用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗后，注射肿瘤中巨噬细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。图148b示出了巨噬细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图148c示出了dc的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图148d示出了dc的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图148e示出了cd11b⁺dc的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图148f示出了cd11b⁺dc的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图148g示出了cd103⁺dc的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。图148h示出了cd103⁺dc的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝4-6)。(**p<0.01；***p<0.001，t检验)。

图149至图150是数据的一系列图形表示，其显示瘤内注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l与抗pd-l1和抗ctla-4抗体的组合在mmtv-pymt乳腺癌模型中具有优异的抗肿瘤功效。图149示出了实验方案。在第一个肿瘤变得可触及后，每周两次将4x10⁷pfu的mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l或pbs瘤内(it)注射到肿瘤中。每周两次向每只小鼠腹膜内注射250μg抗pd-l1和100μg抗ctla-4抗体或同种型对照抗体。每周两次测量肿瘤体积。图150示出了用itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l和ip抗pd-l1和抗ctla-4抗体治疗后的肿瘤生长曲线的图。数据是平均值±sem(n＝3-4)。

图151至图152b是数据的一系列图形表示，其显示从mvaδe5r-hflt3l-mox40l中缺失c11r基因增加bmdc中的ifn产生。

图151是同源重组以产生mvaδe5r-hflt3l-mox40δc11r的示意图。

图152a至图152b显示，与mvaδe5r或mva相比，bmdc的mvaδe5r-hflt3l-mox40δc11r感染诱导更高水平的ifnb基因表达(图152a)和蛋白质分泌(图152b)。将来自wt小鼠的bmdc用mva、mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40δc11r以10的moi感染。为了评估ifnb基因的表达，在感染后6h收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。为了测试来自bmdc的ifn-b蛋白分泌，在感染后19h收集上清液。通过elisa确定ifn-b蛋白水平。

图153至图154c是数据的一系列图形表示，其显示从mva或mvaδe5r-hflt3l-mox40l中缺失wr199基因增加bmdc中的ifn产生。

图153是同源重组以产生mvaδe5r-hflt3l-mox40δwr199的示意图。在b17l和b19r基因座处发生的同源重组导致wr199的缺失和侧接有两个frt位点的mcherry表达盒的插入。

图154a示出了在10的moi下pbs、mva、mvaδwr199或热imva感染的来自wt或cgas^-/-小鼠的bmdc中的ifnb基因表达。图154b至图154c显示，与mvaδe5r或mva相比，bmdc的mvaδe5r-hflt3l-mox40δc11r感染诱导更高水平的ifnb基因表达(图154b)和蛋白质分泌(图154c)。将来自wt小鼠的bmdc用mva、mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40δc11r以10的moi感染。为了评估ifnb基因的表达，在感染后6h收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。为了测试来自bmdc的ifn-β蛋白分泌，在感染后19h收集上清液。通过elisa确定ifn-β蛋白水平。

图155示出了通过在痘苗病毒(wr)基因组的b1r和b3r基因座处的同源重组而产生重组vacvδb2r病毒的方案。在b1r和b3r基因座处发生的同源重组导致b2r基因从痘苗病毒(wr)基因组中缺失。

图156a至图156b显示，vacvδb2r在鼻内感染模型中高度减毒。图156a示出了在用高剂量的vacvδb2r(h，2x10⁷pfu)或低剂量的vacvδb2r(l，2x10⁶pfu)鼻内感染后的重量减轻。图156b示出了用高剂量vacvδb2r(h，2x10⁷pfu)或低剂量vacvδb2r(l，2x10⁶pfu)的鼻内感染小鼠的kaplan-meier存活曲线。

图157a至图157b示出了产生重组vacvδe3l83nδb2r、vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r病毒的示意图。图157a显示，通过以下方式产生vacvδe3l83nδb2r：在痘苗vacvδe3l83n基因组的b1r和b3r基因座处同源重组，从而导致b2r基因从vacvδe3l83n基因组中缺失。图157b显示，分别通过在痘苗vacvδe5r或vacvδe3l83nδe5r基因组的b1r和b3r基因座处的同源重组来产生vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r。在b1r和b3r基因座处发生的同源重组分别导致b2r基因从vacvδe5r或vacvδe3l83nδe5r基因组中缺失。

图158显示，vacvδe3l83nδe5r、vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r在鼻内感染模型中高度减毒。将wt小鼠用2x10⁷pfu的vacvδb2r、vacvδe5r、vacvδe3l83nδe5r、vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r鼻内感染，并且每日监测存活和重量减轻。该图示出了用这五种不同病毒鼻内感染后的重量减轻。

图159a至图159b显示，与vacvδb2r或vacvδe5r相比，鼠bmdc的vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r感染诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-γ蛋白分泌。图159a示出了在用vacv、vacvδ83n、vacvδb2r、vacvδe5r、vacvδe5rδb2r、vacvδe3l83nδe5r或vacvδe3l83nδe5rδb2r以10的moi感染的wt和cgas敲除bmdc细胞中的ifnb基因表达。在感染后6小时收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。图159b示出了用vacv、vacvδ83n、vacvδb2r、vacvδe5r、vacvδe5rδb2r、vacvδe3l83nδe5r或vacvδe3l83nδe5rδb2r以10的moi感染的wt和cgas敲除bmdc细胞的ifn-γ蛋白分泌。在感染后24h收集上清液，并且通过elisa确定上清液中的ifn-γ蛋白水平。

图160显示，与vacvδb2r或vacvδe5r相比，鼠bmdc的vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r感染诱导更高水平的sting、irf3和tbk1磷酸化。将wtbmdc细胞用vacv、vacvδb2r、vacvδe5r、vacvδe5rδb2r、vacvδe3l83nδe5r或vacvδe3l83nδe5rδb2r以10的moi感染。在不同的时间点收集细胞裂解物。分别通过针对磷酸化sting、irf3和tbk1的抗体检测sting、irf3和tbk1的磷酸化。

图161示出了通过首先在vacvδe3l83n基因组的tk基因座处然后在e5r基因座处的同源重组而产生表达抗muctla-4抗体以及hflt3l、mox40l和mil12蛋白的重组vacvδe3l83nδtkδe5r病毒的逐步策略的方案。使用pcb载体插入单一表达盒以在痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下表达抗muctla-4抗体重链和轻链。在tk-l和tk-r位点处发生的同源重组导致将抗muctla-4抗体的表达盒插入vacvδe3l83n基因组上的tk基因座中。使用puc57载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达hflt3l-mox40l融合蛋白和mil-12二者的两个表达盒。hflt3l-mox40l的编码序列由弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列分隔开。mil12的p40和p30亚基的编码序列由弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列分隔开。将p30亚基的c末端用基质结合序列标记。e4l和e6r基因座处的同源重组导致将hflt3l-mox40l和mil12的表达盒插入vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4基因组的e5l基因座中。

图162示出了通过在vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)基因组的b1r和b3r基因座处的同源重组而产生具有b2r基因缺失的重组vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒的方案。在b1r和b3r基因座处发生的同源重组导致b2r基因从病毒基因组中缺失，以产生vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r病毒(ov-vacvδe5rδb2r)。

图163示出了与wtvacv相比，重组病毒vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)在bsc40细胞中的多步生长曲线。将bsc40细胞用vacv、vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r以0.01的moi感染。在不同时间点收集病毒样品，并且使用bsc40细胞确定病毒滴度。

图164a至图164b显示，与vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)相比，鼠bmdc的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)感染诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-γ蛋白分泌。图164a示出了在用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12、vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r或热imva以10的moi感染的wtbmdc细胞中的ifnb基因表达。在感染后6小时收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。图164b示出了与图164a中相同的感染中的ifn-γ蛋白分泌。在感染后24h收集上清液，并且通过elisa确定上清液中的ifn-γ蛋白水平。

图165a至图165c示出了转基因抗muctla-4、mox40l或人flt3l在vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)感染的b16-f10细胞中和在用病毒注射的肿瘤中的表达。图165a示出了蛋白质印迹，其证明鼠抗ctla-4和人flt3l在vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)感染的b16-f10细胞中表达。fl：抗muctla-4的全长；hc：抗muctla-4的重链；lc：抗muctla-4的轻链。图165b示出了在鼠黑色素瘤细胞b16-f10上mox40表达的facs分析的点图。将细胞用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(表达gfp)以10的moi感染24h。包括无病毒模拟感染对照。用抗mox40l抗体对细胞进行染色。图165c示出了在瘤内注射vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)病毒后，b16-f10黑色素瘤肿瘤中的mil-12表达。向皮内植入的b16-f10黑色素瘤肿瘤注射在100μlpbs中的4x10⁷pfu的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)，并且在治疗后48小时收集肿瘤。使肿瘤样品裂解，并且使用抗p40抗体通过蛋白质印迹检查鼠il-12的表达。

图166a至图166d.图166a至图166c示出了在三种不同鼠癌细胞系的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)病毒感染后的鼠il-12的表达和分泌。将肿瘤细胞用vacv、vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12感染，或模拟感染。病毒感染后24小时和48小时收集上清液，并且通过elisa确定细胞培养上清液中il-12的浓度。图166a示出了ov-vacvδe5r感染的b16-f10黑色素瘤细胞中的mil-12水平。图166b示出了ov-vacvδe5r感染的4t1乳腺癌细胞中的mil-12水平。图166c示出了ov-vacvδe5r感染的mc38结肠癌细胞中的mil-12水平。图166d示出了用ov-vacvδe5r治疗的小鼠中的血清mil-12水平。在瘤内注射病毒后48h和72h，对小鼠实施安乐死，并且收集血液/血清以通过elisa进行细胞因子测量。

图167a至图167b示出了在双侧b16-f10肿瘤植入模型中瘤内递送单独的或与抗pd-l1抗体组合的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)的抗肿瘤功效。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹1x10⁵个)。肿瘤植入后七天，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射4x10⁷的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)、热imva或pbs。一组小鼠还与itvacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)结合每周两次接受抗pd-l1抗体(250μg)。监测肿瘤体积和小鼠存活。图167a示出了用pbs或vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)、热imva瘤内治疗，或用itvacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)+ip抗pd-l1的组合治疗的小鼠中注射和未注射肿瘤二者的肿瘤体积。图167b示出了四个组的kaplanmeier存活曲线。

图168a至图168b显示，与vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)或热imva相比，瘤内注射vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)在脾中产生更强的抗肿瘤特异性t细胞。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，将4x10⁷pfu的ov-vacvδe5rδb2r、ov-vacvδe5r、等效量的热imva、或pbs向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射两次，间隔三天。在第二次注射后2天收获脾，进行elispot分析以评价脾中的肿瘤特异性t细胞。通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和脾细胞(1,000,000个)来进行elispot测定。图168a：每1,000,000个脾细胞的ifn-γ⁺斑点的图。每个点表示来自单独小鼠的脾细胞(n＝4)(*p<0.05；**p<0.01，****p<0.0001，t检验)。图168b：来自同一治疗组中小鼠的合并脾细胞的一式三份样品的elispot的图像。

图169示出了通过首先在vacvδe3l83n基因组的tk基因座处然后在e5r基因座处的同源重组而产生表达抗huctla-4抗体以及hflt3l、hox40l和hil12蛋白的重组vacvδe3l83nδtkδe5r病毒的逐步策略的方案。使用pcb载体插入单一表达盒以在痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下表达抗huctla-4抗体重链和轻链。在tk-l和tk-r位点处发生的同源重组导致将抗huctla-4抗体的表达盒插入vacvδe3l83n基因组(其通过缺失编码n末端83个氨基酸的e3l基因的dna片段而产生)上的tk基因座中。使用puc57载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达hflt3l-hox40l融合蛋白和mil-12二者的两个表达盒。hflt3l-mox40l的编码序列由弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列分隔开。hil12的p40和p30亚基的编码序列由弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列分隔开。将p30亚基的c末端用基质结合序列标记。e4l和e6r基因座处的同源重组导致将hflt3l-hox40l和hil12的表达盒插入vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4基因组的e5l基因座中。

图170示出了通过在粘液瘤δm127-mcherry基因组的m062r和m064r基因座处的同源重组而产生具有m063r基因缺失的重组粘液瘤病毒(洛桑(lausanne)毒株)，以及通过在粘液瘤δm127-mcherry基因组的m063r和m065r基因座处的同源重组而产生具有m064r基因缺失的重组粘液瘤病毒(洛桑毒株)的方案。在m062r和m064r基因座处发生的同源重组导致m063r基因从病毒基因组中缺失，从而产生粘液瘤δm063r病毒。在m063r和m065r基因座处发生的同源重组导致m064r基因从病毒基因组中缺失，从而产生粘液瘤δm064r病毒。

图171a至图171b显示，与还含有m0127基因缺失的表达mcherry的亲本粘液瘤病毒(粘液瘤-mcherry)相比，鼠bmdc的粘液瘤δm064r和粘液瘤δm063r感染诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。将bmdc细胞用粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm063r、粘液瘤δm064r或mva以10的moi感染。在感染后6小时收集细胞并提取rna。进行定量rt-pcr分析以检查ifnb基因的表达。图171a示出了感染的bmdc中ifnb基因表达的rt-pcr结果。在感染后24h收集上清液，并且通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平。图171b示出了感染的bmdc的上清液中ifn-β蛋白水平的elisa结果。

图172至图174b是数据的一系列图形表示，其显示在b16-f10黑色素瘤模型中瘤内注射粘液瘤δm064r或粘液瘤-mcherry导致效应cd4⁺和cd8⁺t细胞的激活。图172示出了实验方案。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射2x10⁷pfu的粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064r、mvaδe5r或pbs。注射后两天，分离注射肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞。图172显示在b16-f10黑色素瘤模型中瘤内注射粘液瘤δ0m64r或粘液瘤-mcherry导致效应cd4⁺和cd8⁺t细胞的激活。

图173a示出了用粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064r、mvaδe5r或pbs治疗的注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。图173b示出了注射肿瘤中cd45⁺细胞的绝对数量的图。数据是平均值±sem(n＝5-8)。图173c示出了cd8⁺t细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-8)(*p<0.05，t检验)。

图174a示出了用粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064r、mvaδe5r或pbs治疗的注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。图174b示出了cd4⁺t细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝5-8)(**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001，t检验)。

具体实施方式

应理解，下文以不同详细程度描述了本发明技术的某些方面、模式、实施方案、变化形式和特征，以提供对本发明技术的实质理解。

i.定义

下文提供了如本说明书中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学技术语均通常具有与本发明技术所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。

如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非上下文另外明确说明。例如，对“一种/一个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等。

如本文所用，术语“约”涵盖可能在测量中发生的并且对于熟练技术人员而言清楚的实验误差范围。

如本文所用，术语“佐剂”是指增强、增加或加强宿主对抗原(包括肿瘤抗原)的免疫反应的物质。

如本文所用，向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，所述合适的途径包括但不限于口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、瘤内或局部。施用包括自我施用和由另一个人施用。

如本文所用，术语“抗原”指抗体(或其抗原结合片段)可以选择性地结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，抗原包含在全细胞内，如在含有肿瘤抗原的全细胞疫苗中。在一些实施方案中，所述靶抗原涵盖癌症相关抗原或新抗原，并且包括由肿瘤或非肿瘤癌症表达的蛋白质或其他分子，如存在于癌细胞但不存在于非癌细胞中的分子以及与非癌细胞相比在癌细胞中上调的分子。

如本文所用，与病毒结合使用的“减毒的”是指病毒与非减毒的对应物相比具有降低的毒力或致病性，但是仍是有活力的或存活的。通常，与非减毒的病毒相比，减毒使致病因子(如病毒)对受感染的对象具有较小的危害或毒力。这与被杀死的病毒或完全灭活的病毒形成对比。

如本文所用，“联合施用”是指与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)组合施用第二治疗方式。例如，与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)在时间上非常接近地施用免疫检查点阻断剂、免疫调节剂和/或抗癌药物。例如，可以将pd-1/pd-l1抑制剂和/或ctla-4抑制剂(在更具体的实施方案中，抗体)与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)同时(即，并行)施用(当将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199如上所述瘤内或全身性施用时，通过静脉内或瘤内注射)，或者在mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199施用之前或之后施用。在一些实施方案中，如果mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199施用和免疫检查点阻断剂、免疫调节剂和/或抗癌药物间隔约1至约7天或甚至间隔长至三周施用，这仍将在如本文所述的“在时间上非常接近地”内，因此这种施用将被视为“联合”。

术语“相应的野生型毒株”或“相应的野生型病毒”在本文中用于指衍生出工程化mva、痘苗或粘液瘤毒株或病毒的野生型mva、痘苗病毒(vacv)或粘液瘤病毒(myxv)毒株。如本文所用，野生型mva、痘苗或粘液瘤毒株或病毒是尚未被工程化以破坏或缺失(敲除)特定目的基因和/或表达异源核酸的毒株或病毒。例如，在一些实施方案中，野生型mva、痘苗或粘液瘤毒株或病毒是尚未被工程化以破坏或缺失(敲除)c7基因并表达ox40l的毒株或病毒。在其他实施方案中，野生型mva、痘苗或粘液瘤毒株或病毒是尚未被工程化以破坏或缺失(敲除)e5r(或m31r)基因的毒株或病毒。工程化mva、痘苗或粘液瘤毒株或病毒可以已经被修饰以破坏或缺失(敲除)c7基因并表达ox40l，单独地或与如本文所述的进一步修饰(例如，被工程化以表达另外的免疫调节蛋白和/或包含另外的基因缺失)组合。另外或可替代地，工程化mva、痘苗或粘液瘤毒株或病毒可以已经被修饰以破坏或缺失(敲除)e5r(或m31r)基因，单独地或与如本文所述的进一步修饰(例如，被工程化以表达另外的免疫调节蛋白和/或包含另外的基因缺失)组合。术语“相应的mvaδe3l毒株”或“相应的mvaδe3l病毒”在本文中用于指具有单独e3l缺失的mva毒株或病毒(即，不包含其他基因缺失或添加的mvaδe3l毒株或病毒)。术语“相应的mvaδc7l毒株”或“相应的mvaδc7l病毒”在本文中用于指具有单独c7l缺失的mva毒株或病毒(即，不包含其他基因缺失或添加的mvaδc7l毒株或病毒)。术语“相应的mvaδe5r毒株”或“相应的mvaδe5r病毒”在本文中用于指具有单独e5r缺失的mva毒株或病毒(即，不包含其他基因缺失或添加的mvaδe5r毒株或病毒)。术语“相应的vacvδc7l毒株”或“相应的vacvδc7l病毒”在本文中用于指具有单独c7l缺失的痘苗毒株或病毒(即，不包含其他基因缺失或添加的vacvδc7l毒株或病毒)。术语“相应的vacvδe5r毒株”或“相应的vacvδe5r病毒”在本文中用于指具有单独e5r缺失的痘苗毒株或病毒(即，不包含其他基因缺失或添加的vacvδe5r毒株或病毒)。

如本文所用，术语“递送”和“接触”是指将本公开文本的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)沉积在肿瘤微环境中，无论这是通过对肿瘤的局部施用(瘤内)还是通过例如静脉内途径进行的。所述术语侧重于工程化病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)到达肿瘤本身。在一些实施方案中，“递送”与施用是同义的，但是记住它与特定的施用地点(例如，瘤内)一起使用。

术语“破坏”和“突变”在本文中可互换使用，以指在遗传物质中可检测到且可遗传的变化。突变可以包括插入、缺失、取代(例如，转换、颠换)、转座、倒位、敲除及其组合。突变可能仅涉及单一核苷酸(例如，点突变或单核苷酸多态性)或多个核苷酸。在一些实施方案中，突变是沉默的，即未检测到突变的表型效应。在其他实施方案中，突变导致表型变化，例如，改变编码产物的表达水平，或者改变编码产物本身。在一些实施方案中，与野生型毒株相比，破坏或突变可能会产生基因产物(例如，蛋白质或rna)表达水平降低的破坏的基因。在其他实施方案中，与野生型毒株表达的蛋白质的活性相比，破坏或突变可能导致表达的蛋白质具有较低的活性。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指药剂在以一剂或多剂并且持续一段时间施用时，足以在缓和、治愈或减轻疾病方面提供所需生物学结果的足量。在本公开文本中，有效量的本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)包括这样的量(当以合适的时间段和合适的频率施用时)，所述量减少癌细胞数量；或减小肿瘤大小或根除肿瘤；或抑制(即，减缓或停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，减缓或停止)转移性生长；抑制(稳定或阻止)肿瘤生长；允许治疗肿瘤；和/或诱导和促进针对肿瘤的免疫反应。根据本公开文本，本领域普通技术人员可以使用常规实验来确定在任何单独情况下适当的治疗量。这种确定可以开始于在体外发现有效的量和在动物体内发现有效的量。治疗有效量将首先基于发现对培养细胞赋予益处的一种或多种浓度来确定。有效量可以从细胞培养物内的数据推断出来，并且可以基于诸如本文详述的因素上调或下调。尽管可以施用更低或更高的剂量，病毒构建体的有效量通常在约10⁵至约10¹⁰个噬斑形成单位(pfu)的范围内。在一些实施方案中，剂量是约10⁶-10⁹pfu。在一些实施方案中，单位剂量是以在1至10ml范围内的体积来施用。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒。可以将治疗有效量的携带hflt3l转基因的病毒以一个或多个分剂量在规定的时间段内并且以规定的施用频率施用。例如，根据本公开文本的带有hflt3l的病毒的治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况以及病毒构建体在特定受试者体内针对特定癌症引起所需免疫反应的效力等因素而变化。

特别提及本文公开的基于病毒的免疫刺激剂，“有效量”或“治疗有效量”是指包含本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)的组合物的这样的量，所述量足以减少、抑制或消除肿瘤细胞生长，从而减小或根除肿瘤，或者足以在受试者体外、离体或体内抑制、减少或消除转移性扩散，或引起和促进针对肿瘤的免疫反应，所述免疫反应将视情况而定最终导致转移性扩散减少、抑制和/或消除中的一种或多种。肿瘤细胞生长的减少、抑制或根除可能是坏死、细胞凋亡或免疫反应或前述两种或更多种的组合的结果(然而，例如细胞凋亡的沉淀可能不是由于与溶瘤病毒观察到的相同因素所致)。治疗有效的量可以根据诸如以下等因素而变化：组合物中使用的特定病毒、所治疗受试者的年龄和状况、肿瘤形成的程度、其他治疗方式的存在或不存在等。类似地，要待施用的组合物的剂量及其施用频率将取决于多种因素，如活性成分的效力、施用后其活性的持续时间、施用途径、受试者的体型、年龄、性别和身体状况、不良反应的风险以及医师的判断。组合物是以多种剂型如可注射溶液来施用。

特别提及与免疫检查点抑制剂的组合疗法，免疫检查点阻断剂的“有效量”或“治疗有效量”意指免疫检查点阻断剂的足以逆转或减少肿瘤微环境中的免疫抑制作用以及足以激活或增强被治疗的受试者的宿主免疫的量。免疫检查点阻断剂包括但不限于针对cd28抑制剂如ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞抗原4)的抑制性抗体(例如，伊匹单抗)、抗pd-1(程序性死亡蛋白1)抑制性抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗)和抗pd-l1(程序性死亡配体1)抑制性抗体(mpdl3280a、bms-936559、medi4736、msb00107180)以及针对lag-3(淋巴细胞激活基因3)、tim3(t细胞免疫球蛋白和粘蛋白3)、b7-h3、tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)的抑制性抗体、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla或pdr001及其组合。由于已经完成了一些给药临床试验，因此前述各项的剂量范围是本领域中已知的或容易掌握的，从而外推到其他可能的药剂。

在一些实施方案中，肿瘤表达特定的检查点，但是在本发明技术的上下文中，这并不是严格必要的，因为免疫检查点阻断剂更通常地阻断由肿瘤细胞、基质细胞和肿瘤浸润的免疫细胞引起的肿瘤内的免疫抑制机制。

例如，当在黑色素瘤中作为手术后的辅助疗法施用时，ctla-4抑制剂伊匹单抗在90分钟内以1-2mg/ml施用，每三周的总输注量为3mg/kg，共4个剂量。这种疗法通常伴随着严重的甚至危及生命的免疫介导的不良反应，这限制了耐受剂量以及可以施用的累积量。预期，当与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)联合施用时，可以减少伊匹单抗的剂量和/或累积量。具体而言，根据下文所述的实验结果，预期如果向肿瘤直接联合施用ctla-4抑制剂与一种或两种前述mva病毒，则可以进一步降低ctla-4抑制剂的剂量。因此，上文为伊匹单抗提供的量可以是用于确定联合施用时待给予至患者的特定剂量和累积量的起点。

作为另一个例子，开具派姆单抗的处方为作为黑色素瘤的辅助疗法稀释至25mg/ml施用。每三周在30分钟内以2mg/kg的剂量给药。这可以是用于确定本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)的联合施用的剂量和施用的起始点。

纳武单抗也可以充当用于确定与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)组合施用的检查点抑制剂的剂量和施用方案的起点。开具纳武单抗的处方为每两周在60分钟内以3mg/kg作为静脉输注施用。

免疫刺激剂(如激动剂抗体)也已被探究作为癌症的免疫疗法。例如，抗icos抗体与icos的细胞外结构域结合，从而导致激活icos信号传导和t细胞激活。抗ox40抗体可以与ox40结合并且增强t细胞受体信号传导，从而导致t细胞激活、增殖和存活。其他例子包括针对4-1bb(cd137)、gitr的激动剂抗体。

免疫刺激激动剂抗体可以与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)的瘤内注射组合全身性使用。可替代地，免疫刺激激动剂抗体可以与本发明技术的一种或多种工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199)经由瘤内递送同时(即，并行)或顺序地联合使用。

术语“免疫调节药物”在本文中用于指芬戈莫德(fty720)。

术语“工程化的”或“基因工程化的”在本文用于指生物体已经例如通过破坏基因组被操纵以在基因上改变、修饰或变化。例如，“工程化痘苗病毒毒株”、“工程化改良安卡拉痘苗病毒”或“工程化粘液瘤病毒”是指已经被操纵以在基因上改变、修饰或变化的痘苗、改良安卡拉痘苗或粘液瘤毒株。在本发明的情境下，“工程化的”或“基因工程化的”包括重组痘苗病毒、重组改良安卡拉痘苗病毒和重组粘液瘤病毒。

术语“基因盒”在本文中用于指编码并且能够表达一个或多个目的基因(例如，ox40l、hflt3l、选择性标记或其组合)的dna序列，其可以在dna序列的一个或多个选定的限制位点之间插入。在一些实施方案中，插入基因盒会产生破坏的基因。在一些实施方案中，基因的破坏涉及用基因盒替换至少一部分基因，所述基因盒包括编码目的基因(例如，ox40l、hflt3l、选择性标记或其组合)的核苷酸序列。

如本文所用，“异源核酸”是指已经被引入病毒中，并且不是引入其的病毒中天然发现的序列的拷贝的核酸、dna或rna。这种异源核酸可以包含为在已引入其的病毒中天然发现的序列的拷贝的区段。

如本文所用，无论在何处描述基因，基因可以是人或鼠的，使得人(h或hu)或鼠(m或mu)的名称可以互换使用，并非旨在进行限制。例如，在描述mil-12的情况下，hil-12可以代替所述构建体中的mil-12，且反之亦然。

如本文所用，“il-15/il-15rα”涵盖膜结合hil-15/il-15rα反式呈递(transpresentation)构建体和融合蛋白，如以下文献中所述：vandenbergh等人(pharmacology&therapeutics170:73-79(2017)；kowalsky等人(moleculartherapy26(10):2476-2486(2018)；stoklasek等人(j.immunol.177:6072-6080)；duboi等人(j.immunol.180:2099-2106(2008)；epardaud等人(cancerres.68:2972-2983(2008)；以及dubois等人(immunity17:537-547(2002)，将所述文献中的每一篇通过引用并入本文。

如本文所用，“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点阻断剂”或“免疫检查点阻断抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白活性的分子。检查点蛋白调节t细胞激活或功能。检查点蛋白包括但不限于cd28受体家族成员ctla-4及其配体cd80和cd86；pd-1及其配体pd-l1和pd-l2；lag3、b7-h3、b7-h4、tim3、icos、iidlbcl、btla或前述两种或更多种的任何组合。设想用于本文中的免疫检查点阻断剂的非限制性例子包括但不限于针对cd28抑制剂如ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞抗原4)的抑制性抗体(例如，伊匹单抗)、抗pd-1(程序性死亡蛋白1)抑制性抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗)和抗pd-l1(程序性死亡配体1)抑制性抗体(mpdl3280a、bms-936559、medi4736、msb00107180)以及针对lag-3(淋巴细胞激活基因3)、tim3(t细胞免疫球蛋白和粘蛋白3)、b7-h3、tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)的抑制性抗体、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、或btla、pdr001及其组合。

如本文所用，“免疫反应”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)中的一种或多种的作用，所述作用导致对癌性细胞、转移性肿瘤细胞等的选择性损伤、破坏或从人体消除。免疫反应可以包括细胞反应，如t细胞反应，其为细胞功能(即t细胞功能)的改变(调节，例如，显著增强、刺激、激活、损伤或抑制)。t细胞反应可以包括特定类型的t细胞或t细胞子集(例如，效应cd4⁺、cd4⁺辅助、效应cd8⁺、cd8⁺细胞毒性或自然杀伤(nk)细胞)的产生、增殖或扩增或刺激。可以通过检测一种或多种细胞受体或细胞表面分子(例如，cd或分化分子簇)来鉴定此类t细胞子集。t细胞反应还可以包括影响其他细胞的分化或增殖的细胞因子如可溶性介体(例如，细胞因子、淋巴因子、细胞因子结合蛋白或白细胞介素)的改变的表达(统计上显著的增加或减少)。例如，i型干扰素(ifn-α/β)是先天免疫的关键调节剂(huber等人immunology132(4):466-474(2011))。动物和人研究已经显示在抗原识别和抗肿瘤免疫反应的初始阶段期间，ifn-α/β在直接影响cd4⁺和cd8⁺t细胞二者的命运中的作用。响应于树突状细胞的激活而诱导i型ifn，这又是先天免疫系统的前哨。免疫反应还可以包括体液(抗体)反应。

术语“免疫原性组合物”在本文中用于指将在已经暴露于所述组合物的哺乳动物中引起免疫反应的组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199和/或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、抗原、含有前述工程化病毒中的任何一种或多种的佐剂、和/或含有单独的或与免疫检查点阻断抑制剂组合的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l和/或热imvaδe5r的佐剂。如本文所用，免疫原性组合物涵盖疫苗。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含含有肿瘤抗原的全细胞疫苗(例如经辐照的全细胞疫苗)。

如本文所用，术语“灭活的mva”是指热灭活的mva(热imva)和/或uv灭活的mva，其是具有感染性的、非复制性的并且不抑制在感染dc细胞中i型ifn的产生。如本文所用，术语“灭活的痘苗病毒”包括热灭活的痘苗病毒和/或uv灭活的痘苗病毒。通过加热和uv辐射的组合灭活的mva或痘苗病毒也在本公开文本的范围内。

如本文所用，“热灭活的mva”(热imva)和“热灭活的痘苗病毒”分别是指mva和痘苗病毒，已经将它们在不破坏其免疫原性或其进入靶细胞(肿瘤细胞)的能力，但是除去所述病毒的残余复制能力和抑制宿主的免疫反应的因子的条件下，暴露于热处理。此类条件的例子是在约50至约60℃范围内的温度下暴露约一小时的时间段。其他时间和条件可以由本领域技术人员确定。

如本文所用，“uv灭活的mva”和“uv灭活的痘苗病毒”分别是指mva和痘苗病毒，其已经通过在不破坏其免疫原性或其进入靶细胞(肿瘤细胞)的能力但是除去病毒的残余复制能力的条件下暴露于uv而失活。可用于本发明方法的此类条件的例子是使用例如365nmuv灯泡暴露于uv约30min至约1小时的时间。uv波长和暴露的这些条件的其他限制可由本领域技术人员确定。

“敲除”、“敲除的基因”或“基因缺失”是指包括无效突变的基因(例如，通过基因编码的野生型产物不表达，表达水平低至无作用，或是无功能的)。在一些实施方案中，敲除的基因包括基因本身的异源序列(例如，包含异源核酸序列的一个或多个基因盒)或基因工程化的无功能序列，这使得基因无功能。在其他实施方案中，敲除的基因缺少野生型基因的一部分。例如，在一些实施方案中，缺失了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约60％的野生型基因序列。在其他实施方案中，敲除的基因缺少至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的野生型基因序列。在其他实施方案中，敲除的基因可能包括多达100％的野生型基因序列(例如，可能缺失野生型基因序列的某一部分)，但是也包括插入其中的一个或多个异源和/或无功能核酸序列。

如本文所用，“转移”是指癌症从其原发部位扩散到体内的相邻组织或远端位置。癌细胞(包括癌症干细胞)可以脱离原发性肿瘤，穿透淋巴管和血管，在血流中循环，并且在体内其他部位的正常组织中生长。转移是一个顺序过程，伴随着肿瘤细胞(或癌症干细胞)从原发性肿瘤中脱落，通过血流或淋巴管移动，并且在远端部位停止。一旦到达另一个部位，癌细胞就会重新穿透血管或淋巴管壁，继续繁殖，并且最终形成新的肿瘤(转移性肿瘤)。在一些实施方案中，将这种新的肿瘤称为转移性(或继发性)肿瘤。

如本文所用，“mva”意指“改良安卡拉痘苗”，并且是指衍生自安卡拉毒株并且开发用作疫苗和疫苗佐剂的痘苗的高度减毒的毒株。通过经鸡胚细胞连续传代从野生型安卡拉毒株中分离出原始的mva。如此处理后，它丢失了约15％的野生型痘苗基因组，包括其在灵长类动物(包括人)细胞中高效复制的能力。(mayr等人,zentralblbakteriolb167:375-390(1978))。mva被认为是适合作为重组载体开发的候选物，用于针对传染性疾病或肿瘤的基因或疫苗接种递送。(verheust等人,vaccine30(16):2623-2632(2012))。mva具有长度为178kb的基因组并且其序列首先披露于antoine等人,virol.244(2):365-396(1998)中。序列还披露于genbank登录号u94848.1(seqidno:1)。临床级mva可从丹麦的bavariannordica/skvistgaard商购和公开获得。另外，mva可从马里兰州罗克维尔的atcc和法国巴黎的cmcn(巴斯德国家微生物研究所(institutpasteurcollectionnationaledesmicroorganismes))获得。

术语“mvaδc7l”在本文中用于指如下改良安卡拉痘苗(mva)突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中c7基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“mvaδc7l”包括缺少功能性c7l基因且具有感染性但无复制性的mva缺失突变体，并且其逃避宿主免疫系统的能力进一步受损。如本文所用，“mvaδc7l”涵盖不表达功能性c7蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，δc7l突变体包括代替c7l基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，如本文所用，“mvaδc7l”涵盖重组mva核酸序列，其中将对应于mva基因组中c7的位置(例如，seqidno:1的位置18,407至18,859)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“mvaδc7l-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)(“mvaδc7l-hflt3l”)。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，mvaδc7l病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入mva基因组的tk基因座(例如，seqidno:1的位置75,560至76,093)中，从而分裂tk基因并使其消失(“mvaδc7l-ox40l-tk(-)”；“mvaδc7l-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，mvaδc7l涵盖重组mva病毒，其中c7l基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒被进一步修饰以表达至少一个另外的异源基因，如hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l(其中“h”或“hu”指定人蛋白)中的任何一个或多个，和/或包括至少一个另外的病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。例如，在一些实施方案中，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40被进一步修饰以包含e5r的缺失，其中e5r基因通过在e4l和e6r基因座处的同源重组被选择性标记(例如，mcherry)替换。在一些实施方案中，mvaδc7l被修饰以从自其他基因座(如e5r基因座)内表达一个或多个异源基因。例如，在一些实施方案中，mvaδc7l涵盖重组mva病毒，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如“mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l”。在其他实施方案中，本发明技术的重组mvaδc7l-ox40l病毒除了病毒名称中特别提及的那些以外，不含有另外的异源基因和/或病毒基因突变。

术语“mvaδe3l”意指缺少功能性e3l基因且具有感染性但无复制性的mva缺失突变体，并且其逃避宿主免疫系统的能力进一步受损。它已被用作疫苗载体以转移肿瘤或病毒抗原。突变型mvae3l敲除及其制备已例如描述于美国专利7,049,145中。如本文所用，“mvaδe3l”涵盖被修饰以表达特定目的基因(sg)如ox40l的重组mva，(“mvaδe3l-ox40l”)。在一些实施方案中，mvaδe3l病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座中，从而分裂tk基因并使其消失(“mvaδe3l-ox40l-tk(-)”；“mvaδe3l-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，本发明技术的重组mvaδe3l-ox40l病毒被进一步修饰以表达至少一个另外的异源基因，如hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，本发明技术的重组mvaδe3l-ox40l病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

术语“mvaδe5r”在本文中用于指如下改良安卡拉痘苗(mva)突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中e5r基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“mvaδe5r”包括缺少功能性e5r基因且具有感染性但无复制性的mva缺失突变体，并且其逃避宿主免疫系统的能力进一步受损。如本文所用，“mvaδe5r”涵盖不表达功能性e5蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，δe5r突变体包括代替e5r基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，如本文所用，“mvaδe5r”涵盖重组mva核酸序列，其中将对应于mva基因组中e5r的位置(例如，seqidno:1的位置38,432至39,385)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“mvaδe5r-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)(“mvaδe5r-hflt3l”)。在一些实施方案中，mvaδe5r涵盖重组mva，其中e5r基因座被修饰以表达一个或多个异源基因。例如，在一些实施方案中，mvaδe5r涵盖重组mva，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如“mvaδe5r-hflt3l-ox40l”。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，mvaδe5r病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入mva基因组的tk基因座(例如seqidno:1的位置75,560至76,093)中，从而分裂tk基因并使其消失(“mvaδe5r-ox40l-tk(-)”；“mvaδe5r-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，mvaδe5r涵盖重组mva病毒，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“mvaδe5r-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化mvaδe5r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l(其中“h”或“hu”指定人蛋白)中的任何一个或多个，和/或包括至少一个另外的病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，本发明技术的mvaδe5r病毒除了病毒名称中特别提及的那些以外，不含有另外的异源基因和/或病毒基因突变。

术语“mvaδwr199”在本文中用于指如下改良安卡拉痘苗(mva)突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中wr199基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“mvaδwr199”包括缺少功能性wr199基因且具有感染性但无复制性的mva缺失突变体，并且其逃避宿主免疫系统的能力进一步受损。如本文所用，“mvaδwr199”涵盖不表达功能性e5蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，δwr199突变体包括代替wr199基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，如本文所用，“mvaδwr199”涵盖重组mva核酸序列，其中将对应于mva基因组中wr199的位置(例如，genbank登录号ay603355中列出的序列的位置158,399至160,143)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“mvaδwr199-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)(“mvaδwr199-hflt3l”)。在一些实施方案中，mvaδwr199涵盖重组mva，其中wr199基因座被修饰以表达一个或多个异源基因。例如，在一些实施方案中，mvaδwr199涵盖重组mva，其中wr199基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如“mvaδwr199-hflt3l-ox40l”。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，mvaδwr199病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组mva病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入mva基因组的tk基因座(例如seqidno:1的位置75,560至76,093)中，从而分裂tk基因并使其消失(“mvaδwr199-ox40l-tk(-)”；“mvaδwr199-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，mvaδwr199涵盖重组mva病毒，其中wr199基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“mvaδwr199-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化mvaδwr199病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l(其中“h”或“hu”指定人蛋白)中的任何一个或多个，和/或包括至少一个另外的病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；和/或n2l。在其他实施方案中，本发明技术的mvaδwr199病毒除了病毒名称中特别提及的那些以外，不含有另外的异源基因和/或病毒基因突变。

术语“vacvδc7l”在本文中用于指如下痘苗突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中c7基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“vacvδc7l”涵盖不表达功能性c7蛋白的重组痘苗病毒(vacv)。在一些实施方案中，痘苗病毒衍生自西部保留地(wr)毒株。在一些实施方案中，δc7l突变体包括代替c7l基因序列的全部或大部分的异源序列。例如，如本文所用，“vacvδc7l”涵盖重组痘苗病毒核酸序列，其中将对应于vacv基因组中c7的位置(例如，seqidno:2的位置15,716至16,168)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“vacvδc7l-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)基因(“vacvδc7l-hflt3l”)。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，vacvδc7l病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组痘苗病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)中，从而分裂tk基因并使其消失(“vacvδc7l-ox40l-tk(-)”；“vacvδc7l-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，vacvδc7l涵盖重组痘苗病毒，其中c7l基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“vacvδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的重组vacvδc7l-ox40l病毒被进一步修饰以表达至少一个另外的异源基因，如hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个病毒基因突变或缺失，如以下痘苗病毒缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。例如，在一些实施方案中，本发明技术的公开文本提供了一种重组vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒。在其他实施方案中，本发明技术的重组vacvδc7l-ox40l病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

术语“vacvδe5r”在本文中用于指如下痘苗突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中e5r基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“vacvδe5r”涵盖不表达功能性e5蛋白的重组痘苗病毒(vacv)。在一些实施方案中，痘苗病毒衍生自西部保留地(wr)毒株。在一些实施方案中，δe5r突变体包括代替e5r基因序列的全部或大部分的异源序列。例如，如本文所用，“vacvδe5r”涵盖重组痘苗病毒核酸序列，其中将对应于vacv基因组中e5r的位置(例如，seqidno:2的位置49,236至50,261)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“vacvδe5r-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)基因(“vacvδe5r-hflt3l”)。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，vacvδe5r病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组痘苗病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)中，从而分裂tk基因并使其消失(“vacvδe5r-ox40l-tk(-)”；“vacvδe5r-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，vacvδe5r涵盖重组痘苗病毒，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“vacvδe5r-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化vacvδe5r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个病毒基因突变或缺失，如以下痘苗病毒缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。例如，在一些实施方案中，本发明技术的公开文本提供了一种重组vacvδe3l-hflt3l-抗ctla-4-ox40l-δe5r病毒。作为另一个例子，在一些实施方案中，痘苗基因组的tk基因座通过同源重组被修饰以表达抗体如抗ctla-4的重链和轻链二者，其中重链和轻链的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，以产生vacv-tk(-)-抗ctla-4。在一些实施方案中，vacv-tk(-)-抗ctla-4基因组被进一步修饰以包含e5r缺失，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如vacv-tk^--抗ctla-4-e5r^--hflt3l-ox40l(或vacvδe5r-tk(-)-抗ctla-4-hflt3l-ox40l)。在其他实施方案中，本发明技术的vacvδe5r病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

术语“vacvδb2r”在本文中用于指如下痘苗突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中b2r基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“vacvδb2r”涵盖不表达功能性b2蛋白的重组痘苗病毒(vacv)。在一些实施方案中，痘苗病毒衍生自西部保留地(wr)毒株。在一些实施方案中，δb2r突变体包括代替b2r基因序列的全部或大部分的异源序列。例如，如本文所用，“vacvδb2r”涵盖重组痘苗病毒核酸序列，其中将对应于vacv基因组中b2r的位置(例如，seqidno:2的位置164,856至165,530)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“vacvδb2r-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)基因(“vacvδb2r-hflt3l”)。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，vacvδb2r病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组痘苗病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)中，从而分裂tk基因并使其消失(“vacvδb2r-ox40l-tk(-)”；“vacvδb2r-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，vacvδb2r涵盖重组痘苗病毒，其中b2r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“vacvδb2r-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化vacvδb2r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个病毒基因突变或缺失，如以下痘苗病毒缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。作为另一个例子，在一些实施方案中，痘苗基因组的tk基因座通过同源重组被修饰以表达抗体如抗ctla-4的重链和轻链二者，其中重链和轻链的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，以产生vacv-tk(-)-抗ctla-4。在一些实施方案中，vacv-tk(-)-抗ctla-4基因组被进一步修饰以包含b2r缺失，其中b2r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开。在其他实施方案中，本发明技术的vacvδb2r病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

术语“myxvδm31r”在本文中用于指如下粘液瘤突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中m31r基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。粘液瘤病毒m31r是痘苗病毒e5r的直系同源物。如本文所用，“myxvδm31r”涵盖不表达功能性m31r蛋白的重组粘液瘤病毒(myxv)。在一些实施方案中，δm31r突变体包括代替m31r基因序列的全部或大部分的异源序列。例如，如本文所用，“myxvδm31r”涵盖重组粘液瘤病毒核酸序列，其中将对应于myxv基因组中m31r的位置(例如，myxv基因组的位置30,138至31,319)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“myxvδm31r-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)基因(“myxvδm31r-hflt3l”)。在一些实施方案中，myxvδm31r涵盖重组myxv，其中m31r基因座被修饰以表达一个或多个异源基因。例如，在一些实施方案中，myxvδm31r涵盖重组myxv，其中m31r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如“myxvδm31r-hflt3l-ox40l”。在一些实施方案中，异源核酸序列还包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，myxvδm31r病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组粘液瘤病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座(例如，粘液瘤基因组的位置57,797至58,333)中，从而分裂tk基因并使其消失(“myxvδm31r-ox40l-tk(-)”；“myxvδm31r-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，myxvδm31r涵盖重组粘液瘤病毒，其中m31r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“myxvδm31r-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化myxvδm31r病毒被修饰以表达至少一种异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一种或多种，和/或包括至少一种病毒基因突变或缺失，如以下痘苗病毒缺失的粘液瘤直系同源物中的任何一种或多种：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，本发明技术的myxvδm31r病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

术语“myxvδm63r”在本文中用于指如下粘液瘤突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中m63r基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“myxvδm63r”涵盖不表达功能性m63r蛋白的重组粘液瘤病毒(myxv)。在一些实施方案中，δm63r突变体包括代替m63r基因序列的全部或大部分的异源序列。例如，如本文所用，“myxvδm63r”涵盖重组粘液瘤病毒核酸序列，其中将对应于myxv基因组中m63r的位置的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“myxvδm63r-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)基因(“myxvδm63r-hflt3l”)。在一些实施方案中，myxvδm63r涵盖重组myxv，其中m63r基因座被修饰以表达一个或多个异源基因。例如，在一些实施方案中，myxvδm63r涵盖重组myxv，其中m63r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如“myxvδm63r-hflt3l-ox40l”。另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，myxvδm63r病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组粘液瘤病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座(例如，粘液瘤基因组的位置57,797至58,333)中，从而分裂tk基因并使其消失(“myxvδm63r-ox40l-tk(-)”；“myxvδm63r-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，myxvδm63r涵盖重组粘液瘤病毒，其中m63r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“myxvδm63r-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化myxvδm63r病毒被修饰以表达至少一种异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一种或多种，和/或包括至少一种病毒基因突变或缺失，如以下痘苗病毒缺失的粘液瘤直系同源物中的任何一种或多种：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在一些实施方案中，myxvδm63r被进一步工程化以包含另外的粘液瘤基因缺失(例如，δm31r、δm62r和/或δm64r)。在其他实施方案中，本发明技术的myxvδm63r病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

术语“myxvδm64r”在本文中用于指如下粘液瘤突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中m64r基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“myxvδm64r”涵盖不表达功能性m64r蛋白的重组粘液瘤病毒(myxv)。在一些实施方案中，δm64r突变体包括代替m64r基因序列的全部或大部分的异源序列。例如，如本文所用，“myxvδm64r”涵盖重组粘液瘤病毒核酸序列，其中将对应于myxv基因组中m64r的位置的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人ox40l(“myxvδm64r-ox40l”)或人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)基因(“myxvδm64r-hflt3l”)。在一些实施方案中，myxvδm64r涵盖重组myxv，其中m64r基因座被修饰以表达一个或多个异源基因。例如，在一些实施方案中，myxvδm64r涵盖重组myxv，其中m64r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如“myxvδm64r-hflt3l-ox40l”。另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，myxvδm64r病毒涵盖不表达功能性胸苷激酶(tk)蛋白的重组粘液瘤病毒。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入tk基因座(例如，粘液瘤基因组的位置57,797至58,333)中，从而分裂tk基因并使其消失(“myxvδm64r-ox40l-tk(-)”；“myxvδm64r-hflt3l-tk(-)”)。在一些实施方案中，myxvδm64r涵盖重组粘液瘤病毒，其中m64r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)替换并且将第二目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中(“myxvδm64r-hflt3l-tk(-)-ox40l”)。在一些实施方案中，本发明技术的工程化myxvδm64r病毒被修饰以表达至少一种异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一种或多种，和/或包括至少一种病毒基因突变或缺失，如以下痘苗病毒缺失的粘液瘤直系同源物中的任何一种或多种：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7l(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在一些实施方案中，myxvδm64r被进一步工程化以包含另外的粘液瘤基因缺失(例如，δm31r、δm62r和/或δm63r)。在其他实施方案中，本发明技术的myxvδm64r病毒除了病毒名称中特别指出的那些以外，不表达任何另外的异源基因和/或不包括任何另外的病毒基因突变或缺失。

如本文所用，“溶瘤病毒”是指优先感染癌细胞，在此类细胞中复制，并且通过其复制过程诱导癌细胞裂解的病毒。天然存在的溶瘤病毒的非限制性例子包括水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒、以及被工程化为肿瘤选择性的病毒，如腺病毒、新城疫病毒和单纯性疱疹病毒(参见例如，nemunaitis,j.invest.newdrugs17(4):375-86(1999)；kirn,dh等人,nat.rev.cancer9(1):64-71(2009)；kirn等人,nat.med.7:781(2001)；coffey等人,science282:1332(1998))。痘苗病毒感染许多类型的细胞，但是由于以下事实而优先在肿瘤细胞中复制：肿瘤细胞的代谢有利于复制，展现出也有利于复制的对某些途径的激活，并且产生逃避先天免疫系统从而也有利于病毒复制的环境。

如本文所用，当在施用治疗性物质或组合物的情况下使用时，“肠胃外”包括除了通过消化道施用以外的任何施用途径。与本文公开的方法特别相关的是静脉内(包括例如通过肝门静脉进行肝递送)、瘤内或鞘内施用。

术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的稀释剂”、“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的佐剂”是指有用于制备药物组合物的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，其通常是安全的、无毒的并且既不是生物学上也不是其他方面不希望的，并且包括对于药学用途可接受的赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。如本说明书和权利要求中使用的“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂”包括一种和多种此类赋形剂、稀释剂、载体和佐剂。

如本文所用，障碍或病症的“预防”(“prevention”、“prevent”或“preventing”)是指如下一种或多种化合物，其在统计学样品中，相对于未经治疗的对照样品降低所治疗样品中的障碍或病症的发生率，或者相对于未经治疗的对照样品延迟障碍或病症的一种或多种症状的发作。

如本文所用，术语“重组”当关于例如病毒、或细胞、或核酸、或蛋白质、或载体使用时，指示所述病毒、细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或指示所述材料衍生自经如此修饰的病毒或细胞。因此，例如，重组病毒或细胞表达在所述病毒或细胞的天然(非重组)形式内未发现的基因，或者表达原本异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。

如本文所用，“实体瘤”是指除了血液学癌症(如淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤)以外的所有肿瘤性细胞生长和增殖，以及所有癌前和癌性细胞和组织。实体瘤的例子包括但不限于：软组织肉瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(ewing’stumor)和其他骨瘤(例如，骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(wilms’tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、脑/cns肿瘤(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、儿童肿瘤如非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、生殖细胞瘤、胚胎瘤、室管膜瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。本公开文本的组合物和方法将有用的一些最常见的实体瘤包括：头颈癌、直肠腺癌、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌、输卵管癌)、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(鳞状和腺癌)、小细胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、导管原位癌、肾细胞癌和肝细胞癌、肾上腺肿瘤(例如，肾上腺皮质癌)、食道癌、眼癌(例如，黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃肠道癌、肾母细胞瘤、心癌、头颈癌、喉癌和下咽癌、口腔癌(例如，唇、口、唾液腺)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、腹膜癌、垂体癌、卡波西肉瘤(kaposi’ssarcoma)、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、阴道肿瘤和前述任一种的转移瘤。

如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，并且可以是单独生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，“受试者”意指可能患有癌症并且当受癌症折磨时需要治疗的任何动物(哺乳动物、人或其他)患者。在一些实施方案中，“受试者”意指人。

如本文所用，在一些实施方案中“协同治疗效果”是指由至少两种药剂的组合产生，并且超过原本由单独施用药剂产生的治疗效果的大于累加的治疗效果。在一些实施方案中，“协同治疗效果”反映了由至少两种药剂的组合相对于药剂的单独施用产生的增强的治疗效果。例如，可以在治疗疾病或障碍中使用较低剂量的一种或多种药剂，从而导致治疗功效增加和副作用降低。

如本文所用的“治疗”(“treating”、“treat”、“treated”或“treatment”)涵盖治疗受试者(如人)的本文所述的疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起障碍的消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，治疗意指与疾病相关的症状例如得到缓和、减少、治愈或处于缓解状态。在一些实施方案中，“抑制”意指降低或减缓肿瘤的生长。在一些实施方案中，对肿瘤生长的抑制可以是例如5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、或者90％或更多。在一些实施方案中，抑制可以是完全抑制。

还应理解，如所述的医学疾病和病症的各种治疗或预防方式旨在意指“基本上的”，其包括完全的以及小于完全的治疗或预防，并且其中实现一些生物学或医学上相关的结果。

如本文所用，“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫系统的识别和清除的一个或多个过程。因此，作为治疗概念，当减弱或消除这种逃避时，肿瘤免疫被“治疗”，并且肿瘤被免疫系统识别和攻击(后者在本文中称为“抗肿瘤免疫”)。肿瘤识别的一个例子是肿瘤结合，并且肿瘤攻击的例子是肿瘤减小(数量、大小或二者)和肿瘤清除。

如本文所用，“t细胞”是指胸腺衍生的淋巴细胞，其参与多种细胞介导的适应性免疫反应。如本文所用，“效应t细胞”包括辅助t细胞、杀伤细胞和调节性t细胞。

如本文所用，“辅助t细胞”是指cd4⁺t细胞；辅助t细胞识别与mhcii类分子结合的抗原。辅助t细胞至少有两种类型，th1和th2，它们产生不同的细胞因子。

如本文所用，“细胞毒性t细胞”是指通常在其表面上携带cd8分子标记(cd8⁺)并且通过破坏在其表面上具有特异性抗原分子的靶t细胞而在细胞介导的免疫中起作用的t细胞。细胞毒性t细胞还会释放颗粒酶，即一种丝氨酸蛋白酶，它可以经由穿孔素形成的孔进入靶t细胞并且诱导细胞凋亡(细胞死亡)。颗粒酶充当细胞毒性表型的标记。细胞毒性t细胞的其他名称包括ctl、细胞溶解性t细胞、细胞溶解性t淋巴细胞、杀伤性t细胞或杀伤性t淋巴细胞。细胞毒性t细胞的靶标可以包括病毒感染的细胞、被细菌或原生动物寄生虫感染的细胞或癌细胞。大多数细胞毒性t细胞具有在其细胞表面上存在的蛋白cd8。cd8被吸引到i类mhc分子的部分。通常，细胞毒性t细胞是cd8⁺细胞。

如本文所用，“肿瘤浸润白细胞”是指患有癌症(如黑色素瘤)的受试者的白细胞，所述白细胞驻留于肿瘤中或以其他方式已经离开循环(血液或淋巴液)并且已经迁移到肿瘤中。

如本文所用，“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。在一些实施方案中，设想有用的载体是如下那些载体：其中待转录的核酸区段定位于启动子的转录控制下。“启动子”是指被细胞的合成机构或引入的合成机构识别、启动基因的特异性转录所需的dna序列。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和方向，以控制基因的rna聚合酶的启动和表达。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物学活性多肽产物或抑制性rna(例如，shrna、mirna)。根据本发明技术的pcb-ox40l-gpt载体的非限制性例子在seqidno:3中列出。根据本发明技术的puc57-hflt3l-gfp载体的非限制性例子在seqidno:4中列出。puc57-delc7-hox40l-mcherry载体的非限制性例子在seqidno:5中列出。

如本文所用的术语“毒力”是指病原体引起疾病的相对能力。术语“减弱的毒力”或“降低的毒力”在本文中用于指病原体引起疾病的相对能力降低。

ii.免疫系统和癌症

恶性肿瘤固有地对常规疗法具有抗性，并且提出了重大的治疗挑战。免疫疗法已经成为一个不断发展的研究领域，并且是治疗某些类型的癌症的另外的选择。免疫疗法方法基于如下原理：可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞，并且靶向它们进行破坏。

大量研究支持在癌症进展中免疫系统组成部分差异存在的重要性(jochems等人,exp.biol.med.236(5):567–579(2011))。临床数据表明，高密度的肿瘤浸润的淋巴细胞与改善的临床结果相联系(mlecnik等人,cancermetastasisrev.30:5–12,(2011))。在多种类型的癌症中已经报道了在强大的淋巴细胞浸润和患者存活期之间的相关性，所述癌症包括黑色素瘤、卵巢癌、头颈癌、乳腺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、结直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胆囊癌和食道癌(angell等人,currentopinioninimmunology25:1-7,(2013))。肿瘤免疫浸润物包括巨噬细胞、树突状细胞(dc)、单核细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(nk)细胞、幼稚和记忆淋巴细胞、b细胞和效应t细胞(t淋巴细胞)，它们主要负责识别肿瘤细胞表达的抗原和随后通过细胞毒性t细胞破坏肿瘤细胞。

尽管癌细胞呈递抗原，并且存在可能针对肿瘤细胞潜在地发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定被抑制。此现象的答案是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫反应影响的能力。肿瘤发展出多种免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫反应。例如，肿瘤细胞分泌免疫抑制性细胞因子(如tgf-β)，或者在肿瘤病灶中诱导免疫细胞(如cd4⁺t调节性细胞和巨噬细胞)以分泌这些细胞因子。肿瘤还具有使cd4⁺t细胞偏向表达调节表型的能力。总体结果是t细胞反应受损和细胞凋亡的诱导受损或cd8⁺细胞毒性t细胞的抗肿瘤免疫能力降低。另外，mhci类在肿瘤细胞表面上的肿瘤相关的改变表达使所述肿瘤细胞对于免疫反应是“不可见的”(garrido等人cancerimmunol.immunother.59(10):1601–1606(2010))。抑制抗原呈递功能和树突状细胞(dc)另外有助于逃避抗肿瘤免疫(gerlini等人am.j.pathol.165(6):1853–1863(2004))。

此外，肿瘤微环境的局部免疫抑制性质以及免疫编辑可以导致不表达靶抗原的癌细胞亚群逃逸。因此，找到能促进免疫系统的抗肿瘤活性的保存和/或恢复的方法将具有重大的治疗益处。

免疫检查点已经牵涉肿瘤介导的抗肿瘤免疫的下调，并且用作治疗靶标。已经证明t细胞功能障碍与抑制性受体ctla-4和程序性死亡1多肽(pd-1)(cd28受体家族的成员)的诱导表达并行发生。pd-1是cd28受体家族的抑制性成员，所述家族除了pd-1外还包括cd28、ctla-4、icos和btla。然而，尽管抗ctla-4(伊匹单抗)和抗pd-1药物(例如，派姆单抗和纳武单抗)的临床使用和甚至监管审批强调了关于在黑色素瘤的治疗中使用免疫疗法是有前景的，但是患者对这些免疫疗法的反应有限。集中于阻断t细胞中的这些抑制性信号(例如，ctla-4、pd-1和pd-1的配体pd-l1)的临床试验已经显示，逆转t细胞抑制对于成功的免疫疗法至关重要(sharma等人,science348(6230):56-61(2015)；topalian等人,curr.opin.immunol.24(2):202-217(2012))。这些观察结果强调了开发利用免疫系统抵抗癌症的新型治疗方法的需要。

iii.痘病毒：痘苗病毒(vacv)、改良安卡拉痘苗(mva)病毒和粘液瘤病毒(myxv)

痘病毒(如工程化痘苗病毒)作为用于转移癌的溶瘤疗法处在最前沿(kirn等人,naturereviewcancer9:64-71(2009))。痘病毒家族的成员痘苗病毒(vacv)是一种大型dna病毒，其具有快速的生命周期和高效的到远端组织的血源传播。痘病毒非常适合作为载体在癌细胞中表达多种转基因并由此增强治疗功效(breitbach等人,currentpharmaceuticalbiotechnology13:1768-1772(2012))。临床前研究和临床试验已证明使用溶瘤痘苗病毒和其他痘病毒治疗常规疗法难治的晚期癌症的功效(park等人,lacentoncol.9:533-542(2008)；kirn等人,plosmed4:e353(2007)；thorne等人,j.clin.invest.117:3350-3358(2007))。基于痘病毒的溶瘤疗法的优势在于通过细胞裂解、细胞凋亡与坏死的组合杀伤癌细胞。它还会触发先天免疫传感途径，这促进免疫细胞向肿瘤的募集和抗肿瘤适应性免疫反应的形成。目前处于临床试验中的溶瘤性痘苗毒株(例如，jx-594)是复制性毒株。它们使用如下野生型痘苗，其具有胸苷激酶缺失以增强肿瘤选择性，并且具有转基因(如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf))的表达以刺激免疫反应(breitbach等人,curr.pharm.biotechnol.13:1768-1772(2012))。然而，许多研究表明，野生型痘苗对抗原呈递细胞(apc)具有免疫抑制作用(engelmayer等人,j.immunol.163:6762-6768(1999)；jenne等人,genetherapy7:1575-1583(2000)；p.li等人,j.immunol.175:6481-6488(2005)；deng等人,j.virol.80:9977-9987(2006))，因此增加了肿瘤本身的免疫抑制和免疫逃避作用。

痘苗病毒(西部保留地毒株；wr)基因组序列在seqidno:2中列出，并且由genbank登录号ay243312.1给出。

改良安卡拉痘苗(mva)病毒也是痘病毒家族的成员。mva是通过在痘苗病毒的安卡拉毒株(cva)的鸡胚成纤维细胞(cef)上进行大约570次连续传代而产生的(mayr等人,infection3:6-14(1975))。这些长期传代的结果是，所得的mva病毒含有大量的基因组缺失，并且宿主细胞高度限于禽类细胞(meyer等人,j.gen.virol.72:1031-1038(1991))。在各种动物模型中都显示出所得的mva是显著无毒性的(mayr等人,dev.biol.stand.41:225-34(1978))。

mva的安全性和免疫原性已经在临床试验中进行了广泛的测试和记录，特别是针对人天花病。这些研究包括超过120,000名个体，并且已经证明在人中具有出色的功效和安全性。此外，与其他基于痘苗的疫苗相比，mva具有减弱的毒力(传染性)，同时其触发良好的特异性免疫反应。因此，已经将mva确立为安全的疫苗载体，其具有诱导特异性免疫反应的能力。

由于上述特征，mva成为了开发工程化的mva载体(用于重组基因表达和疫苗)的有吸引力的候选物。作为疫苗载体，mva已针对许多病理病症进行了研究，所述病理病症包括hiv、结核病和疟疾以及癌症(sutter等人,curr.drugtargetsinfect.disord.3:263–271(2003)；gomez等人,curr.genether.8:97–120(2008))。

已经证明，人单核细胞衍生的树突状细胞(dc)的mva感染会导致dc激活，其特征在于共刺激分子的上调和促炎细胞因子的分泌(drillien等人,j.gen.virol.85:2167-2175(2004))。在此方面，mva与无法激活dc的标准野生型痘苗病毒(wt-vac)不同。树突状细胞可以分为两种主要的亚型：常规树突状细胞(cdc)和浆细胞样树突状细胞(pdc)。前者(特别是cd103⁺/cd8α⁺亚型)特别适合于将抗原交叉呈递至t细胞；后者是i型ifn的强大生产者。

人细胞的病毒感染导致由i型干扰素(尤其是干扰素-α(α))介导的先天免疫反应(第一道防线)的激活。这通常会导致免疫学“级联”的激活，其中使激活的t细胞(ctl和辅助细胞二者)发生募集和增殖，并且最终产生抗体。然而，病毒表达抑制宿主免疫反应的因子。mva是比wt-vac更好的免疫原，并且在哺乳动物细胞中复制较差。(参见例如，brandler等人,j.virol.84:5314-5328(2010))。

然而，mva不是完全无复制性的，并且含有一些残留的免疫抑制活性。然而，已经显示出mva可延长所治疗受试者的存活期。

mva基因组序列在seqidno:1中列出，并且由genbank登录号u94848.1给出。

粘液瘤病毒(myxv)是痘病毒科(poxviridae)内兔痘病毒属(leporipoxvirusgenus)的原型成员。myxv洛桑毒株基因组(由例如genbank登录号af170726.2给出)大小为161.8kbp，编码约171个基因。基因组的中心区域编码少于100个在所有痘病毒中高度保守的基因，而末端基因组区域富集更独特的基因，所述基因编码参与破坏宿主免疫系统和其他抗病毒反应的免疫调节和宿主相互作用因子。粘液瘤病毒展现出非常受限的宿主范围，且仅对欧洲兔是致病性的。尽管myxv在自然界中的宿主范围很窄，但已经显示出myxv生产性地感染各种种类的人癌细胞。myxv作为溶瘤剂的吸引人的特征包括其生产性地感染各种人癌细胞的能力以及在所有测试的非兔宿主(包括小鼠和人)中的一致安全性。在一些实施方案中，粘液瘤病毒衍生自洛桑毒株。

v.痘苗病毒c7蛋白和包含c7缺失的mva或痘苗病毒(mvaδc7l、vacvδc7l)，或包含粘液瘤c7直系同源物缺失的粘液瘤病毒

痘苗病毒c7蛋白是在哺乳动物细胞中痘苗病毒的生命周期的重要宿主范围因子。在几乎所有感染哺乳动物宿主的痘病毒中都存在c7l同源物。宿主范围基因c7l和k1l二者的缺失使得病毒不能在人细胞中复制(perkus等人,virology,1990)。当敲除samd9时，缺乏k1l和c7l二者的突变型病毒获得了在人hela细胞中复制的能力(sivan等人,mbio,2015)。已经发现k1和c7二者均与samd9相互作用(sivan等人,mbio,2015)。irf1的过表达导致c7l和k1l双缺失的痘苗病毒的宿主限制性(meng等人,journalofvirology,2012)。c7和k1二者在体外均与samd9相互作用(sivan等人,mbio.2015)。c7是否直接调节ifn的产生或信号传导尚不清楚。i型ifn在病毒感染的宿主防御中起重要作用，但是，c7在ifn途径的免疫调节中的作用尚不清楚。

不希望受理论的束缚，据信痘苗c7是i型ifn诱导和ifn信号传导的抑制剂。tank结合激酶1(tbk1)是丝氨酸/苏氨酸激酶，其在诱导对各种病原体相关分子模式(pamp)(包括核酸)的先天免疫反应中起关键作用。一方面，rig-i样受体(如rig-i和mda5，其分别检测5'三磷酸rna和dsrna)与线粒体蛋白质ips-1或mavs相互作用，从而导致tbk1的激活和磷酸化。内体dsrna与toll样受体3(tlr3)结合，这导致trif和traf3的募集以及tbk1的激活。另一方面，胞质dna可以通过胞质dna传感器环状gmp-amp合酶(cgas)检测，这导致环状gmp-amp(cgamp)的产生。cgamp进而与内质网(er)定位衔接子sting结合，从而导致tbk1的募集和激活。tbk1磷酸化转录因子irf3，其易位至细胞核以激活ifnb基因表达。不希望受理论的束缚，据信c7抑制通过多种刺激进行的ifnb诱导，所述刺激物包括rna病毒、dna病毒、聚(i:c)、免疫刺激dna(isd)。c7可能在tbk1/irf3复合物水平上发挥其抑制作用。一旦被分泌，i型ifn就与ifnar结合，这导致jak/stat信号传导途径的激活。磷酸化的stat1和stat2易位至细胞核，在其中它们与irf9一起激活ifn刺激基因(isg)的表达。不希望受理论的束缚，据信除了具有抑制ifnb诱导的能力外，c7还可以通过其与stat2的相互作用来阻断ifnar信号传导，从而防止ifn-β诱导的stat2磷酸化。不希望受理论的束缚，据信痘苗c7具有i型ifn产生和信号传导的双重抑制作用。先前的研究已显示，从wt痘苗中缺失c7l(vacvδc7l)导致病毒的减毒，并且从mva中缺失c7l(mvaδc7l)导致与mva相比免疫刺激功能的增强。

已经显示出异位c7表达阻断sting、tbk1或irf3诱导的ifnb和isre(干扰素刺激反应元件)启动子激活。已经显示出过表达c7的鼠或人巨噬细胞细胞系对dna或rna刺激、或dna或rna病毒的感染具有减弱的先天免疫反应。还已经显示，c7的过表达减弱由ifn-β处理诱导的isg基因表达。已经显示出具有c7l缺失的mva(mvaδc7l)感染cdc比mva诱导更高水平的i型ifn。已经显示出c7经由阻止stat2磷酸化来阻断ifn-β诱导的janus激酶/信号转导子与转录激活子(jak/stat)信号传导途径。已经显示出c7与stat2直接相互作用，如通过共免疫沉淀研究证明的。

下文提供了由genbank登录号aab96405.1(seqidno:6)给出的说明性全长痘苗病毒c7宿主范围蛋白。

粘液瘤病毒有三种c7直系同源物即m62、m63、m64。粘液瘤m64与痘苗c7尽管仅具有23％序列同一性，但具有相似的结构特征。粘液瘤m62可以挽救vacvδk1lδc7l在人细胞中的复制缺陷。粘液瘤m63缺失导致在兔细胞中无复制性的重组病毒。在一些实施方案中，本公开文本的技术提供了一种工程化粘液瘤病毒，如myxvδm64r或myxvδm64r-hflt3l-mox40l。

vi.ox40配体(ox40l)

ox40配体(ox40l)及其结合配偶体肿瘤坏死因子受体ox40是tnfr/tnf超家族的成员，并在激活的cd4和cd8t细胞以及许多其他淋巴样和非淋巴样细胞上表达细胞。ox40l-ox40相互作用为表达ox40的t细胞提供存活和激活信号。ox40另外抑制treg的分化和活性，从而进一步放大该过程。ox40和ox40l还调节来自t细胞、抗原呈递细胞、nk细胞和nkt细胞的细胞因子产生，并调节细胞因子受体信号传导。本发明技术的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδe5r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r和myxvδm31r重组病毒的ox40l可以是huox40l或muox40l。

下文提供了说明性人ox40l(huox40l)核酸(seqidno:7)和多肽序列(seqidno:8)。

huox40l-orf(seqidno:7)：

huox40l多肽(seqidno:8)

mervqpleenvgnaarprfernklllvasviqglglllcftyiclhfsalqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl终止子

下文提供了说明性鼠ox40l(muox40l)核酸(seqidno:9)和多肽序列(seqidno:10)。

muox40l-orf(密码子优化的)(seqidno:9)：

atggagggcgagggggtccagcctctggacgagaacctcgaaaacgggtctcgccctcgctttaaatggaagaagactcttaggctcgttgtaagcggcatcaagggggccggtatgttgctgtgcttcatatatgtgtgtttgcaacttagctcttcacctgcaaaagacccccccatacaacgccttcggggggctgtgacccgctgtgaagatggtcaattgtttatttcttcttacaagaacgagtatcagacgatggaagtccagaataactccgtagtgattaagtgtgacggactgtacatcatctacttgaaaggatcttttttccaggaggtcaaaattgacctccacttcagggaggatcacaaccctatctcaatccctatgttgaacgacggcagaagaatcgtctttactgtagtcgcttcactggccttcaaggataaggtgtacttgaccgtaaacgctcctgataccttgtgcgagcatttgcaaatcaacgatggagaacttatcgttgtccaactcacaccaggttactgtgctcctgagggcagttatcacagtacagtgaaccaagtcccactgtga

muox40l多肽(seqidno:10)：

megegvqpldenlengsrprfkwkktlrlvvsgikgagmllcfiyvclqlssspakdppiqrlrgavtrcedgqlfissykneyqtmevqnnsvvikcdglyiiylkgsffqevkidlhfredhnpisipmlndgrrivftvvaslafkdkvyltvnapdtlcehlqindgelivvqltpgycapegsyhstvnqvpl终止子

vii.人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)

在1994年克隆出了人fms样酪氨酸激酶3配体(hflt3l)，它是刺激骨髓细胞增殖的i型跨膜蛋白(lyman等人,1994)。已经在多种临床前和临床环境中探索hflt3l的使用，所述临床前和临床环境包括用于骨髓移植的准备中的干细胞动员、癌症免疫疗法(如树突状细胞的扩增)以及疫苗佐剂。重组人flt3l(rhuflt3l)已经在超过500名的人受试者中进行了测试，并且具有生物活性、安全和良好耐受性。在理解生长因子flt3l在dc子集(包括cd8α⁺/cd103⁺dc和pdc)发育中的关键作用方面已经取得了很大进展。

cd103⁺/cd8α⁺dc为肿瘤抗原特异性cd8⁺t细胞的自发交叉引发所需。据报道，cd103⁺dc稀疏地存在于肿瘤内，并且它们与大量的肿瘤相关巨噬细胞竞争肿瘤抗原。cd103⁺dc能够独特地刺激幼稚以及激活的cd8⁺t细胞，并且对于过继性t细胞疗法的成功至关重要(broz等人cancercell,26(5):638-52(2014))。spranger等人报道，致癌性信号传导途径wnt/β-连环蛋白的激活导致肿瘤内cd103⁺dc和抗肿瘤t细胞的减少(spranger等人,2015)。flt3l培养的骨髓衍生的树突状细胞(bmdc)的瘤内递送导致对抗ctla-4和抗pd-l1免疫疗法的组合的反应性(spranger等人,2015)。全身施用flt3l(cd103⁺dc的生长因子)和瘤内注射聚i:c(tlr3激动剂)扩增并且激活了肿瘤内的cd103⁺dc群体，并且克服了鼠黑色素瘤和mc38结肠癌模型中的免疫疗法抗性，或增强了对所述免疫疗法的反应性。

在各种实体瘤中肿瘤新抗原的最新发现指示，实体瘤带有通常因人而异的独特的新抗原(castle等人,cancerres72:1081-1091(2012)；schumacher等人,science348:69-74(2015))。本文公开的基因工程化或重组病毒不通过表达肿瘤抗原发挥其活性。本发明的基因工程化或重组mva病毒的瘤内递送允许肿瘤新抗原的有效交叉呈递和瘤内抗肿瘤适应性免疫的产生(并且还全身地扩展)，并且因此在产生针对肿瘤的免疫反应方面导致利用肿瘤分化抗原和通过肿瘤细胞表达的新抗原进行“原位癌症疫苗接种”。

尽管肿瘤内存在通过体细胞突变产生的新抗原，但是肿瘤抗原特异性t细胞的功能通常受到多种抑制机制的约束(mellman等人,nature480,480-489(2011))。例如，激活的t细胞上的细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)的上调可以与t细胞共刺激物cd28竞争，以与树突状细胞(dc)上的cd80(b71)/cd86(b7.2)相互作用，从而抑制t细胞激活和增殖。ctla-4也在调节性t(treg)细胞上表达，并且在介导treg的抑制功能中起重要作用(wing等人,science322:271-275(2008)；peggs等人,j.exp.med.206:1717-1725(2009))。另外，pd-l/pd-l2在肿瘤细胞上的表达可能导致cd28家族抑制性受体pd-1的激活，从而导致t细胞枯竭。利用针对抑制性受体(如ctla-4和程序性死亡1多肽(pd-1))的抗体的免疫疗法在动物研究中显示出显著的临床前活性并且在患有转移性癌症的患者中显示出临床反应，并且已经获得fda的批准用于转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌以及肾细胞癌的治疗(leach等人,science271:1734-1746(1996)；hodi等人,nejm363:711-723(2010)；robert等人,nejm364:2517-2526(2011)；topalian等人,cancercell27:450-461(2012)；sharma等人,science348(6230):56-61(2015))。viii.δe3l和e3lδ83n

痘病毒非常善于通过编码禁止多种先天免疫信号传导途径的细胞外和细胞内组分的蛋白质来逃避和拮抗那些途径(seet等人annu.rev.immunol.21:377-423(2003))。在细胞内先天免疫信号传导的痘病毒拮抗剂中，最主要的是痘苗病毒双重z-dna和dsrna结合蛋白e3，它们可以抑制原本将被痘苗病毒激活的pkr和nf-κb途径(cheng等人,proc.natl.acad.sci.usa89:4825-4829(1992)；deng等人,j.virol.80:9977-9987(2006))。缺少e3l基因(δe3l)的突变型痘苗病毒具有受限的宿主范围，对ifn高度敏感，并且在致命的痘病毒感染的动物模型中具有显著降低的毒力(beattie等人,virusgenes1289-94(1996)；brandt等人,virology333263-270(2004))。最近的研究已经显示，用δe3l病毒感染培养的细胞系会引起促炎反应，所述促炎反应在野生型痘苗病毒感染期间被遮蔽(deng等人,j.virol.80:9977-9987(2006)；langland等人j.virol.80:10083-10095)。用野生型痘苗病毒感染小鼠表皮树突状细胞系减弱针对tlr激动剂脂多糖(lps)和聚(i:c)的促炎反应，这种效应通过e3l的缺失而减小。此外，在不存在外源激动剂的情况下，用δe3l病毒感染树突状细胞触发nf-κb激活(deng等人,j.virol.80:9977-9987(2006))。野生型痘苗病毒感染鼠角质形成细胞不诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生，而用δe3l病毒感染确实诱导从鼠角质形成细胞产生ifn-β、il-6、ccl4和ccl5，这取决于由线粒体抗病毒信号传导蛋白(mavs；用于胞质rna传感器rig-i和mda5的衔接子)和转录因子irf3介导的胞质dsrna传感途径(deng等人,j.virol.82(21):10735–10746(2008))。

在鼻内感染模型中，具有z-dna结合结构域缺失的e3lδ83n病毒比野生型痘苗病毒减弱了1,000倍(brandt等人,2001)。在颅内接种模型中，e3lδ83n还具有与野生型痘苗相比降低的神经毒力(brandt等人,2005)。e3的z-dna结合结构域内导致降低的z-dna结合的突变(y48a)导致降低的神经毒力(kim等人,2003)。尽管e3的n末端z-dna结合结构域在病毒发病机制中是重要的，但是它如何影响痘苗病毒的宿主先天免疫传感尚未被充分理解。粘液瘤病毒感染而不是野生型痘苗感染鼠浆细胞样树突状细胞经由tlr9/myd88/irf5/irf7依赖性途径诱导i型ifn产生(dai等人,2011)。粘液瘤病毒e3直系同源物m029保留e3的dsrna结合结构域，但是缺少e3的z-dna结合结构域。发现e3的z-dna结合结构域(但可能不是z-dna结合活性本身)在抑制鼠和人pdc中的痘病毒传感中具有重要作用(dai等人,2011；cao等人,2012)。

e3l的缺失使痘苗病毒复制对允许性rk13细胞中的ifn抑制敏感，并且导致宿主范围表型，借此δe3l在hela或bsc40细胞中无法复制(chang等人,1995)。e3的c末端dsrna结合结构域负责宿主范围效应，而缺失n末端z-dna结合结构域的e3lδ83n病毒在hela和bsc40细胞中有复制能力(brandt等人,2001)。

具有胸苷激酶缺失的痘苗病毒(西部保留地毒株；wr)在非分裂细胞中高度减毒，但是在转化的细胞中是复制性的(buller等人,1988)。tk缺失的痘苗病毒在体内肿瘤细胞中选择性复制(puhlmann等人,2000)。thorne等人显示，与其他痘苗毒株相比，wr毒株在肿瘤细胞系中相对于正常细胞具有最高破裂比率(thorne等人,2007)。

ix.痘苗病毒e5是胞质dna传感器cgas的主导抑制剂

胞质dna传感器cgas在检测病毒核酸，从而导致i型ifn产生中起着重要作用。已经显示，用改良安卡拉痘苗病毒(mva)(一种高度减毒的痘苗毒株)感染常规树突状细胞会经由cgas/sting依赖性机制诱导ifn产生。然而，mva感染会触发cgas降解。痘苗病毒(vacv)是细胞质dna病毒，其编码超过200个基因。如实验实施例部分中所述，使用双萤光素酶系统针对hek293t细胞中cgas/sting途径的抑制对七十个痘苗病毒早期基因进行筛选。发现痘苗e5r是cgas的主导抑制剂，并且是介导cgas降解的关键蛋白。在多种细胞类型中，mvaδe5r比mva诱导高得多的i型ifn水平，所述多种细胞类型包括骨髓衍生的树突状细胞(bmdc)、骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm)和皮肤原代成纤维细胞(图57c和图57d；图76a和图76b)。mvaδe5r介导的i型ifn产生取决于cgas(图58a至图58c)。此外，mvaδe5r获得在cgas^-/-皮肤成纤维细胞中的复制能力(图77c和图77d)。作为疫苗载体，使用mvaδe5r-ova的皮肤划痕或皮内疫苗接种在体内导致比mva-ova高得多的ova特异性cd8⁺t细胞反应(图75b和图75c)。与mva相比，瘤内注射mvaδe5r导致更强的抗肿瘤免疫反应和更好的存活(图91a至图91c)。最后，在鼻内感染模型中，与wtvacv相比，vacvδe5r减毒了至少1000倍(图55b)。一并考虑，这些结果提供了有力的证据表明，e5是靶向胞质dna传感器cgas，从而抑制i型ifn产生的关键病毒毒力因子。本发明技术的诸位发明人是描述e5r在免疫逃避中的作用的第一人。

下文提供了由genbank登录号aab59825.1(seqidno:20)给出的说明性全长痘苗病毒e5r宿主范围蛋白。

mliltkvniymliivlwlygynfiisesqcpminddsftlkrkyqidsaestikmdkkrtkfqnrakmvkeinqtiraaqthyetlklgyikfkrmirtttlediapsipnnqktyklfsdisaigkasrnpskmvyalllymfpnlfgddhrfiryrmhpmskikhkifspfklnlirilveerfynnecrsnkwriigtqvdkmliaesdkytidarynlkpmyrikgkseedtlfikqmveqcvtsqelvekvlkilfrdlfksgeykayrydddvengfigldtlklnivhdivepcmpvrrpvakilckemvnkyfenplhiigknlqecidfvse

痘苗病毒e5r的粘液瘤直系同源物是m31r。下文提供了由genbank登录号aaf14919.1(seqidno:21)给出的说明性全长粘液瘤病毒m31r蛋白。

x.本发明技术的工程化痘病毒毒株

mvaδc7l

本发明技术的公开文本涉及一种c7l突变型改良安卡拉痘苗(mva)病毒(即，mvaδc7l；包含c7l缺失的mva病毒；被基因工程化以包含突变型c7l基因的mva)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，其中所述病毒被工程化以表达一个或多个特定目的基因(sg)如ox40l(mvaδc7l-ox40l)，以及它们作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，mva病毒的c7基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致c7敲除，使得c7基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δc7l突变体包括代替c7l基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，在一些实施方案中，将对应于mva基因组中c7的位置(例如，seqidno:1的位置18,407至18,859)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到mvaδc7l-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码hflt3l，从而得到mvaδc7l-hflt3l。

(参见例如图5a)。

另外或可替代地，在一些实施方案中，mvaδc7l被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，mva病毒的胸苷激酶(tk)基因(例如，seqidno:1的位置75,560至76,093)通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk基因敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得mvaδc7l-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)(参见例如图5b)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l或hflt3l，从而得到mvaδc7l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在c7基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致c7敲除，使得c7基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入c7基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。

另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含表达盒，所述表达盒包含编码两个或更多个特定目的基因的两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框由在5'至3'方向上编码蛋白酶切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)和2a肽(pep2a)序列的核苷酸序列分隔开。例如，在一些实施方案中，mvaδc7l涵盖重组mva病毒，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l(参见例如图93a)。作为另一个例子，在一些实施方案中，本发明技术提供了一种通过进行三种单独修饰形成的重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40lδe5r病毒。第一修饰涉及通过在c8l和c6r基因座处的同源重组将c7l基因用包含表达盒的异源核酸序列替换，所述表达盒包含编码hflt3l的开放阅读框，从而形成mvaδc7l-hflt3l。对于第二修饰，通过在tk基因座处的同源重组，将tk基因用包含表达盒的异源核酸序列替换，所述表达盒包含编码ox40l的开放阅读框，从而形成mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l。对于第三修饰，通过在e4l和e6r基因座处的同源重组，将e5r基因用包含表达盒的异源核酸序列替换，所述表达盒包含编码选择性标记如mcherry的开放阅读框，从而形成mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40lδe5r(参见例如图92a)。

在一些实施方案中，上述重组mvaδc7l-ox40l病毒被修饰以表达至少一个另外的异源基因，如hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括以下痘苗病毒缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。

尽管在上述某些实施方案中，可以将转基因插入tk基因座中，从而分裂tk基因并使其消失，但可以选择其他合适的整合基因座。例如，mva编码若干个免疫调节基因，包括但不限于c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199。因此，在一些实施方案中，可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。例如，在一些实施方案中，本发明技术提供了一种mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒，其从e5r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如ox40l或ox40l和hflt3l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了c7l或c7l和tk以外的另外病毒基因。

在一些实施方案中，异源核苷酸序列还包含另外的表达盒，其含有编码与启动子可操作连接的选择性标记的开放阅读框，所述启动子能够引导所述选择性标记的表达(图5a至图5b)。在一些实施方案中，选择性标记是黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)基因。在一些实施方案中，选择性标记是绿色荧光蛋白(gfp)基因。在一些实施方案中，选择性标记是编码红色荧光蛋白的mcherry基因。

根据本发明技术的ox40l表达构建体开放阅读框的非限制性例子示于seqidno:3和5(表1)中。根据本发明技术的hflt3l表达构建体的非限制性例子示于seqidno:4(表1)中。

由genbank登录号u94848.1给出的mva病毒基因组序列(seqidno:1)提供于图22中。在一些实施方案中，表达ox40l的工程化mvaδc7l病毒通过以下方式产生：将表达构建体(如由seqidno:3和5所示的那些)插入对应于tk基因座的位置(例如，seqidno:1的位置75,560至76,093)的mva基因组区域中。另外或可替代地，在一些实施方案中，工程化mvaδc7l-ox40l通过以下方式被进一步修饰以表达hflt3l：将表达构建体(如由seqidno:4所示的表达构建体)插入对应于c7基因座的mva基因组区域(例如，seqidno:1的位置18,407至18,859)中。

mvaδe3l

本发明技术的公开文本涉及一种e3l突变型改良安卡拉痘苗(mva)病毒(即，mvaδe3l；包含e3l缺失的mva病毒；被基因工程化以包含突变型e3l基因的mva病毒)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，其中所述病毒被工程化以表达一个或多个特定目的基因(sg)如ox40l(mvaδe3l-ox40l)，以及它们作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，mva病毒的胸苷激酶(tk)基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得mvaδe3l-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)。例如，在一些实施方案中，将对应于mvaδe3l基因组中tk的位置(例如，seqidno:1的位置75,798至75,868)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到mvaδe3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l。

尽管在上述某些实施方案中，可以将转基因(例如，ox40l)插入tk基因座中，从而分裂tk基因并使其消失，但可以选择其他合适的整合基因座。例如，mva编码若干个免疫调节基因，包括但不限于c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199。因此，在一些实施方案中，可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。

在一些实施方案中，上述重组mvaδe3l-ox40l病毒被修饰以表达至少一个其他异源基因，如hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：c7；e3lδ83n；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如，ox40l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了e3l或e3l和tk以外的另外病毒基因。

在一些实施方案中，mvaδe3l被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在e3基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致e3敲除，使得e3基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到mvaδe3l-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入e3基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。

另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含表达盒，所述表达盒包含编码两个或更多个特定目的基因的两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框由在5'至3'方向上编码蛋白酶切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)和2a肽(pep2a)序列的核苷酸序列分隔开。

在一些实施方案中，异源核苷酸序列还包含另外的表达盒，其含有编码与启动子可操作连接的选择性标记的开放阅读框，所述启动子能够引导所述选择性标记的表达(参见例如图1)。在一些实施方案中，选择性标记是黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)基因。在一些实施方案中，选择性标记是绿色荧光蛋白(gfp)基因。在一些实施方案中，选择性标记是编码红色荧光蛋白的mcherry基因。

根据本发明技术的ox40l表达构建体开放阅读框的非限制性例子在显示于上表1中。

mvaδe5r

本发明技术的公开文本涉及一种e5r突变型改良安卡拉痘苗(mva)病毒(即，mvaδe5r；包含e5r缺失的mva病毒；被基因工程化以包含突变型e5r基因的mva)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，以及它们作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，mva病毒的e5r基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致e5r敲除，使得e5r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δe5r突变体包括代替e5r基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，在一些实施方案中，将对应于mva基因组中e5r的位置(例如，seqidno:1的位置38,432至39,385)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到mvaδe5r-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码hflt3l，从而得到mvaδe5r-hflt3l。

在一些实施方案中，mvaδe5r病毒被工程化以表达一个或多个特定目的基因(sg)，如选自hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个的异源基因，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失或突变中的任何一个或多个：c7(δc7)；e3l(δe3l)；e3lδ83n；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r(δe5r)；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在一些实施方案中，mvaδe5r病毒选自mvaδe3lδe5r、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15rα或mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199。

在一些实施方案中，mva病毒的胸苷激酶(tk)基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得mvaδe5r-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)。例如，在一些实施方案中，将对应于mvaδe5r基因组中tk的位置(例如，seqidno:1的位置75,798至75,868)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到mvaδe5r-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l。

在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如，ox40l、hflt3l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了e5r或e5r和tk以外的另外病毒基因。

在一些实施方案中，mvaδe5r被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在e5r基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致e5r敲除，使得e5r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到mvaδe5r-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入e5r基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。

另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含表达盒，所述表达盒包含编码两个或更多个特定目的基因的两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框由在5'至3'方向上编码蛋白酶切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)和2a肽(pep2a)序列的核苷酸序列分隔开。例如，在一些实施方案中，mvaδe5r涵盖重组mva，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如mvaδe5r-hflt3l-ox40l(参见例如图81)。

在一些实施方案中，异源核苷酸序列还包含另外的表达盒，其含有编码与启动子可操作连接的选择性标记的开放阅读框，所述启动子能够引导所述选择性标记的表达。在一些实施方案中，选择性标记是黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)基因。在一些实施方案中，选择性标记是绿色荧光蛋白(gfp)基因。在一些实施方案中，选择性标记是编码红色荧光蛋白的mcherry基因。

根据本发明技术的表达和缺失构建体开放阅读框的非限制性例子示于(表2)中。

在一些实施方案中，工程化mvaδe5r病毒通过以下方式产生：将表达构建体(如由seqidno:22-24和32(表2)所示的那些)插入对应于e5r基因座的位置(例如，seqidno:1的位置38,432至39,385；或genbank登录号ay603355中列出的序列的位置38,389至39,389)的mva基因组区域。在一些实施方案中，mvaδe5r病毒通过以下方式被进一步工程化：将表达构建体(如由seqidno:31所示的表达构建体)插入对应于e3l基因座的mva基因组区域(例如，genbank登录号ay603355中列出的序列的位置36,931至37,497)中。在一些实施方案中，mvaδe5r病毒通过以下方式被进一步工程化：将表达构建体(如由seqidno:33所示的表达构建体)插入对应于c11r基因座的mva基因组区域(例如，genbank登录号ay603355中列出的序列的位置4,160-4,785)中。

根据本发明技术的mvaδk7r构建体开放阅读框的非限制性例子示于seqidno:25(表3)中。

vacvδc7l

本发明技术的公开文本涉及一种c7l突变型痘苗病毒(即，vacvδc7l；包含c7l缺失的vacv病毒；被基因工程化以包含突变型c7l基因的vacv)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，其中所述病毒被工程化以表达一个或多个特定目的基因(sg)如ox40l(vacvδc7l-ox40l)，以及其作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，痘苗病毒的c7基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致c7敲除，使得c7基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δc7l突变体包括代替c7l基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，在一些实施方案中，将对应于vacv基因组中c7的位置(例如，seqidno:2的位置15,716至16,168)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到vacvδc7l-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码hflt3l，从而得到vacvδc7l-hflt3l。

另外或可替代地，在一些实施方案中，vacvδc7l被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，痘苗病毒的胸苷激酶(tk)基因(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk基因敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得vacvδc7l-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l，从而得到vacvδc7l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在c7基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致c7敲除，使得c7基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到vacvδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入c7基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。在一些实施方案中，vacvδc7l-抗ctla-4-hflt3l-tk(-)病毒被进一步修饰以编码ox40l，从而得到vacvδc7l-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l。在一些实施方案中，vacvδc7l-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒被进一步修饰以表达hil-12，从而得到vacvδc7l-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12。

在一些实施方案中，本发明技术的公开文本提供了一种vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-ox40l病毒。在一些实施方案中，本发明技术的公开文本提供了一种vacvδc7l-e3lδ83n-tk(-)-hflt3l-抗ctla-4-ox40l病毒。

在一些实施方案中，上述重组vacvδc7l-ox40l病毒被修饰以表达至少一个另外的异源基因，如hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如，ox40l或ox40l和hflt3l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了c7l或c7l和tk以外的另外病毒基因。

尽管在上述某些实施方案中，可以将转基因插入tk基因座中，从而分裂tk基因并使其消失，但可以选择其他合适的整合基因座。例如，vacv编码若干个免疫调节基因，包括但不限于c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199。因此，在一些实施方案中，可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。

vacvδe5r

本发明技术的公开文本涉及一种e5r突变型痘苗病毒(即，vacvδe5r；包含e5r缺失的vacv病毒；被基因工程化以包含突变型e5r基因的vacv)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，其中所述病毒被工程化以表达一个或多个特定目的基因(sg)如ox40l(vacvδe5r-ox40l)，以及其作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，痘苗病毒的e5r基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致e5r敲除，使得e5r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δe5r突变体包括代替e5r基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，在一些实施方案中，将对应于vacv基因组中e5r的位置(例如，seqidno:2的位置49,236至50,261)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到vacvδe5r-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码hflt3l，从而得到vacvδe5r-hflt3l。

另外或可替代地，在一些实施方案中，vacvδe5r被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，痘苗病毒的胸苷激酶(tk)基因(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk基因敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得vacvδe5r-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l，从而得到vacvδe5r-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在e5r基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致e5r敲除，使得e5r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到vacvδe5r-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入e5r基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。在一些实施方案中，vacvδe5r-抗ctla-4-hflt3l-tk(-)病毒被进一步修饰以编码ox40l，从而得到vacvδe5r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l。在一些实施方案中，vacvδe5r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒被进一步修饰以表达hil-12，从而得到vacvδe5r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12。在一些实施方案中，vacvδe5r被工程化以包含编码il-15/il-15rα的核酸(vacvδe5r-il-15/il-15rα)，单独地或与如本文所述的一个或多个另外的修饰组合。例如，在一些实施方案中，vacvδe5r-il-15/il-15rα被进一步工程化以包含编码ox40l的核酸(vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l)。

另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含表达盒，所述表达盒包含编码两个或更多个特定目的基因的两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框由在5'至3'方向上编码蛋白酶切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)和2a肽(pep2a)序列的核苷酸序列分隔开。例如，在一些实施方案中，痘苗基因组的tk基因座通过同源重组被修饰以表达抗体如抗ctla-4的重链和轻链二者，其中重链和轻链的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，以产生vacv-tk(-)-抗ctla-4。在一些实施方案中，vacv-tk(-)-抗ctla-4基因组被进一步修饰以包含e5r缺失，其中e5r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hflt3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如vacv-tk^--抗ctla-4-e5r^--hflt3l-ox40l(或vacvδe5r-tk(-)-抗ctla-4-hflt3l-ox40l)(参见例如图85a)。

在一些实施方案中，上述基因工程化或重组vacvδe5r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如，ox40l或ox40l和hflt3l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了e5r或e5r和tk以外的另外病毒基因。

尽管在上述某些实施方案中，可以将转基因插入tk基因座中，从而分裂tk基因并使其消失，但可以选择其他合适的整合基因座。例如，vacv编码若干个免疫调节基因，包括但不限于c7、c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199。因此，在一些实施方案中，可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。

在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如，ox40l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了e5r或e5r和tk以外的另外病毒基因。

根据本发明技术的vacvδe5r构建体开放阅读框的非限制性例子示于seqidno:26-28(表4)中。

在一些实施方案中，工程化vacvδe5r病毒通过以下方式产生：将表达构建体(如由seqidno:26-28(表4)所示的那些)插入对应于e5r基因座的位置(例如，seqidno:2的位置49,236至50,261)的vacv基因组区域中。

用于使用例如基于pcb质粒的载体插入vacv的tk基因座中的抗ctla-4抗体开放阅读框的非限制性例子示于seqidno:29(表5)中。

用于根据本发明技术例如使用例如vacv-e3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-hil-12构建体工程化所凭借的puc57载体插入例如e5r基因座中的il-12表达构建体的非限制性例子示于seqidno:35-38(表5a)中(还参见图169)。

在一些实施方案中，本发明技术的工程化vacv病毒包含表达构建体(如由seqidno:29(表5)所示的表达构建体)，所述表达构建体插入对应于tk基因座的位置(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)的vacv基因组区域中。

vacvδb2r

vacvb2r基因编码波辛(poxin)，其是在宿主cgas-sting先天免疫的病毒逃避中起作用的一种核酸酶。本发明技术的公开文本涉及一种b2r突变型痘苗病毒(即，vacvδb2r；包含b2r缺失的vacv病毒；被基因工程化以包含突变型b2r基因的vacv)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，其中所述病毒被工程化以表达一个或多个特定目的基因(sg)如ox40l(vacvδb2r-ox40l)，以及其作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，痘苗病毒的b2r基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致b2r敲除，使得b2r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δb2r突变体包括代替b2r基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，在一些实施方案中，将对应于vacv基因组中b2r的位置(例如，seqidno:2的位置164,856至165,530)的核酸序列用异源核酸序列替换。在一些实施方案中，异源核酸序列包含编码选择性标记的开放阅读框。在一些实施方案中，选择性标记是荧光蛋白(例如，gpt、gfp、mcherry)。在一些实施方案中，vacvδb2r病毒涵盖不表达功能性b2r蛋白的重组vacv。在一些实施方案中，将特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l)插入vacv基因组的b2r基因座中，从而分裂b2r基因并将使其消失。

另外或可替代地，在一些实施方案中，vacvδb2r被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，痘苗病毒的胸苷激酶(tk)基因(例如，seqidno:2的位置80,962至81,032)通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk基因敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得vacvδb2r-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l，从而得到vacvδb2r-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在b2r基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致b2r敲除，使得b2r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到vacvδb2r-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入b2r基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。在一些实施方案中，vacvδb2r-抗ctla-4-hflt3l-tk(-)病毒被进一步修饰以编码ox40l，从而得到vacvδb2r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l。在一些实施方案中，vacvδb2r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒被进一步修饰以表达hil-12，从而得到vacvδb2r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12。在一些实施方案中，vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-hil-12基因组被修饰以包含b2r缺失(vacvδe3l83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r)(参见例如图168)。

在一些实施方案中，上述基因工程化或重组vacvδb2r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7(δc7l)；b19r(b18r；δwr200)；e5r(δe5r)；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在一些实施方案中，基因工程化或重组vacvδb2r病毒选自vacvδb2r-δe5r、vacvδb2r-δe5r-e3lδ83n和vacvδb2r-e3lδ83n。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了本文病毒名称中提供的那些以外的另外病毒基因。

尽管在上述某些实施方案中，可以将转基因插入b2r基因座中，从而分裂b2r基因并使其消失或将其替换，但可以选择其他合适的整合基因座。例如，vacv编码若干个免疫调节基因，包括但不限于c7、c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199。因此，在一些实施方案中，可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。

根据本发明技术的包含编码选择性标记的开放阅读框的vacvδb2r缺失构建体的非限制性例子示于seqidno:30(表7)中。

在一些实施方案中，工程化vacvδb2r病毒通过以下方式产生：将表达构建体(如由seqidno:30(表7)所示的表达构建体)插入对应于b2r基因座的位置(例如，seqidno:2的位置164,856至165,530)的vacv基因组区域中。

mvaδwr199

根据本发明技术的mvaδwr199构建体开放阅读框的非限制性例子示于seqidno:34(表8)中。在一些实施方案中，包含δwr199突变体的mva通过以下方式产生：例如用wr199敲除质粒将表达构建体(如由seqidno:34所示的表达构建体)插入对应于wr199基因座的位置(例如，genbank登录号ay603355中列出的序列的位置158,399至160,143)的mva基因组区域中(参见例如图153)。

myxvδm31r

粘液瘤m31r与vacve5r是直系同源的(参见图88b)。本发明技术的公开文本涉及一种m31r突变粘液瘤病毒(即，myxvδm31r；包含m31r缺失的myxv；被基因工程化以包含突变型m31r基因的myxv)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，以及其作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，myxvδm31r病毒被工程化以表达一种或多种特定目的基因(sg)如ox40l，以用作癌症免疫治疗剂(myxvδm31r-ox40l)。在一些实施方案中，粘液瘤病毒衍生自毒株洛桑(由例如genbank登录号af170726.2给出)。在一些实施方案中，粘液瘤病毒的m31r基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致m31r敲除，使得m31r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δm31r突变体包括代替m31r基因序列的全部或大部分的异源核酸序列。例如，在一些实施方案中，将对应于myxv基因组中m31r的位置(例如，粘液瘤基因组的位置30,138至31,319)的核酸序列用包含编码特定目的基因(sg)如人ox40l的开放阅读框的异源核酸序列替换，从而得到myxvδm31r-ox40l。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码hflt3l，从而得到myxvδm31r-hflt3l。

另外或可替代地，在一些实施方案中，myxvδm31r被工程化以表达ox40l和hflt3l二者。在一些实施方案中，粘液瘤病毒的胸苷激酶(tk)基因(例如，粘液瘤基因组的位置57,797至58,333)通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致tk基因敲除，使得tk基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。所得myxvδm31r-tk(-)病毒被进一步工程化以包含一个或多个表达盒，所述一个或多个表达盒在任一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l和tk-r)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)编码特定目的基因(sg)如ox40l，从而得到myxvδm31r-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，重组病毒通过同源重组在m31r基因座处进一步修饰，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致m31r敲除，使得m31r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，表达盒包含单一开放阅读框，所述单一开放阅读框编码特定目的基因(sg)如hflt3l，从而得到myxvδm31r-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，将编码ox40l的表达盒插入m31r基因座中，同时将编码hflt3l的表达盒插入tk基因座中。在一些实施方案中，myxvδm31r-抗ctla-4-hflt3l-tk(-)病毒被进一步修饰以编码ox40l，从而得到myxvδm31r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l。在一些实施方案中，myxvδm31r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒被进一步修饰以表达hil-12，从而得到myxvδm31r-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12。

在一些实施方案中，上述基因工程化或重组myxvδm31r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些(例如，ox40l或ox40l和hflt3l)以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了m31r或m31r和tk以外的另外病毒基因。

尽管在上述某些实施方案中，可以将转基因插入tk基因座中，从而分裂tk基因并使其消失，但可以选择其他合适的整合基因座。例如，myxv编码若干个免疫调节基因，包括但不限于c7、c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199。因此，在一些实施方案中，可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。

另外或可替代地，在一些实施方案中，异源核酸序列包含表达盒，所述表达盒包含编码两个或更多个特定目的基因的两个或更多个开放阅读框，所述两个或更多个开放阅读框由在5'至3'方向上编码蛋白酶切割位点(例如，弗林蛋白酶切割位点)和2a肽(pep2a)序列的核苷酸序列分隔开。例如，在一些实施方案中，myxvδm31r涵盖重组myxv，其中m31r基因序列的全部或大部分被第一特定目的基因(例如，hftl3l)和第二特定目的基因(例如，ox40l)替换，其中第一和第二特定目的基因的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而形成重组病毒，如myxvδm31r-hflt3l-ox40l。

myxvδm63r和myxvδm64r

本发明技术的公开文本涉及一种m63r突变型粘液瘤病毒(即，myxvδm63r；包含m63r缺失的myxv；被基因工程化以包含突变型m63r基因的myxv)，和一种m64r突变型粘液瘤病毒(即，myxvδm64r、包含m64r缺失的myxv；被基因工程化以包含突变型m64r基因的myxv)，或包含所述病毒的免疫原性组合物，以及其作为癌症免疫治疗剂的用途。在一些实施方案中，将m63r或m64r突变体插入myxvδm127mcherry基因组中(参见例如图170)。在一些实施方案中，myxvδm63r或myxvδm64r病毒被工程化以表达一种或多种特定目的基因(sg)(如本文公开的那些)，以用作癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，粘液瘤病毒衍生自毒株洛桑(由例如genbank登录号af170726.2给出)。在一些实施方案中，粘液瘤病毒的m63r或m64r基因通过同源重组工程化，以含有包含异源核酸序列的破坏，所述异源核酸序列包含一个或多个表达盒，所述破坏导致m63r或m64r敲除，使得m63r或m64r基因不被表达，表达水平低至无作用，或者所表达蛋白质无功能(例如，是无效突变)。在一些实施方案中，δm63r或δm64r突变体包括异源核酸序列(例如，包含编码特定目的基因(sg)的开放阅读框的异源核酸序列)。

在一些实施方案中，上述基因工程化或重组myxvδm63r或myxvδm64r病毒被修饰以表达至少一个异源基因，如hox40l、hflt3l、hil-2、hil-12、hil-15、hil-15/il-15rα、hil-18、hil-21、抗huctla-4、抗hupd-1、抗hupd-l1、gitrl、4-1bbl或cd40l中的任何一个或多个，和/或包括至少一个其他病毒基因突变或缺失，如以下缺失中的任何一个或多个：e3l(δe3l)；e3lδ83n；c7(δc7l)；b2r(δb2r)；b19r(b18r；δwr200)；e5r；k7r；c12l(il18bp)；b8r；b14r；n1l；c11r；k1l；m1l；n2l；和/或wr199。在其他实施方案中，不添加除了本文病毒名称中提供的那些以外的另外异源基因，和/或不破坏或缺失除了m63r或m64r以外的另外病毒基因。

根据本发明技术的mvaδ63r和mvaδ64r构建体开放阅读框的非限制性例子示于seqidno:39和40(表9)中。

xi.黑色素瘤

黑色素瘤(最致命的癌症之一)是美国和全球增长最快的癌症。在大多数情况下，晚期黑色素瘤对常规疗法(包括化学疗法和放射)具有抗性。因此，患有转移性黑色素瘤的人具有非常差的预后，预期寿命只有6到10个月。约50％的黑色素瘤在braf(关键的促肿瘤基因)中具有突变的发现为这种疾病的靶向疗法打开了大门。使用braf抑制剂的早期临床试验显示，在患有具有braf突变的黑色素瘤的患者中，反应显著，但不幸地无法持续。因此，迫切需要用于这些患者以及无braf突变的其他黑色素瘤患者的替代治疗策略。

人类病理学数据指示黑色素瘤病变内t细胞浸润物的存在与更长的患者存活期正相关(oble等人,cancerimmun.9:3(2009))。免疫系统在针对黑色素瘤提供保护中的重要性得到以下的进一步支持：免疫疗法如免疫激活因子ifn-α2b和il-2的部分成功(lacy等人,expertrev.dermatol.7(1):51-68(2012))以及患有转移性黑色素瘤的患者对免疫检查点疗法(包括作为单独的或组合疗法中的药剂的抗ctla-4和抗pd-1/pd-l1)的前所未有的临床反应(sharma和allison,science348(6230)”56-61(2015)；hodi等人,nejm363(8):711-723(2010)；wolchok等人,lancetoncol.11(6):155-164(2010)；topalian等人,nejm366(26):2443-2454(2012)；wolchok等人,nejm369(2):122-133(2013)；hamid等人,nejm369(2):134-144(2013)；tumeh等人,nature515(7528):568-571(2014))。然而，许多患者对单独的免疫检查点阻断疗法无反应。

xii.肿瘤免疫中的i型ifn和胞质dna传感途径

i型ifn在宿主抗肿瘤免疫中起重要作用(fuertes等人,trendsimmunol.34:67-73(2013))。ifnar1缺陷型小鼠在植入肿瘤细胞后更容易患上肿瘤；自发的肿瘤特异性t细胞引发在ifnar1缺陷型小鼠中也存在缺陷(diamond等人,j.exp.med.208:1989-2003(2011)；fuertes等人,j.exp.med.208:2005-2016(2011))。最近的研究显示，胞质dna传感途径在肿瘤衍生的dna的先天免疫传感中很重要，所述先天免疫传感导致抗肿瘤cd8+t细胞免疫的形成(woo等人,immunity41:830-842(2014))。此途径在放射诱导的抗肿瘤免疫中也起作用(deng等人,immunity4:843-852(2014))。尽管可以在患有癌症的患者体内检测到自发的抗肿瘤t细胞反应，但是在大多数患者体内癌症最终克服了宿主抗肿瘤免疫。改变肿瘤免疫抑制性微环境的新型策略将有益于癌症疗法。

xiii.免疫反应

除了通过上调特定的免疫系统活性(如抗体和/或细胞因子的产生、或细胞介导的免疫的激活)来诱导免疫反应外，免疫反应还可以包括可检测的免疫的抑制、减弱或任何其他下调，以重建稳态并且防止对宿主自身器官和组织的过度损伤。在一些实施方案中，根据本公开文本的方法诱导的免疫反应产生效应t细胞(例如，辅助t细胞、杀伤细胞、调节性t细胞)。在一些实施方案中，根据本公开文本的方法诱导的免疫反应产生效应cd8⁺(抗肿瘤细胞毒性cd8⁺)t细胞或激活的t辅助(th)细胞(例如，效应cd4⁺t细胞)或二者，它们可以直接或间接地导致肿瘤细胞死亡或肿瘤细胞丢失繁殖能力。

可以通过检测多种熟知的免疫学参数中的任一种来确定通过本公开文本的组合物和方法对免疫反应的诱导(takaoka等人,cancersci.94:405-11(2003)；nagorsen等人,crit.rev.immunol.22:449-62(2002))。因此，可以通过许多熟知的测定(包括免疫测定)中的任一种来确立免疫反应的诱导。此类测定包括但不必限于以下的体内、离体或体外确定：可溶性免疫球蛋白或抗体；可溶性介体(如细胞因子、趋化因子、激素、生长因子等)以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的改变的功能或结构特性确定的细胞激活状态变化，所述特性例如细胞增殖、改变的运动性、改变的细胞内阳离子梯度或浓度(如钙)；细胞多肽的磷酸化或去磷酸化；特化活性如特定基因表达或细胞溶解行为的诱导；免疫系统细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)的发作；或可以用于检测免疫反应的存在的任何其他标准。例如，可以通过与cd4⁺、cd8⁺或nk细胞结合的特异性抗体来检测区分免疫细胞类型的细胞表面标记。可以检测到的其他标记和细胞组分包括但不限于干扰素γ(ifn-γ)、肿瘤坏死因子(tnf)、ifn-α、ifn-β(ifnb)、il-6和ccl5。用于检测免疫反应的常用方法包括但不限于流式细胞术、elisa、免疫组织化学。进行这些和类似测定的程序是众所周知的，并且可以在例如letkovits(immunologymethodsmanual:thecomprehensivesourcebookoftechniques,currentprotocolsinimmunology,1998)中找到。

xiv.本发明技术的药物组合物和制剂

本文公开了包含mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的药物组合物，所述药物组合物可以含有载体或稀释剂，所述载体或稀释剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质例如含有水、盐水、tris缓冲液、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。合适的流动性可以例如通过以下方式来维持：使用包衣(如卵磷脂)，在分散液的情况下维持所需粒径，以及使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在一些实施方案中，包括等渗剂(例如，糖或氯化钠)以及缓冲剂。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)或载体分子可以实现可注射组合物的延长吸收。其他赋形剂可以包括润湿剂或乳化剂。通常，本领域技术人员清楚的是，可以包括适合于可注射制剂的赋形剂。

包含mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的药物组合物和制剂可以通过常规的混合、溶解、制粒、乳化、包封、包埋或冻干过程制造。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物病毒组合物，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于配制适合于体外、体内或离体使用的病毒制剂。所述组合物可以与一种或多种另外的生物学活性剂组合，并且可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制，以产生适合于肠胃外或瘤内施用的本公开文本的药物(包括生物)或兽药组合物。

如本领域技术人员所理解的，许多类型的配制品是可能的。如本领域所公认的，所选择的具体类型取决于所选择的施用途径。例如，通常设计全身性配制品用于通过注射(例如，静脉内)施用，并且设计那些配制品用于瘤内递送。在一些实施方案中，全身性或瘤内配制品是无菌的。

无菌可注射溶液通过以下方式制备：将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与本文所列举的各种其他成分(根据需要)一起掺入所需量的适当溶剂中，之后进行合适的灭菌方法。通常，分散液是通过以下方式来制备：将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和上文所列举的那些成分中的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法由先前无菌过滤的溶液产生病毒加上任何另外的所需成分的粉末。

在一些实施方案中，可以将本公开文本的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4组合物配制在水性溶液中，或者配制在生理相容性溶液或缓冲液(如汉克氏溶液、林格氏溶液、甘露糖醇溶液或生理盐水缓冲液)中。在某些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4组合物中的任一种可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂、渗透剂或分散剂、缓冲剂、冻干保护剂或防腐剂，如聚乙二醇、聚山梨醇酯80、1-十二烷基六氢-2h-氮杂卓-2-酮(月桂氮卓酮(laurocapran))、油酸、柠檬酸钠、trishcl、右旋糖、丙二醇、甘露糖醇、聚山梨醇酯聚乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯肉豆蔻酸异丙酯、苯甲醇、异丙醇、乙醇蔗糖、海藻糖和本领域通常已知的可以用于本公开文本的任何组合物中的其他此类配制剂。(pramanick等人,pharmatimes45(3):65-76(2013))。

可以配制本公开文本的生物或药物组合物，以允许在将组合物施用至受试者后，所述组合物中所含的病毒可以用于感染肿瘤细胞。可以通过多种完善的技术(如基于抗体的测定(例如，elisa、免疫组织化学等))监测在施用后血清、肿瘤和其他组织(如果需要)中的病毒水平。

可以将本发明技术的工程化痘病毒以在约10mmtris、140mmnacl(ph7.7)中配制的3.5x10⁷pfu/ml的滴度在-80℃下储存。对于疫苗注射液的制备，例如，可以将10²-10⁸或10²-10⁹个病毒颗粒在安瓿瓶(优选地玻璃安瓿瓶)中在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在下在100ml的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中冻干。可替代地，可以通过逐步冷冻干燥配制品中的工程化痘病毒来产生可注射制剂。此配制品可以含有另外的添加剂，如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他添加剂，如适合于体内施用的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(例如，人血清白蛋白)。然后将玻璃安瓿瓶密封，并且可以在4℃与室温之间储存几个月。在一些实施方案中，将安瓿瓶在低于-20℃的温度下储存。

对于疗法，可以将冻干物溶解于水性溶液如生理盐水或tris缓冲液中，并且全身性或瘤内施用。本领域技术人员可以优化施用的模式、剂量和施用次数。

根据本公开文本的药物组合物可以包含另外的佐剂。如本文所用，“佐剂”是指增强、放大或加强宿主对肿瘤抗原的免疫反应的物质。典型的佐剂可以是铝盐(如氢氧化铝或磷酸铝)、quila、细菌细胞壁肽聚糖、病毒样颗粒、多糖、toll样受体、纳米珠等(aguilar等人,vaccine25:3752-3762(2007))。

xv.本发明技术的治疗方法

在一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：被基因工程化以表达ox40l的包含e3l缺失(mvaδe3l)的重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒(mvaδe3l-ox40l)；被基因工程化以表达ox40l的包含c7l缺失(mvaδc7l)的重组mva病毒(mvaδc7l-ox40l)；被工程化以表达ox40l和hflt3l的重组mvaδc7l(mvaδc7l-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含c7l缺失、e5r缺失并表达hflt3l和ox40l的重组mva(mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化包含e5r缺失的重组mva(mvaδe5r)；被基因工程化包含e5r缺失并表达hflt3l和ox40l的重组mva(mvaδe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以表达ox40l的包含c7l缺失(vacvδc7l)的重组痘苗病毒(vacvδc7l-ox40l)；被基因工程化以表达ox40l和hflt3l二者的重组vacvδc7l(vacvδc7l-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含e5r缺失的vacv(vacvδe5r)；被基因工程化以包含e5r缺失、胸苷激酶(tk)缺失并表达抗ctla-4、hflt3l和ox40l的重组vacv(vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l)；被基因工程化以包含m31r缺失的myxv(myxvδm31r)；被基因工程化以包含m31r缺失并表达hfl3l和ox40l的重组myxv(myxvδm31r-hflt3l-ox40l)；和/或选自以下的另外的工程化痘病毒：mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4或其组合。在一些实施方案中，所述治疗包括以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫反应或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫反应、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述免疫反应的诱导、增强或促进包括以下中的一种或多种：与用相应的mva、mvaδe3l、mvaδc7l、vacv、vacvδc7l或myxv毒株感染的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中的效应t细胞水平增加；以及与相应的mva、mvaδe3l、mvaδc7l、vacv、vacvδc7l或myxv毒株相比，效应t细胞的脾产生增加。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，本发明技术的包含mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时(即，并行)或顺序组合施用至受试者。

在一些实施方案中，受试者被诊断患有癌症，如黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤和其他骨瘤(例如，骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胰腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、脑/cns肿瘤(例如，星形细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、儿童肿瘤如非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、生殖细胞瘤、胚胎瘤、室管膜瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、直肠腺癌、神经胶质瘤、尿路上皮癌、子宫癌(例如，子宫内膜癌、输卵管癌)、非小细胞肺癌(鳞状和腺癌)、导管原位癌、以及肝细胞癌、肾上腺肿瘤(例如，肾上腺皮质癌)、食道癌、眼癌(例如，黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃肠道癌、心癌、喉癌和下咽癌、口腔癌(例如，唇、口、唾液腺)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、腹膜癌、垂体癌、卡波西肉瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、阴道肿瘤和前述任一种的转移瘤。

xvi.与其他活性剂的组合疗法

在一些实施方案中，将本发明技术的工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4)与以下的任何组合进行组合，或分开、顺序或同时(即，并行)施用：(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))。在一些实施方案中，本发明技术的工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4)与以下中的任何一种或多种的组合施用导致关于实体瘤的治疗的协同作用：(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))。

a.免疫检查点阻断剂和免疫系统刺激剂

在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点阻断剂选自：伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗和度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、针对lag-3(淋巴细胞激活基因3)、tim3(t细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3)、b7-h3、b7-h4、tigit(具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)的抑制性抗体、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos(诱导型t细胞共刺激)、dlbcl(弥漫性大b细胞淋巴瘤)抑制剂、btla(b和t淋巴细胞弱化子)、pdr001及其任何组合。由于已经完成了一些给药临床试验，因此前述的剂量范围是已知的或容易地在本领域技术范围内的，从而外推到其他可能的药剂。

通过举例的方式，而非通过限制的方式，在一些实施方案中，所述一种或多种免疫系统刺激物选自自然杀伤细胞(nk)刺激物、抗原呈递细胞(apc)刺激物、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和toll样受体刺激物。

在一些实施方案中，nk刺激物包括但不限于il-2、il-15、il-15/il-15ra复合物、il-18和il-12。在一些实施方案中，nk刺激物包括刺激至少一种以下受体的抗体：nkg2、kir2dl1/s1、kri2dl5a、nkg2d、nkp46、nkp44或nkp30。

在一些实施方案中，apc刺激物包括但不限于cd28、icos、cd40、cd30、cd27、ox-40和4-1bb。

在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和一种或多种免疫检查点抑制剂和/或一种或多种免疫系统刺激的组合导致协同作用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和一种或多种免疫检查点抑制剂和/或一种或多种免疫系统刺激的组合导致增强的抗肿瘤作用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和抗pd-l1的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和抗pd-1的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和抗ctla-4的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。

在一些实施方案中，将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂的组合与下文在章节xvib和c中所述的一种或多种抗癌药物和/或免疫调节药物进一步组合，或分开、顺序或同时(即，并行)施用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂以及下文在章节xvib和c中所述的一种或多种抗癌药物和/或免疫调节药物的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。

据报道，顺序(即，连续)施用抗ox40抗体之后是免疫检查点抑制剂、抗pd-1抗体改善了组合的治疗功效，从而导致延迟的肿瘤进展，并且在一些情况下，导致完全的肿瘤消退。(参见例如shrimali等人,cancerimmunol.res.5(9):of1-of12(2017)；messenheimer等人,clin.cancerres.23(20):6165-6177(2017))。然而，相同的研究显示，同时(即，并行)施用抗ox40抗体和抗pd-1抗体消除了ox40抗体的抗肿瘤作用，并且在小鼠中导致不良治疗结果。(参见shrimali等人,(2017)；messenheimer等人,(2017))。相比之下，如图11b至图11g中所示，在小鼠黑色素瘤模型中组合、同时(即，并行)施用本发明技术的表达ox40l转基因的病毒(例如，mvaδc7l-hflt3l-ox40l)和免疫检查点抑制剂(例如，mvaδc7l-hflt3l-ox40l+抗pd-l1或mvaδc7l-hflt3l-ox40l+抗ctla-4或mvaδc7l-hflt3l-ox40l+抗pd-1(未示出))令人惊讶地且出乎意料地导致与对照组相比在注射和未注射肿瘤二者中增强的抗肿瘤作用和增加的存活率。在一些实施方案中，本发明技术的表达ox40l转基因的病毒例如mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和/或一种或多种免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合与免疫检查点抑制剂和抗ox40激动剂抗体的组合相比导致令人惊讶且出乎意料的增强的抗肿瘤作用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和一种或多种免疫检查点抑制剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合与免疫检查点抑制剂和抗ox40激动剂抗体的组合相比导致关于实体瘤的治疗的协同作用。

b.抗癌药物

受体酪氨酸激酶(如egfr和her2)已经牵涉通过ras-raf-mek-erk(ras-mapk)途径促进肿瘤细胞增殖和存活。raf和mek也是用于抑制由上游受体酪氨酸激酶或由ras或raf中驱动ras-mapk信号传导的功能获得性突变产生的致癌信号的靶标。对包括黑色素瘤在内的癌症中关键激活突变的鉴定导致了沿着mapk途径的靶向疗法的开发。例如，braf中的激活突变发生在超过一半的黑色素瘤癌症中，其中的大多数包括braf^v600e突变，所述突变组成型地激活mapk信号传导途径。这反过来导致包括侵袭性在内的转移行为增加，同时减少细胞凋亡(即增加癌细胞存活率)。已经开发了几种抗癌药物来减轻来自该途径的致病信号传导。靶向该途径的关注疗法包括egfr、her2、braf、raf和mek的抑制剂。

由检查点抑制剂(pd-1/pd-l1、ctla-4)和mapk途径靶向疗法的组合组成的免疫疗法已在例如braf阳性晚期黑色素瘤中显示出有希望的结果。据报道，mapk途径激活有助于免疫逃逸，而mapk途径抑制经由消除免疫抑制因子以及使某些其他免疫调节蛋白(如pd-l1)失调而有助于更有利的免疫环境。此外，与单独的单一药剂相比，在临床前模型中已经显示出与mapk途径抑制双重结合的溶瘤疱疹病毒(t-vec)增加癌细胞死亡，而mapk抑制剂、t-vec和检查点抑制剂(例如，抗pd-l1抗体)的三联组合显示出协同免疫刺激作用。在mapk途径抑制情况下的稳健免疫反应与cd8t细胞内流的增加激活以及分泌的ifn和tnf-α的增加水平密切相关。

如本文所证明的，本发明技术的包含e5r(或其直系同源物)缺失的重组病毒构建体(如mvaδe5r、vacvδe5r和myxvδm31r)与相应的野生型病毒相比使ifn基因表达水平显著增加大于1000倍(参见图60a)。

在一些实施方案中，将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与一种或多种抗癌药物的组合与如在章节xvia中所述的一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂进一步组合，或分开、顺序或同时(即，并行)施用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与所述一种或多种抗癌药物和一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。

在一些实施方案中，将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与一种或多种抗癌药物的组合与如在章节xvia中所述的一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂和/或章节xvic中所述的免疫调节药物进一步组合，或分开、顺序或同时(即，并行)施用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与所述一种或多种抗癌药物、一种或多种免疫检查点阻断剂或免疫系统刺激剂的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。

c.免疫调节药物

芬戈莫德(fty720)是用于治疗多发性硬化症的口服活性免疫调节药物。芬戈莫德充当鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂，其阻断淋巴细胞从淋巴结外出。

在一些实施方案中，将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与fty720的组合与如在章节xvia中所述的一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂和/或章节xvib中所述的抗癌药物进一步组合，或分开、顺序或同时(即，并行)施用。在一些实施方案中，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与fty720、一种或多种免疫检查点阻断剂、和/或免疫系统刺激剂、和/或抗癌药物的组合导致关于实体瘤的治疗的协同作用。

xvii包含工程化mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4病毒的试剂盒

本公开文本提供了包含一种或多种组合物的试剂盒，所述一种或多种组合物包含一种或多种本文所述的工程化痘病毒，例如mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4；以及用于将工程化痘病毒施用至待治疗的受试者的说明书。说明书可以指示用于施用如下文所提供的一种或多种组合物的剂量方案。

在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含另外的组合物，所述另外的组合物包含用于与工程化痘病毒例如mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4组合物联合施用的一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂。

xviii.mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的有效量和剂量

通常，向受试者施用的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的剂量在约10⁶至约10¹⁰个噬斑形成单位(pfu)范围内，但可以施用更低或更高的剂量。在一些实施方案中，剂量范围是从约10²至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10³至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁴至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁵至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁶至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁷至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁸至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁹至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量是约10⁷至约10⁹pfu。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒，而0.69pfu是约1tcid50。可以将治疗有效量的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4以一个或多个分剂量在规定的时间段内并且以规定的施用频率施用。

例如，如本领域技术人员清楚的，根据本公开文本的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况，以及mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4在特定受试者体内引起所需免疫反应的能力(受试者对疗法的反应)。在向受试者递送mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4时，剂量也将根据诸如以下的因素而变化：一般医疗状况、先前病史、疾病类型和进展、肿瘤负荷、肿瘤中肿瘤浸润免疫细胞的存在或不存在等。

在一些实施方案中，以剂量单位形式配制本公开文本的组合物可能是有利的，以便于施用和剂量的统一。如本文所用的“剂量单位形式”是指适合作为要治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有与所需的药学上或兽医学上可接受的载体结合的经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性材料。

xix.mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的施用和治疗方案

通常将药物组合物配制为与其预期的施用途径相容。mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的施用可以使用多于一种途径实现。施用途径的例子包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下)、瘤内、鞘内、鼻内、全身性、透皮、离子电渗疗法、皮内、眼内或局部施用。在一个实施方案中，在需要直接的局部反应的情况下，例如通过瘤内注射，将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4直接施用至肿瘤中。另外，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4的施用途径可以变化，例如使用瘤内注射进行第一次施用，并且经由静脉内注射进行随后的施用，或其任何组合。可以将治疗有效量的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4注射在规定的时间段内并且以规定的施用频率施用。在某些实施方案中，可以将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与其他治疗性治疗结合使用。例如，对于患有大块原发性肿瘤的受试者，本发明技术的重组痘病毒可以在新辅助(术前)或辅助(术后)环境中施用。预期这种优化的治疗方案将诱导针对肿瘤的免疫反应，并且在主要疗法如诸如手术之前或之后减轻受试者的肿瘤负荷。此外，可以将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4与其他治疗性治疗如化学疗法或放射结合施用。

在某些实施方案中，将mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4病毒每周或每月施用至少一次，但是如果需要可以更频繁地施用，如每周两次，持续数周、数月、数年或甚至无限期，只要益处持续存在。如果耐受并且如果它们产生持续或增加的益处，则考虑更频繁的施用。本发明方法的益处包括但不限于以下：减少癌细胞数量、减小肿瘤大小、根除肿瘤、抑制癌细胞向外周器官的浸润、抑制或稳定或根除转移性生长、抑制或稳定肿瘤生长以及稳定或改善生活质量。此外，益处可以包括诱导针对肿瘤的免疫反应、效应cd4⁺t细胞的激活、效应cd8⁺t细胞的增加、或调节性cd4⁺细胞的减少。例如，在黑色素瘤的情况下，益处可以是在黑色素瘤的初次诊断的一、二、三、四、五年或更多年内没有复发或转移。可以对结肠癌和其他实体瘤进行类似的评估。

在某些其他实施方案中，在体内、离体或体外用mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4治疗肿瘤块或肿瘤细胞。

xx.载体

在一些实施方案中，使用基于pcb质粒的载体插入在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下的特定目的基因(sg)，如ox40l(鼠或人)。已经描述了构建载体的方法(参见m.puhlmann,c.k.brown,m.gnant,j.huang,s.k.libutti,h.r.alexander,d.l.bartlett,vacciniaasavectorfortumor-directedgenetherapy:biodistributionofathymidinekinase-deletedmutantcancergenetherapy7(1):66–73(2000))。使用在痘苗p7.5启动子控制下的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)基因作为选择性标记。说明性pcb-mox40l-gpt载体核酸序列在seqidno:3中列出。在一些实施方案中，使用基于puc57质粒的载体插入在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下的特定目的基因(sg)，如ox40l(鼠或人)。在一些实施方案中，使用基于pma质粒的载体插入在痘苗合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下的特定目的基因(sg)，如ox40l(鼠或人)。将在痘苗p7.5启动子控制下的mcherry基因用作选择性标记。说明性puc57-hox40l-mcherry载体核酸序列在seqidno:5中列出。本发明技术的另外的说明性载体核酸序列示于表2-5中。

在一些实施方案中，这些表达盒在每一侧上侧接有tk基因的部分序列(tk-l、tk-r)。质粒dna和mvaδe3l、mvaδc7l、mvaδe5r、vacvδc7l、vacvδe5r或myxvδm31r基因组dna在tk基因座处发生的同源重组导致将ox40l和选择性标记表达盒插入mvaδe3l、mvaδc7l、mvaδe5r、vacvδc7l、vacvδe5r或myxvδm31r基因组dnatk基因座中以产生mvaδe3l-tk(-)-ox40l、mvaδc7l-tk(-)-ox40l、mvaδe5r-tk(-)-ox40l、vacvδc7l-tk(-)-ox40l、vacvδe5r-tk(-)-ox40l或myxvδm31r-tk(-)-ox40l。另外或可替代地，可以使用除病毒内的除了tk基因座以外的合适基因座。质粒dna和mva、mvaδe3l、mvaδc7l、mvaδe5r、vacv、vacvδc7l、vacvδe5r、myxv或myxvδm31r基因组dna在合适病毒基因基因座处发生的同源重组导致将一个或多个特定目的基因(例如，ox40l、hflt3l、抗ctla-4等)和/或选择性标记表达盒插入mva、mvaδe3l、mvaδc7l、mvaδe5r、vacvδc7l、vacvδe5r、myxv或myxvδm31r基因组dna病毒基因基因座中，以产生重组痘病毒，如本文所述的那些。

在一些实施方案中，将mva基因组序列(seqidno:1)的位置18,407至18,859用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gpt或mcherry)和目的基因(sg)(如ox40l)。在一些实施方案中，将mva基因组序列(seqidno:1)的位置75,560至76,093用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gpt或mcherry)和目的基因(sg)(如ox40l)。在一些实施方案中，将vacv基因组序列(seqidno:2)的位置15,716至16,168用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gpt或mcherry)和目的基因(sg)(如ox40l)。在一些实施方案中，将mva基因组序列(seqidno:1)的位置75,798至75,868用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gpt或mcherry)和目的基因(sg)(如ox40l)。在一些实施方案中，将vacv基因组序列(seqidno:2)的位置80,962至81,032用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gpt或mcherry)和目的基因(sg)(如ox40l)。通过选择富集重组病毒并且进行4-5轮噬斑纯化，直到获得适当的重组病毒。

类似地，在一些实施方案中，使用基于puc57质粒的载体将特定目的基因(sg)(如hflt3l)插入mva或vacv病毒基因组骨架中。可以将gfp用作选择性标记。说明性puc57-hflt3l-gfp载体核酸序列在seqidno:4中列出。在一些实施方案中，这些表达盒在每一侧上侧接有c7基因的部分序列。另外或可替代地，可以使用除病毒内的除了c7基因座以外的合适基因座。质粒dna和mvaδe3l、mvaδe5r、mva、vacv、vacvδc7l、vacvδe5r、myxv或myxvδm31r基因组dna在c7基因座处发生的同源重组导致将hflt3l和选择性标记表达盒插入mvaδe3l、mvaδe5r、mva、vacv、vacvδc7l、vacvδe5r、myxv、或myxvδm31r基因组dnac7基因座中。

在一些实施方案中，将mva基因组序列(seqidno:1)的位置18,407至18,859用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gfp)和目的基因(sg)(如hflt3l)。在一些实施方案中，将mva基因组序列(seqidno:1)的位置75,560至76,093用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gpt或mcherry)和目的基因(sg)(如hflt3l)。在一些实施方案中，将vacv基因组序列(seqidno:2)的位置15,716至16,168用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gfp)和目的基因(sg)(如hflt3l)。在一些实施方案中，将vacv基因组序列(seqidno:2)的位置80,962至81,032用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如gfp)和目的基因(sg)(如hflt3l)。通过选择富集重组病毒并且进行4-5轮噬斑纯化，直到获得适当的重组病毒。

在一些实施方案中，将mva基因组序列(seqidno:1)的位置38,432至39,385用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如mcherry)和/或目的基因(sg)(如hflt3l和/或ox40l)。通过选择富集重组病毒并且进行4-5轮噬斑纯化，直到获得适当的重组病毒。

在一些实施方案中，将vacv基因组序列(seqidno:2)的位置49,236至50,261用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码选择性标记(如mcherry)和/或目的基因(sg)(如hflt3l和/或ox40l)。通过选择富集重组病毒并且进行4-5轮噬斑纯化，直到获得适当的重组病毒。

在一些实施方案中，使用pcb-ox40l-gpt载体或puc57-ox40l-mcherry载体或者puc57-ox40l-mcherry和puc57-hflt3l-gfp载体将ox40l插入tk基因座中并且将hflt3l插入c7基因座中，以产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l或vacvδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l。

应理解，可以使用适合于整合到mva、vacv或myxv基因组中的任何其他表达载体，以及mva、vacv或myxv的替代启动子、调节元件、选择性标记、切割位点、和/或非必需插入区。在一些实施方案中，选择性标记是报告蛋白，其中所述报告蛋白是生物发光蛋白、荧光蛋白或化学发光蛋白。在一些实施方案中，报告蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)。在一些实施方案中，选择性标记是黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。在一些实施方案中，选择性标记是mcherry基因。mva、vavc和myxv在线性基因组的末端编码许多免疫调节基因，包括c11、k3、f1、f2、f4、f6、f8、f9、f11、f14.5、j2、a46、e3l、b18r(wr200)、e5r、k7r、c12l、b8r、b14r、n1l、c11r、k1l、c16、m1l、n2l和wr199(或它们的直系同源物)。可以缺失这些基因(或它们的直系同源物)以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。

xxi.将本发明技术的工程化痘病毒毒株作为佐剂递送至治疗癌症的受试者

a.组合物

免疫激活癌症疫苗佐剂

癌症新抗原的近期发现已经产生了对癌症疫苗接种以及癌症疫苗接种与免疫检查点阻断组合以增强疫苗接种作用的新的兴趣。开发可以使抗肿瘤免疫反应最大化的有效的疫苗佐剂对于癌症疫苗的成功至关重要。

癌症疫苗包含癌症抗原和免疫佐剂。癌症抗原通常包括肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原和在肿瘤与致癌病毒感染相关的情况下的病毒抗原。癌症抗原可以以以下形式提供：经辐照的肿瘤细胞、装载肿瘤细胞裂解物或肽的树突状细胞(dc)、编码抗原的dna或rna，以及具有编码一种或多种抗原的一种或多种转基因的溶瘤病毒。树突状细胞(dc)是专业的抗原呈递细胞，其对于引发幼稚t细胞产生抗原特异性t细胞反应是重要的。免疫佐剂是促进dc的抗原摄取和/或dc成熟和激活的试剂。已经显示出在临床前模型和临床环境中，几种免疫佐剂(包括toll样受体(tlr)激动剂、聚(i:c)(tlr3激动剂)、cpg(tlr9激动剂)、咪喹莫特(tlr7激动剂)以及sting激动剂)可改善疫苗功效。

作为辅助疗法的本发明技术的工程化痘病毒毒株

本发明技术的公开文本涉及本文所述的工程化痘病毒毒株(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和/或热imvaδe5r)作为疫苗佐剂的用途。在一些实施方案中，本发明技术的公开文本涉及mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l作为疫苗佐剂的用途。在一些实施方案中，本发明技术的公开文本涉及mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l与热灭活痘苗(热imva、热imvaδe5r)的组合作为疫苗佐剂的用途。已经显示出热imva可经由cgas/sting依赖途径在常规dc(cdc)中诱导i型ifn，并且还可经由tlr7/myd88依赖机制在浆细胞样dc(pdc)中诱导i型ifn。此外，作为单一疗法或与免疫检查点阻断(icb)组合，热imva的瘤内注射根除了注射的肿瘤并且导致了全身性抗肿瘤免疫的产生。

靶抗原

本文公开的组合物和方法不旨在受抗原或新抗原的选择的限制。尽管提供了许多抗原和新抗原的例子，熟练的技术人员可以容易地利用本文公开的佐剂和所选择的抗原或新抗原。可用于本发明技术的治疗方案中的示例性非限制性靶抗原包括肿瘤分化抗原、癌症睾丸抗原、新抗原、在与致癌病毒感染相关的肿瘤的情况下的病毒抗原、gpa33、her2/neu、gd2、mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、mum-1、cdk4、n-乙酰葡糖胺转移酶、p15、gp75、β-连环蛋白、erbb2、癌症抗原125(ca-125)、癌胚抗原(cea)、rage、mart(黑色素瘤抗原)、muc-1、muc-2、muc-3、muc-4、muc-5ac、muc-16、muc-17、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1和2、pmel17(gp100)、gnt-v内含子v序列(n-乙酰葡糖胺转移酶v内含子v序列)、前列腺癌psm、prame(黑色素瘤抗原)、β-连环蛋白、ebna(eb病毒核抗原)1-6、p53、kras、肺耐药蛋白(lrp)bcl-2、前列腺特异性抗原(psa)、ki-67、ceacam6、结肠特异性抗原-p(csap)、ny-eso-1、人乳头瘤病毒e6和e7及其组合。在一些实施方案中，所述抗原包括选自以下的新抗原：m27(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)(seqidno:17)、m30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl)(seqidno:18)、m48(shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs)(seqidno:19)及其组合。所述靶抗原还可以是包含以上所列抗原的免疫活性部分的片段或融合多肽。

免疫检查点阻断(icb)

在一些实施方案中，本发明技术的免疫原性组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。免疫检查点阻断(icb)抗体已经处于免疫疗法的最前线并且已经作为癌症管理选项(包括外科手术、辐射和化学疗法)的支柱之一为人所接受。由于免疫检查点已经涉及下调抗肿瘤免疫，所以靶向免疫检查点蛋白或其配体(ctla-4、pd-1或pd-l1)的药剂和抗体已经成功解除对抗肿瘤t细胞的抑制，从而导致激活的t细胞的增殖和存活。这已经促使fda批准多种免疫检查点阻断(icb)剂用于患有各种组织学类型的晚期癌症的患者，所述癌症包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌、pd-l1⁺胃腺癌，以及错配修复缺陷和微卫星不稳定(msi)高转移实体瘤。

免疫检查点阻断剂的非限制性例子包括调节包括以下的一种或多种检查点蛋白的活性的药剂或抗体：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。

本发明技术的药物组合物和制剂

本文公开了包含抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的药物组合物，所述药物组合物可以含有载体或稀释剂，所述载体或稀释剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质例如含有水、盐水、tris缓冲液、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。在一些实施方案中，药物组合物包含抗原和作为佐剂的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l和热imva。合适的流动性可以例如通过以下方式来维持：使用包衣(如卵磷脂)，在分散液的情况下维持所需粒径，以及使用表面活性剂。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在一些实施方案中，包括等渗剂(例如，糖或氯化钠)以及缓冲剂。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)或载体分子可以实现可注射组合物的延长吸收。其他赋形剂可以包括润湿剂或乳化剂。通常，本领域技术人员清楚的是，可以包括适合于可注射制剂的赋形剂。

包含抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的药物组合物和制剂可以通过常规的混合、溶解、制粒、乳化、包封、包埋或冻干过程制造。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂以常规方式配制药物组合物，所述载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂有助于配制适合于体外、体内或离体使用的制剂。所述组合物可以与一种或多种另外的生物学活性剂(例如，gm-csf的平行施用)组合，并且可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制，以产生适合于肠胃外或瘤内施用的本公开文本的药物(包括生物)或兽药组合物。

无菌可注射溶液通过以下方式制备：将抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r与本文所列举的各种其他成分(根据需要)一起掺入所需量的适当溶剂中，之后进行合适的灭菌方法。通常，分散液是通过以下方式来制备：将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和上文所列举的那些成分中的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述方法由先前无菌过滤的溶液产生病毒加上任何另外的所需成分的粉末。

在一些实施方案中，可以将本公开文本的抗原和mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和/或热imvaδe5r组合物配制在水性溶液中，或者配制在生理相容性溶液或缓冲液(如汉克氏溶液、林格氏溶液、甘露糖醇溶液或生理盐水缓冲液)中。在某些实施方案中，抗原和热imva或热imvaδe5r组合物中的任一种均可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂、渗透剂或分散剂、缓冲剂、冻干保护剂或防腐剂，如聚乙二醇、聚山梨醇酯80、1-十二烷基六氢-2h-氮杂卓-2-酮(月桂氮卓酮)、油酸、柠檬酸钠、trishcl、右旋糖、丙二醇、甘露糖醇、聚山梨醇酯聚乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯肉豆蔻酸异丙酯、苯甲醇、异丙醇、乙醇、蔗糖、海藻糖和本领域通常已知的可以用于本公开文本的任何组合物中的其他此类配制剂。

在一些实施方案中，可以将本发明技术的组合物在-80℃下储存。对于疫苗注射剂的制备，例如，可以将10²-10⁸或10²-10⁹个病毒颗粒在安瓿瓶(优选地玻璃安瓿瓶)中在2％蛋白胨和1％人白蛋白存在下，例如，在100ml的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中冻干。可替代地，可以通过逐步冷冻干燥配制品中的重组病毒来产生可注射制剂。此配制品可以含有另外的添加剂，如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他添加剂，如适合于体内施用的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(例如，人血清白蛋白)。然后将玻璃安瓿瓶密封，并且可以在4℃与室温之间储存几个月。在一些实施方案中，将安瓿瓶在低于-20℃的温度下储存。

对于疗法，可以将冻干物溶解于水性溶液如生理盐水或tris缓冲液中，并且全身性或瘤内施用。本领域技术人员可以优化施用的模式、剂量和施用次数。

根据本公开文本的包含抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的药物组合物可以包含另外的佐剂，所述另外的佐剂包括铝盐(如氢氧化铝或磷酸铝)、quila、细菌细胞壁肽聚糖、病毒样颗粒、多糖、toll样受体、纳米珠等。

疫苗

在一些实施方案中，将包含mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r佐剂和一种或多种抗原的组合物配制成疫苗。在一些实施方案中，所述组合物包含mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l作为佐剂。在一些实施方案中，所述组合物包含mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l和热imva作为佐剂。在一些实施方案中，所述疫苗是含有肿瘤抗原的全细胞疫苗(例如，经辐照的全细胞疫苗)。在一些实施方案中，向受试者施用所述疫苗以引起针对用其配制的抗原的免疫反应。

作为癌症疫苗免疫佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的有效量和剂量

通常，向受试者施用的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4和/或热imvaδe5r的剂量在约10⁶至约10¹⁰个噬斑形成单位(pfu)范围内，但可以施用更低或更高的剂量。在一些实施方案中，剂量范围是从约10²至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10³至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁴至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁵至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁶至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁷至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁸至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10⁹至约10¹⁰pfu。在一些实施方案中，剂量是约10⁷至约10⁹pfu。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒，而0.69pfu是约1tcid50。可以将治疗有效量的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r以一个或多个分剂量在规定的时间段内并且以规定的施用频率施用。

例如，如本领域技术人员清楚的，根据本公开文本的作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况，以及mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r在特定受试者体内引起所需免疫反应的能力(受试者对疗法的反应)。在向受试者递送mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r时，剂量也将根据诸如以下的因素而变化：一般医疗状况、先前病史、疾病类型和进展、肿瘤负荷、肿瘤中肿瘤浸润免疫细胞的存在或不存在等。

通常将药物组合物配制为与其预期的施用途径相容。在免疫原性组合物(例如，疫苗)中作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的施用可以使用多于一种途径实现。施用途径的例子包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下)、瘤内、鞘内、鼻内、全身性、透皮、离子电渗疗法、皮内、眼内或局部施用。在一个实施方案中，在需要直接的局部反应的情况下，例如通过瘤内注射，将本发明技术的包含抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5的药物组合物直接施用至肿瘤中。在一些实施方案中，相对于肿瘤床，外周性施用本发明技术的包含抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5的药物组合物。另外，施用途径可以变化，例如使用瘤内注射进行第一次施用，并且经由静脉内注射进行随后的施用，或其任何组合。可以将治疗有效量的在癌症疫苗注射剂中作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r在规定的时间段内并且以规定的施用频率施用。在某些实施方案中，本发明技术的药物组合物可以与其他治疗性治疗如化学疗法或放射结合使用。在一些实施方案中，本发明技术的包含治疗有效量的作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5的药物组合物可以与免疫检查点阻断疗法结合使用。

在某些实施方案中，将包含抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r的药物组合物每周或每月施用至少一次，但是如果需要可以更频繁地施用，如每周两次，持续数周、数月、数年或甚至无限期，只要益处持续存在。如果耐受并且如果它们产生持续或增加的益处，则考虑更频繁的施用。本发明方法的益处包括但不限于以下：减少癌细胞数量、减小肿瘤大小(例如，肿瘤体积)、根除肿瘤、抑制癌细胞向外周器官的浸润、抑制或稳定或根除转移性生长、抑制或稳定肿瘤生长以及稳定或改善生活质量。此外，益处可以包括诱导针对肿瘤的免疫反应、增加的ifn-γ⁺cd8⁺t细胞、增加的ifn-γ⁺cd4⁺t细胞、效应cd4⁺t细胞的激活、效应cd8⁺t细胞的增加、或调节性cd4⁺细胞的减少。例如，在黑色素瘤的情况下，益处可以是在黑色素瘤的初次诊断的一、二、三、四、五年或更多年内没有复发或转移。可以对结肠癌和其他实体瘤进行类似的评估。

b.方法

在一方面，本公开文本提供了一种用于通过增强免疫反应来治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含一种或多种抗原和包括以下的佐剂的免疫原性组合物，从而通过增强免疫反应来治疗肿瘤：mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r。在一些实施方案中，所述佐剂包括mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，所述佐剂包括mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l和热imva。

在一些实施方案中，本公开文本提供了方法，其包括向受试者施用包含一种或多种抗原和作为佐剂的mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5r，以便引起针对抗原的免疫反应。

在本文公开的方法的一些实施方案中，所述施用步骤包括以多个剂量施用所述免疫原性组合物。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括向受试者施用选自以下的免疫检查点阻断剂：抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla-4抗体、伊匹单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、兰洛利珠单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、mpdl3280a、bms-936559、medi-4736、msb00107180、lag-3、tim3、b7-h3、b7-h4、tigit、amp-224、mdx-1105、阿瑞鲁单抗、曲美木单抗、imp321、mga271、bms-986016、利鲁单抗、乌瑞鲁单抗、pf-05082566、iph2101、medi-6469、cp-870,893、莫格利珠单抗、瓦利鲁单抗、加利昔单抗、amp-514、aunp12、吲哚莫德、nlg-919、incb024360、cd80、cd86、icos、dlbcl抑制剂、btla、pdr001及其任何组合。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物与所述免疫检查点阻断剂的施用分开、顺序或同时递送至受试者。

c.试剂盒

在一些实施方案中，提供了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括容器器件和以下各项的单独部分：(a)抗原和(b)包括以下的佐剂：mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4、和/或热imvaδe5。在一些实施方案中，所述佐剂包括mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l。在一些实施方案中，所述佐剂包括mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l和热imva。

实验实施例

通过以下实施例进一步说明本发明技术，所述实施例不应被解释为以任何方式进行限制。

通用材料和方法

病毒和细胞系。mva病毒由gerdsutter(慕尼黑大学)慷慨提供，并且使其在bhk-21(幼仓鼠肾细胞，atccccl-10)细胞中繁殖。mva可商购和/或公开获得。mvaδe3l病毒由gerdsutter(慕尼黑大学)慷慨提供，并且使其在bhk-21细胞中繁殖。描述了产生mvaδe3l病毒的方法(hornemann等人,2003)。将病毒通过36％的蔗糖垫纯化。通过将经纯化的mva病毒在55℃下孵育1小时来产生热imva。在含有10％fbs、0.1mm非必需氨基酸(neaa)和50mg/ml庆大霉素的伊格尔最小必需培养基(伊格尔mem，可以从lifetechnologies购买，目录号11095-080)中培养bhk-21。最初从i.fidler(美国md安德森癌症中心(mdandersoncancercenter))获得鼠黑色素瘤细胞系b16-f10。将b16-f10细胞维持在rpmi1640培养基中，所述培养基补充有10％fbs、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mmneaa、2mml-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠和10mmhepes缓冲液。使所有细胞在37℃下在5％co2培养箱中生长。在完全rpmi1640培养基中培养人黑色素瘤sk-mel-28细胞。对于人单核细胞衍生的树突状细胞培养，使完全rpmi1640补充有10mmhepes、1％青霉素/链霉素(medialab，mskcc，纽约，纽约州)、50μm2-me(gibcobrllifetechnologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、1％l-谷氨酰胺(gibcobrl)和热灭活的正常人血清(1％或10％，v/v，如针对特定实验规定的；geminibio-products，西萨克拉门托，加利福尼亚州)。使用无菌重组无内毒素、无热原、无支原体和无载体的人细胞因子来产生未成熟和成熟的血液modc。所有培养基和试剂均是无内毒素的。使所有细胞在37℃下在5％co2培养箱中生长。

小鼠。6周龄与10周龄之间的雌性c57bl/6j小鼠从jacksonlaboratory购买，并且将其用于体内实验。将这些小鼠饲养在斯隆凯特林研究所(sloanketteringinstitute)的动物实验室中。严格按照美国国立卫生研究院(nationalinstituteofhealth)的实验动物的护理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)中的建议执行所有程序。所述方案得到了斯隆凯特林癌症研究所(sloan-ketteringcancerinstitute)的动物实验伦理委员会(committeeontheethicsofanimalexperiments)的批准。

重组mvaδe3l-tk(-)-mox40l病毒的产生。将bhk21细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用mvaδe3l以0.5的感染复数(moi)感染。1-2h后，将细胞用0.75μgpcb-mox40l-gpt构建体与2μllipofectamine2000转染。2天后，收集细胞并且将其冻融三次。为了选择纯mvaδe3l-mox40l，通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且在4-6轮选择后进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证mvaδe3l-tk(-)-mox40l缺少部分tk基因并具有mox40l插入。

重组病毒mvaδe3l-mox40l的pcr验证。使用pcr反应验证mvaδe3l-tk(-)mox40l重组病毒的纯度。用于pcr反应的引物序列是：tk-f4：5'-ttgtcatcatgaacggcgga-3'(seqidno:11)；tk-r4：5'-tccttcgtttgccatacgct-3'(seqidno:12)；ox40l-f：5'-cgttgtaagcggcatcaagg-3'(seqidno:13)；ox40l-r：5'-aaggccagtgaagcgactac-3'(seqidno:14)。

mox40l和hflt3l表达的facs分析。将鼠b16-f10黑色素瘤细胞(1x10⁶个)或sk-mel-28细胞用mvaδe3l、mvaδe3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l以10的moi感染。在感染后24h收集细胞，并且用pe缀合的抗鼠ox40l或抗hflt3l抗体进行染色，之后进行facs分析。

肿瘤植入和瘤内注射病毒以通过流式细胞术分析来评价肿瘤浸润淋巴细胞。在该技术中使用双侧肿瘤植入模型。将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7天后，每周两次在小鼠处于麻醉下时向右侧腹上的较大肿瘤(直径约3mm或更大)注射重组病毒或pbs。第二次注射后两天或三天，收获肿瘤并称重。然后将它们切碎，之后与释放酶(liberase)(1.67wünschu/ml)和dna酶(0.2mg/ml)一起在37°℃下在无血清rpmi培养基中孵育30分钟。通过磨碎通过70μm尼龙过滤器产生细胞悬浮液，然后将细胞悬浮液用完全rpmi培养基洗涤。处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4和cd8抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b染色。通过使用可固定染料efluor506(ebioscience，thermofisherscientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)来区分活细胞与死细胞。使用透化试剂盒(ebioscience，thermofisherscientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)对进行进一步透化它们，并且针对颗粒酶b进行染色。使用lsrii流式细胞仪(becton-dickinsonbiosciences，富兰克林湖，新泽西州)采集数据。用flowjo软件(flowjo，becton-dickinson，富兰克林湖，新泽西州)分析数据。

ifn-γelispot测定。将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)。肿瘤植入后七天，向右侧腹上的肿瘤注射pbs或重组病毒。3天后，将所述注射重复一次。第二次注射后两天或三天，从用不同病毒治疗的小鼠收获脾，并且将其磨碎通过70μm粗滤器(thermofisherscientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。使用ack裂解缓冲液(lifetechnologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)使红细胞裂解，并且将细胞重悬于完全rpmi培养基中。使用来自miltenyibiotechnology的cd8α(ly-2)微珠纯化cd8⁺t细胞。根据制造商的方案(becton-dickinsonbiosciences，富兰克林湖，新泽西州)进行酶联免疫斑点(elispot)测定，以测量肿瘤特异性ifn-γ⁺cd8⁺t细胞活性。将cd8⁺t细胞与经辐照的b16细胞以1:1比率(各自250,000个细胞)在rpmi培养基中混合，并且将elispot板在37℃下孵育16小时，之后进行染色。

重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l病毒的产生。使用两步重组产生该病毒。第一步是产生mvaδc7l-hflt3l。构建了puc57载体以将表达盒插入mva的c7l基因座中，所述表达盒包含在痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)下的hflt3l基因和用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp。该表达盒侧接有在c7l基因的左侧和右侧的c8l和c6r的部分序列。将bhk21细胞用mva以0.5的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过连续选择gfp⁺焦点来选择重组病毒。进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l缺少c7l基因并具有hflt3l插入。第二步是产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l。构建了pcb质粒，所述质粒含有在任一侧上侧接有胸苷激酶(tk)基因的在痘苗pse/l控制下的密码子优化的mox40l基因以及在痘苗p7.5启动子控制下的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。将bhk21细胞用mvaδc7l-hflt3l以0.5的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l缺少c7l基因和部分tk基因，但具有hflt3l和mox40l二者插入。mvaδc7l-hflt3l-tk(-)也用pcb质粒构建，所述质粒含有在任一侧上侧接有tk基因的在痘苗p7.5启动子控制下的gpt基因。进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l-tk(-)缺少c7l基因和部分tk基因，但具有hflt3l插入。

双侧肿瘤植入模型和在存在或不存在下免疫检查点阻断的情况下瘤内注射重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹1x10⁵个)。肿瘤植入后9天，向右侧腹上的较大肿瘤瘤内注射2x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l。还每周两次用免疫检查点阻断抗体的腹膜内递送治疗小鼠，所述免疫检查点阻断抗体包括抗ctla-4(100μg/小鼠/注射)或抗pd-l1(250μg/小鼠/注射)。每周两次测量肿瘤大小并且重复注射肿瘤。监测小鼠的存活。根据以下公式计算肿瘤体积：l(长度)xw(宽度)xh(高度)/2。在有痛苦迹象时或当肿瘤直径达到10mm时，对小鼠实施安乐死。

单侧皮内肿瘤植入和在存在或不存在免疫检查点阻断的情况下瘤内注射病毒重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l以用于治疗大型已建立肿瘤。将b16-f10黑色素瘤(5x10⁵个细胞)皮内植入wtc57bl/6j小鼠的右侧腹上的剃毛皮肤中。在植入后9天后，当肿瘤直径为5mm时，将在小鼠处于麻醉下向它们注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(5x10⁷pfu)或pbs。每周两次注射病毒。还每周两次用免疫检查点阻断抗体的腹膜内递送治疗小鼠，所述免疫检查点阻断抗体包括抗ctla-4(100μg/小鼠/注射)、抗pd-1(250μg/小鼠/注射)或抗pd-l1(250μg/小鼠/注射)。根据以下公式计算肿瘤体积：l(长度)xw(宽度)xh(高度)/2。监测小鼠的存活。在有痛苦迹象时或当肿瘤直径达到10mm时，对小鼠实施安乐死。

原代鸡胚成纤维细胞(cef)的制备。使用来自spf蛋(charlesriver，目录号10100326)的第9-11天的鸡胚。通过挤压通过10-cc注射器到无菌50mlep管中，将鸡胚切碎。在37℃下用2.5％胰蛋白酶/edta消化5min后，通过70μm尼龙粗滤器过滤细胞悬浮液。将细胞悬浮液沉淀、重悬于完全mem培养基中，然后在t-75烧瓶中培养，直到细胞层变为汇合。

原代鸡胚成纤维细胞(cef)的多步生长。将5x10⁵个cef细胞接种在6孔板中，并且培养过夜。将细胞用mva、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以0.05的moi感染一小时。去除接种物，并且将细胞用pbs洗涤一次并用新鲜培养基孵育。在感染后1h、24h、48h和72h收集细胞。在三个冷冻和解冻循环后，对样品进行超声处理，并且通过对bhk21细胞进行连续稀释和感染来确定病毒滴度。使用共聚焦显微镜可视化gfp⁺焦点以进行计数。

人单核细胞衍生的树突状细胞的产生。所有人体标本的收集和使用均遵守由mskcc纪念医院(memorialhospital)的机构审查和隐私委员会(institutionalreviewandprivacyboard)审查和批准的方案。从纽约血液中心处的健康供体获得血沉棕黄层，并且在ficoll-paqueplus(amershampharmaciabiotech，乌普萨拉，瑞典)上通过标准离心来分离外周血单核细胞(pbmc)。组织培养塑料粘附型pbmc包含modc前体，将其在补充有gm-csf(1000iu/ml)和il-4(500iu/ml)的完全rpmi1640-1％人血清中培养。每48h补充新鲜培养基和细胞因子。将未成熟(第6天)的modc用热imva、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以1的moi感染，或用10μg/ml的聚i:c处理。在处理后24h收集细胞，并且用pe缀合的抗hox40l抗体进行染色，之后进行facs分析。

双萤光素酶报告物测定。根据制造商的说明(promega)，使用双萤光素酶报告物测定系统测量萤光素酶活性。简言之，将包含萤火虫萤光素酶报告构建体、海肾萤光素酶报告构建体以及其他表达构建体的表达质粒转染到hek293t细胞中。出于鉴定抑制剂的目的，以次优剂量使用鼠cgas(50ng)和hsting(10ng)。以200ng使用含有病毒基因的转染质粒。分别以50ng和10ng使用ifnb-萤火虫萤光素酶报告物和对照质粒prl-tk。转染后24h，收集细胞并且使其裂解。将20μl细胞裂解物与50μl的larii一起孵育以测量萤火虫萤光素酶活性，然后与50μl的stop&glo试剂一起孵育以测量海肾萤光素酶活性。通过将在ifnb或isre启动子下的萤火虫萤光素酶活性相对于来自对照质粒prl-tk的海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。通过将在某种测试条件下的相对萤光素酶活性除以在背景条件下的相对萤光素酶活性来计算倍数诱导。

表达痘苗e5、k7、b14、b18的逆转录病毒的产生。将hek293t细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用以下三种质粒与10μllipofectamine2000转染：vsvg(1μg)；gag/pol(2μg)；和pqcxip-e5、k7、b14、b18(2μg)。2天后，收集细胞上清液，并且将其通过0.45μm过滤器过滤并且在-80℃下保存。

稳定表达痘苗flag标记的e5、k7、b14或b18的raw264.7细胞系的产生。将raw264.7细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用表达e5、k7、b14或b18的逆转录病毒以5的moi感染。2天后，将培养基用含有5μg/ml嘌呤霉素的新鲜dmem培养基替换。一周后，存活细胞是稳定表达flag标记的e5、k7、b14或b18的细胞。使用抗flag抗体通过蛋白质印迹分析验证了flag标记的e5、k7、b14或b18的表达。

rna分离和定量实时pcr。用rneasy微型试剂盒(qiagen)从全细胞裂解物中提取rna，并且将其用第一链cdna合成试剂盒(fermentas)逆转录。使用基因特异性引物，用sybrgreenpcrmatermix(lifetechnologies)和appliedbiosystems7500实时pcr仪器(lifetechnologies)一式三份地进行定量实时pcr。将相对表达相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的水平归一化。

试剂。试剂的商业来源如下：抗hflt3l抗体从thermofisher购买，并且抗hflt3l的二抗(pe缀合的山羊抗小鼠)从bdbiosciences购买。pe缀合的mox40l和pe缀合的抗hox40l抗体分别从biosciences和r&d购买。抗cd3、抗cd45、抗cd8和抗颗粒酶b抗体从ebioscience(thermofisherscientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)购买。cd8α微珠来自miltenyibiotechnology(萨默维尔，马萨诸塞州)。elispot测定试剂盒从becton-dickinsonbiosciences(富兰克林湖，新泽西州)购买。治疗性抗ctla4(克隆9h10和9d9)、抗pd1(克隆rmp1-14)、抗pd-l1(克隆10f.9g2)从bioxcell购买；用于流式细胞术的抗体从ebioscience(cd45.2alexafluor700、cd3pe-cy7、cd4apc-efluor780、cd8percp-efluor710)、invitrogen(cd4qdot605、颗粒酶bpe-德克萨斯红、颗粒酶bapc)购买。

统计学。使用双尾非配对学生t检验来比较研究中的两个组。通过对数秩(mantel-cox)检验来分析存活数据。被认为显著的p值在图中指示如下：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

b2m、mda5、sting敲除细胞系的产生。使用lipofectamine3000试剂(thermoscientific)将b16-f10细胞用800ng的cas9表达质粒(通过addgene从churchlab获得)和800ng的每种grna表达质粒转染。转染后，允许细胞生长至少2天。然后测试crispr构建体的成功。在sting和mda5crispr的情况下，用特异性引物从基因组中pcr扩增靶向外显子，然后将其用2单位的t7内切核酸酶(从newenglandbiolabs获得)消化90分钟。消化后，进行琼脂糖凝胶电泳以确定t7是否切割了pcr扩增子，从而指示成功的crispr。确认grna功效后，将单独细胞接种到96孔板上，并且扩增为克隆分离株。扩增后，使用另一轮pcr扩增和t7消化来筛选克隆分离株。随后的蛋白质印迹分析确认了靶向蛋白(sting或mda5)的丢失。在β2微球蛋白(b2m)crispr的情况下，使用facs分析来验证成功的crispr，之后将b2m缺陷型细胞分选到96孔板上并扩增为克隆分离株。

来自患有乳房外佩吉特病(empd)的患者的人肿瘤组织。人肿瘤组织是从在纪念斯隆凯特琳癌症中心(memorialsloanketteringcancercenter)处招募在irb批准的临床方案06-107中的患有乳房外佩吉特病(empd)的患者获得的。在医务室由临床医生进行3-4mm钻孔活检。将肿瘤组织在冰上的rpmi培养基中运送到实验室。一旦到达实验室，就用外科手术刀将它们切成小块，并且用mvaδe5r-hflt3l-hox40l以10的moi感染。感染后48h，将组织在37℃下用胶原酶d消化45min。然后将它们过滤并且用针对cd3、cd4和cd8的表面抗体进行染色。之后，将它们透化并且用针对颗粒酶b和foxp3的抗体进行染色。

实施例1：表达鼠ox40l的具有tk缺失的重组mvaδe3l的产生。

此实施例描述了表达鼠ox40l(mox40l)的包含tk缺失的重组痘苗mvaδe3l病毒的产生。图1示出了表达盒的示意图，所述表达盒被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达mox40l。使用标准重组病毒技术通过pcb质粒dna与病毒基因组dna之间在tk基因座处的同源重组来构建如下质粒，所述质粒含有在任一侧上侧接有胸苷激酶(tk)基因的在痘苗pse/l控制下的密码子优化的mox40l基因以及在痘苗p7.5启动子控制下的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)(图1)。将bhk21细胞用mvaδe3l以0.5的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证mvaδe3l-tk(-)-mox40l缺少部分tk基因并具有mox40l插入(图2a)。使用抗mox40l抗体通过facs分析来确定mox40l在用mvaδe3l-tk(-)-mox40l病毒感染的b16-f10细胞上的表达(图2b)。简言之，将b16-f10细胞用mvaδe3l-tk(-)-mox40l以10的moi感染。感染后24h，用pe缀合的抗mox40l抗体对细胞进行染色。通过facs分析来评价mox40l在感染的细胞表面上的表达。图2b显示，大多数感染的细胞表达mox40l。

实施例2：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，与mvaδe3l相比，瘤内注射mvaδe3l-tk(-)-mox40l导致远端肿瘤中更多激活的肿瘤浸润效应t细胞。

为了评估在b16-f10黑色素瘤中瘤内注射mvaδe3l-tk(-)-mox40l或mvaδe3l是否导致cd8⁺和cd4⁺t细胞的激活和增殖，使用了双侧肿瘤植入模型。将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7天后，每周两次在小鼠处于麻醉下时向右侧腹上的较大肿瘤(直径约3mm或更大)注射pbs、mvaδe3l、mvaδe3l-tk(-)-mox40l。第二次注射后三天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4和cd8抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b染色。通过facs分析未注射肿瘤中的活免疫细胞浸润物。未注射肿瘤中表达颗粒酶b的cd8⁺t细胞显著增加，从pbs治疗的小鼠的肿瘤中的18％和mvaδe3l治疗的小鼠的肿瘤中的17％增加至mvaδe3l-tk(-)-mox40l治疗的小鼠的肿瘤中的53％(图3a至图3d)。在瘤内病毒治疗后，未注射肿瘤中表达颗粒酶b的cd4⁺t细胞也显著增加，从pbs治疗的小鼠的肿瘤中的0.6％增加至mvaδe3l治疗的小鼠中的4.3％，增加至mvaδe3l-tk(-)-mox40l治疗的小鼠的肿瘤中的24％(图3e至图3h)。这些结果证明，瘤内注射重组mvaδe3l-tk(-)-mox40l在诱导未注射肿瘤内的细胞毒性cd8⁺t细胞和/或cd4⁺t细胞方面比其亲本病毒mvaδe3l更有效。

实施例3：瘤内注射mvaδe3l-tk(-)-mox40l导致全身性抗肿瘤cd8+t细胞免疫的产生。

为了评估在用瘤内注射mvaδe3l-tk(-)-mox40l或mvaδe3l治疗后，小鼠是否获得了针对鼠b16-f10黑色素瘤癌症的全身性抗肿瘤t细胞免疫，使用了酶联免疫斑点(elispot)。将b16-f10细胞(分别是5x10⁵个和2.5x10⁵个)皮内植入c57bl/6j小鼠的右侧腹和左侧腹上的剃毛皮肤中。肿瘤植入后七天，向右侧腹上的肿瘤(直径约3mm)注射pbs、mvaδe3l或mvaδe3l-tk(-)-mox40l。三天后重复所述注射，接着在第二次注射后三天实施安乐死。进行elispot以评估在用重组病毒治疗的小鼠的脾中抗肿瘤特异性cd8⁺t细胞的产生。简言之，将cd8⁺t细胞从脾细胞分离，并且将3x10⁵个细胞与1.5x10⁵个经辐照的b16-f10细胞一起在37℃下在抗ifn-γ包被的bdelispot板微孔中培养过夜。将cd8⁺t细胞用经γ-辐照器辐照的b16-f10细胞刺激，并且用抗ifn-γ抗体检测ifn-γ分泌。图4a示出了来自用pbs、mvaδe3l或mvaδe3l-tk(-)-mox40l治疗的单独小鼠的每300,000个cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的代表性图像。图4b示出了来自用pbs、mvaδe3l或mvaδe3l-tk(-)-mox40l治疗的每个组中单独小鼠的每300,000个cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的数量。这些结果证明，在鼠b16-f10黑色素瘤双侧植入模型中，瘤内注射mvaδe3l-tk(-)-mox40l在治疗小鼠中产生抗肿瘤cd8⁺t细胞方面比mvaδe3l更有效。因此，这些结果证明，本发明技术的重组mvaδe3l-tk(-)-mox40l在增强或促进受试者的免疫反应方面以及在增加受试者体内的细胞毒性cd8⁺t细胞方面是有效的。

实施例4：表达鼠ox40l的具有tk缺失的重组mvaδc7l的产生。

此实施例描述了表达鼠ox40l(mox40l)的包含tk缺失的重组痘苗mvaδc7l病毒的产生。图5a示出了用于产生mvaδc7l-hflt3l的第一步。构建了puc57载体以将特定目的基因(sg)插入mva的c7l基因座中，所述载体包含表达盒，所述表达盒被设计为表达使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)的hflt3l和用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp。表达盒侧接有在c7l基因的左侧和右侧的c8l和c6r的部分序列(图5a)。将bhk21细胞用mva以0.5的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过连续选择gfp⁺焦点来选择重组病毒。进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l缺少c7l基因并具有hflt3l插入(数据未示出)。图5b示出了用于产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的第二步。构建了质粒，所述质粒含有在任一侧上侧接有胸苷激酶(tk)基因的在痘苗pse/l控制下的密码子优化的mox40l基因以及在痘苗p7.5启动子控制下的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。将bhk21细胞用mvaδc7l-hflt3l以0.5的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l缺少c7l基因和部分tk基因，但具有hflt3l和mox40l二者插入。相比之下，亲本mva基因组如预期的那样含有c7l和tk基因(图5c)。使用抗hflt3l抗体(图6)和抗mox40l抗体(图7)通过facs分析来确定mox40l在用mvaδc7l-tk(-)-mox40l感染的鼠b16-f10细胞和人sk-mel-28细胞上的表达。大多数鼠b16-f10和sk-mel28细胞二者都具有高表达水平的mox40l(图7)。

实施例5：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，瘤内(it)注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l导致激活的cd8+和cd4+t细胞募集到未注射的远端肿瘤中。

为了评估itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是否导致全身性抗肿瘤免疫的产生，使用了双侧b16-f10肿瘤植入模型。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7天后，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤注射在2x10⁷pfu的moi下的pbs、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l，或等效量的热灭活的mvaδc7l-hflt3l(热imvaδc7l-hflt3l)。第二次注射后两天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4和cd8抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b染色。通过facs分析未注射肿瘤中的活免疫细胞浸润物。与其他治疗组相比，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l导致未注射肿瘤中总cd8⁺t细胞/克肿瘤以及总颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞/克肿瘤的数量最高(图8a至图8c)。引人注目地，与其他治疗组相比，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l导致未注射肿瘤中总cd4⁺t细胞/克肿瘤以及总颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞/克肿瘤的数量最高(图9a至图9c)。这些结果证明，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l在诱导未注射肿瘤内的细胞毒性cd8⁺t细胞和cd4⁺t细胞方面比其亲本病毒mvaδc7l或mvaδc7l-hflt3l更有效。另外，该工程化重组mva在诱导抗肿瘤cd8⁺和cd4⁺t细胞反应方面比灭活的mvaδc7l-hflt3l更有效。

实施例6：与mvaδc7l相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l导致最强的全身性抗肿瘤cd8⁺t细胞免疫。

进行elispot以评估在如实施例5中所述用重组病毒治疗的小鼠的脾中抗肿瘤特异性cd8⁺t细胞的产生。简言之，将cd8⁺t细胞从脾细胞分离，并且将3x10⁵个细胞与1.5x10⁵个经辐照的b16-f10细胞一起在37℃下在抗ifn-γ包被的bdelispot板微孔中培养过夜。将cd8⁺t细胞用经γ-辐照器辐照的b16-f10细胞刺激，并且用抗ifn-γ抗体检测ifn-γ分泌。图10a示出了来自用pbs、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或热imvaδc7l治疗的单独小鼠的每300,000个cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的代表性图像。图10b示出了来自用pbs、mvaδc7l、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或热imvaδc7l治疗的每个组中单独小鼠的每300,000个cd8⁺t细胞的ifn-γ⁺斑点的数量。这些结果证明，在鼠b16-f10黑色素瘤双侧植入模型中，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l在治疗小鼠中产生抗肿瘤cd8⁺t细胞方面比mvaδc7l更有效。

实施例7：瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l有效根除或延迟注射和未注射肿瘤二者的肿瘤生长并延长小鼠的存活期。

为了测试瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是否产生抗肿瘤作用，使用了双侧鼠b16-f10肿瘤植入模型。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹1x10⁵个)。肿瘤植入后九天，每周两次将mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(2x10⁷pfu)递送至右侧腹上的较大肿瘤中，伴随腹膜内(ip)注射抗ctla-4抗体(9d9克隆，100μg/小鼠)或抗pd-l1(250μg/小鼠)、或同种型对照。每周两次测量肿瘤大小并监测小鼠存活(图11a)。单独小鼠的注射和未注射肿瘤的体积示于图11b和图11c中。在第0天、第7天和第11天注射和未注射肿瘤的体积示于图11d和图11e中。在用pbs治疗的小鼠中，肿瘤迅速生长，这导致早期死亡，中位存活期为7天(图11f和图11g)。与pbs相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l导致肿瘤生长延迟和存活改善，将中位存活期延长至14天(图11f和图11g)。b16-f10黑色素瘤是极具侵袭性的肿瘤。诸位发明人有意地在肿瘤植入后等待9天，之后开始治疗。

实施例8：瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l与全身性递送免疫检查点阻断的组合产生协同抗肿瘤反应。

与单独的it病毒相比，瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗ctla-4或抗pd-l1的组合具有优异的抗肿瘤功效。当与单独的it病毒或pbs模拟治疗相比时，注射和未注射肿瘤二者的平均肿瘤体积在itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1组中较小，其次是itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗ctla-4组(图11b至图11e)。小鼠的中位存活期在itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗ctla-4组中延长至21天，并且在itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+抗pd-l1中延长至26.5天(图11f和图11g)。该结果证明，在双侧鼠肿瘤模型中，在免疫检查点阻断存在下可以增强由itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l诱导的抗肿瘤作用。在该b16-f10肿瘤模型中，单独的免疫检查点阻断抗体是无效的，这已经由包括诸位发明人的实验室在内的许多实验室显示出。

实施例9：瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l与全身性递送免疫检查点阻断的组合在缩小和根除大型已建立b16-f10黑色素瘤方面比单独的it病毒更有效。

为了测试与单独的it病毒相比，瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗ctla-4、抗pd-1或抗pd-l1的组合是否具有优异的针对大型已建立b16-f10黑色素瘤的抗肿瘤功效，将5x10⁵个细胞皮内植入c57b/6小鼠的右侧腹中。肿瘤植入后九天，当肿瘤直径为5mm时，将它们每周两次用itpbs、单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+ip抗ctla-4、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+ip抗pd-1或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l+ip抗pd-l1治疗。测量肿瘤体积并监测小鼠存活。尽管单独的itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l具有一些抗肿瘤作用，但it病毒与抗pd-1的组合具有最佳的协同作用，其次是it病毒+抗pd-l1和it病毒+抗ctla-4的组合。

实施例10：表达人ox40l的具有tk缺失的重组mvaδc7l-hflt3的产生。

此实施例描述了表达人ox40l(hox40l)的包含tk缺失的重组痘苗mvaδc7l-hflt3l病毒的产生。图13a示出了用于产生mvaδc7l-hflt3l的第一步，其已经在实施例4中描述。图13b示出了用于产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l的第二步。构建了质粒，所述质粒含有在任一侧上侧接有胸苷激酶(tk)基因的在痘苗pse/l控制下的人ox40l基因以及在痘苗p7.5启动子控制下的mcherry。将bhk21细胞用mvaδc7l-hflt3l以0.5的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过拾取mcherry焦点来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l缺少c7l基因和部分tk基因，但具有hflt3l和hox40l二者插入(数据未示出)。也对插入物进行测序以验证序列的准确性。

实施例11：重组病毒mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l在鸡胚成纤维细胞中高效复制。

通常在鸡胚成纤维细胞(cef)中制造mva。为了测试重组mva病毒mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l是否在cef中复制，进行了多步复制测定。将5x10⁵个cef细胞接种在6孔板中，并且培养过夜。将细胞用mva、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以0.05的moi感染一小时。去除接种物，并且将细胞用pbs洗涤一次并用新鲜培养基孵育。在感染后1h、24h、48h和72h收集细胞。在bhk21细胞上确定病毒滴度。图14a示出了在cef中感染后mva、mvaδc7l-hflt3l、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l随时间推移的病毒滴度。所有病毒在cef中均高效复制，滴度增加超过1,000至10,000倍(图14b)。与亲本mva相比，重组mva病毒具有略微降低的病毒滴度(图14a和图14b)。

实施例12：重组病毒mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l在感染的细胞表面上表达hox40l蛋白。

使用facs分析来确定hox40l在感染的细胞表面上的表达。简言之，将bhk21细胞用mvaδc7l-hflt3l或mvaδc7l-tk(-)-hox40l以10的moi感染。感染后24h，用pe缀合的抗hox40l抗体对细胞进行染色。通过facs分析来评价hox40l在感染的细胞表面上的表达。图15a示出了感染bhk21细胞中gfp和hox40l的表达水平。

为了测试mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l是否可以感染人单核细胞衍生的dc(mo-dc)，在人gm-csf和il-4存在下将粘附型人外周血单核细胞(pbmc)培养5天。在第6天，将细胞用10μg/ml的聚i:c处理，或用热imva、mvaδc7l-tk(-)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l以1的moi感染。在感染后24h，收集细胞并用pe缀合的抗hox40l抗体进行染色，之后进行facs分析。与鼠b16-f10细胞相比，人mo-dc在基线处表达hox40l。聚i:c处理导致细胞表面上hox40l表达的适度增加。用热imva感染降低了hox40l的表达。mo-dc的mvaδc7l-hflt3l和mvaδc7l-tk(-)-hox40l感染均产生gfp⁺细胞，分别为约50％和75％。仅mvaδc7l-tk(-)-hox40l感染导致感染mo-dc上hox40l的表达增加(图15b)。这些结果表明，mvaδc7l-tk(-)-hox40l可以有效地感染人mo-dc，并且在感染的细胞表面上表达hox40l。这对于通过ox40l-ox40相互作用与t细胞相互作用、以及促进抗原特异性和激活的cd8⁺和cd4⁺t细胞的存活和增殖可能潜在地是重要的。

实施例13：重组病毒mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-hox40l在感染的细胞中以高水平表达hox40lmrna。

使用定量rt-pcr分析来评估感染的bhk21和b16-f10黑色素瘤细胞中的hox40lmrna表达水平。简言之，将bhk21和b16-f10黑色素瘤细胞用mva或mvaδc7l-hflt3l或mvaδc7l-tk(-)-hox40l感染8h或16h。从细胞中提取rna并进行定量rt-pcr分析以评估hox40lmrna的表达。还评估了痘苗e3lmrna水平。bhk21和b16-f10黑色素瘤细胞的感染导致在感染后8h和16he3l和hox40l二者的表达。e3l和hox40l二者在感染后16h的mrna水平均高于在感染后8h的水平(图16a和图16b)。总的来说，与b16-f10细胞中的表达相比，mvaδc7l-tk(-)-hox40l感染的bhk21细胞中hox40l的表达更高，这与该病毒在bhk21(容许复制的)和b16-f10细胞(非容许复制的)中的复制效率一致。

实施例14：将痘苗病毒早期基因克隆到表达载体中。

针对抑制cgas/sting胞质dna传感途径的能力对痘苗病毒早期基因进行筛选。为此，选择了72个痘苗病毒早期基因，并且将其开放阅读框pcr扩增并使用通路(gateway)克隆技术克隆到表达载体(pcdna3.2-dest)中(图17)。

实施例15：用于鉴定cgas/sting途径的病毒抑制剂的筛选策略。

使用双萤光素酶测定系统在hek293t细胞(用sv40大t抗原转化的人胚肾细胞系)中筛选cgas/sting途径的潜在痘苗病毒抑制剂(图18)。将hek293t细胞用表达ifnb-萤火虫萤光素酶报告物的质粒、表达海肾萤光素酶的对照质粒prl-tk、鼠cgas、人sting和如所指示的单独痘苗病毒早期基因转染。出于鉴定抑制剂的目的，以次优剂量使用鼠cgas(50ng)和hsting(10ng)。以200ng使用含有病毒基因的转染质粒。分别以50ng和10ng使用ifnb-萤火虫萤光素酶报告物和对照质粒prl-tk。转染后24h进行双萤光素酶测定。通过将萤火虫萤光素酶活性相对于海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。已经显示出腺病毒e1a通过与sting相互作用抑制该途径(lau等人,science(2015))，并且被用作该筛选测定的阳性对照。

实施例16：具有抑制cgas/sting途径的潜力的8个痘苗病毒早期基因的鉴定。

使用上述双萤光素酶测定系统筛选cgas/sting途径的痘苗病毒抑制剂。总共八个痘苗病毒早期基因(b18r(wr200)、e5r、k7r、b14r、c11r、m1l、n2l和wr199)被鉴定为该途径的潜在抑制剂。与这些痘苗病毒早期基因中的五个(b18r(wr200)、e5r、k7r、b14r和c11r)相关的数据示于图19a至图19c中。那些包括具有i型ifn系统的已知抑制功能的一些病毒基因，包括编码i型ifn结合蛋白的b18r(wr200)(alcami等人,(1995))。e5r、k7r、b14r和c11r在i型ifn途径中的作用先前尚未阐明，但k7r、b14r和c11r已经被描述为痘苗毒力因子(benfield等人,j.gen.virol.(2013)；chen等人,(2008)；mccoy等人,(2010)；martin等人,(2012))。e5r已经被报道为与病毒微体相关的病毒早期蛋白(murcia-nicolas等人,(1999))。它在免疫逃避中的作用从未被报道过。

实施例17：确认在hek293-t细胞中b18r、e5r、k7r、c11r或b14r的过表达下调通过cgas和hsting共转染诱导的ifnb基因表达。

为了确认b18r(wr200)、e5r、k7r、c11r和b14r在cgas/sting诱导的ifnb基因表达中起抑制作用，将hek293t细胞用表达ifnb-萤火虫萤光素酶报告物的质粒、表达海肾萤光素酶的对照质粒prl-tk、鼠cgas(图20a)或人cgas(图20b)、人sting、如所指示的单独痘苗病毒早期基因以及作为阳性对照的e1a共转染。b18r(wr200)、e5r、k7r、c11r或b14r基因的过表达导致通过鼠cgas/人sting诱导的ifnb基因表达的降低(图20a)。e5r、k7r、c11r或b14r基因的过表达导致通过人cgas/人sting诱导的ifnb基因表达的降低。然而，b18r(wr200)的过表达未能抑制通过人cgas/人sting诱导的ifnb基因表达(图20b)。图20c显示，flag标记的病毒基因b18r(wr200)、e5r、k7r、c11r或b14r能够抑制通过鼠cgas/人sting诱导的ifnb基因表达。

实施例18：稳定的鼠巨噬细胞细胞系中flag标记的e5r、b14r、k7r和b18r基因的过表达抑制通过用热灭活的mva感染或用免疫刺激dna转染诱导的ifnb基因表达。

产生了过表达e5r-flag、b14r-flag、flag-k7r或b18r-flag基因的稳定细胞系raw264.7。简言之，将raw264.7用含有在cmv启动子下的痘苗e5r-flag、b14r-flag、flag-k7r或b18r-flag基因和嘌呤霉素选择标记的表达构建体的逆转录病毒转导。具有药物选择标记的空载体也用于产生对照细胞系。获得抗药性细胞并且将其用于以下实验。将细胞用热imva感染或用免疫刺激dna(isd)(10μg/ml)转染。在处理后12h，收集细胞。产生了rna并进行定量rt-pcr以评价ifnb基因的表达。在对照细胞系中，用热imva感染或用isd处理分别导致ifnb基因的8倍和32倍诱导。在过表达e5、b14、k7或b18的细胞中，ifnb的诱导明显降低(图21)。这些结果表明，痘苗e5r、b14r、k7r和b18r抑制胞质dna传感途径并阻断ifnb基因诱导。

实施例19：重组mvaδe5r、mvaδk7r或mvaδb14r病毒的产生。

为了进一步确立e5r、k7r和b14r在免疫调节中的作用，将建立mvaδe5r、mvaδk7r和/或mvaδb14r病毒的产生。将构建pe5rgfp载体、pk7rgfp载体或pb14rgfp载体，以将特定目的基因(sg)插入mva的e5r、k7r或b14r基因座中。在这种情况下，将在痘苗p7.5启动子控制下的gfp用作选择标记。将bhk21细胞用表达lacz的mva病毒以0.05的moi感染1h，然后用上述质粒dna转染。将在48h收集感染的细胞。将通过其绿色荧光(因gfp插入e5r、k7r或b14r基因座中)来鉴定重组病毒。将对阳性克隆进行4-5次噬斑纯化。然后将进行pcr分析以确认重组病毒mvaδe5r、mvaδk7r或mvaδb14r分别丢失了e5r、k7r或b14r。

实施例20：与mva相比，cdc的mvaδe5r、mvaδk7r或mvaδb14r感染诱导更高水平的i型ifn基因表达。

已经显示出常规树突状细胞(cdc)的mva感染经由cgas/sting/irf3依赖性机制诱导i型ifn。为了测试e5r、k7r或b14r是否在胞质dna传感途径的诱导中起抑制作用，将分析骨髓衍生的dc(bmdc)对mvaδe5r、mvaδk7r和/或mvaδb14r与mva的先天免疫反应。将bmdc用mvaδe5r、mvaδk7r、mvaδb14r或mva以10的moi感染。将在感染后3h和6h收集细胞。将通过定量pcr分析来确定i型ifn基因表达水平。预期，在感染后3h和6h，mvaδe5r、mvaδk7r或mvaδb14r感染将在cdc中诱导比mva显著更高水平的i型ifn基因表达。为了测试mvaδe5r、mvaδk7r或mvaδb14r是否将在人免疫细胞中诱导更高水平的i型ifn基因激活，将采用广泛使用的分化的thp-1细胞。将thp-1细胞用mvaδe5r、mvaδk7r、mvaδb14r或mva以10的moi感染，然后在感染后3h和6h收集。预期，mvaδe5r、mvaδk7r或mvaδb14r感染将在thp-1细胞中诱导比mva更高水平的i型ifn基因表达。这些结果将表明，e5r、k7r和/或b14r是拮抗胞质dna传感途径的抑制剂。因此，这些结果将显示，mvaδe5r、mvaδk7r和/或mvaδb14r可以在诱导先天免疫反应的方法中是有用的。

实施例21：使用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l重组病毒作为骨架以包含e5r、k7r和/或b14r缺失并表达il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的细胞因子产生重组改良安卡拉痘苗(mva)病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

此实施例描述了从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

将根据前述实施例中所述的同源重组方法对重组病毒进行工程化。例如，表达盒将被设计为表达使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)的il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21以及用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp或大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。表达盒将侧接有经由同源重组向其中插入盒的基因(例如，e5r基因、k7r基因或b14r基因)的部分序列。将bhk21细胞用重组痘苗病毒以0.05的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。将在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。将进行pcr分析以验证mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒缺少e5r基因、k7r基因和/或b14r基因，但具有il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21插入。将使用适当抗体通过facs分析来确定转基因在用重组病毒感染的鼠b16-f10细胞和人sk-mel-28细胞上的表达。预期，大多数鼠b16-f10和sk-mel28细胞二者都将表达转基因。

将使用双侧肿瘤植入模型评估重组病毒的抗肿瘤功效。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(1x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7至8天后，将每周两次在小鼠处于麻醉下时向小鼠注射：(i)pbs；(ii)腹膜内(ip)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒；(iii)瘤内(it)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒；(iv)腹膜内(ip)和瘤内(it)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒；或(v)瘤内(it)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒+腹膜内(ip)免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)。将监测小鼠的存活并且将每周两次测量肿瘤大小。

此实施例的结果将证明从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒的抗肿瘤功效。预期，向患有实体瘤的小鼠腹膜内和/或瘤内施用从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。还预期，从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。进一步预期，与单独的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒或免疫检查点阻断疗法的施用相比，从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将在这方面产生协同作用。

因此，此实施例证明，本发明技术的包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-ox40l病毒的组合物在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例22：具有e5r、k7r或b14r缺失的重组痘苗病毒(vacvδe5r、vacvδk7r或vacvδb14r)的产生。

将使用pc7lgfp载体将在痘苗p7.5启动子控制下的gfp插入痘苗病毒(vacv)的e5r、k7r或b14r基因座中。表达盒在每一侧上将侧接有e5r、k7r或b14r侧翼区域的部分序列。将bsc40细胞用表达的wt痘苗病毒以0.05的moi感染1h，然后用上述质粒dna转染。将在48h收集感染的细胞。将通过其绿色荧光(因gfp插入e5r、k7r或b14r基因座中)来鉴定重组病毒。然后在bsc40细胞上将对阳性克隆进行4-5次噬斑纯化。将进行pcr分析以确认重组病毒vacvδe5r、vacvδk7r或vacvδb14r分别丢失了e5r、k7r或b14r。

为了确定e5r、k7r或b14r之一是否是毒力因子，以及与wtvacv相比，vacvδe5r、vacvδk7r或vacvδb14r是否高度减毒，将采用鼠鼻内感染模型。将在用不同剂量的wtvacv鼻内感染后c57bl/6j小鼠的重量减轻与在用vacvδe5r、vacvδk7r或vacvδb14r感染后c57bl/6j小鼠中观察到的重量减轻进行比较。

实施例23：具有tk缺失、e3l基因破坏、c7缺失并表达hflt3l、抗ctla-4和ox40l的重组痘苗病毒(vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l)的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

此实施例描述了包含tk缺失、c7缺失并表达特异性靶向细胞毒性t淋巴细胞抗原4的抗体(抗ctla-4)、hflt3l和ox40l的重组痘苗e3lδ83n病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

使用含有表达盒的质粒产生病毒，所述表达盒被设计为表达一个或多个特定目的基因(sg)(例如，抗ctla-4、ox40l、hftl3l)。表达盒被设计为表达使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)的抗ctla-4、ox40l和/或hftl3l以及用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp或大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。例如，表达盒侧接有在c7l基因左侧和右侧的c8l和c6r的部分序列，以用于经由同源重组将一个或多个特定目的基因插入c7基因座中。表达盒在任一侧上可以侧接有胸苷激酶(tk)基因(tk-l、tk-r)，以用于经由同源重组将一个或多个特定目的基因插入tk基因座中。将bhk21细胞用重组痘苗病毒以0.05的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l缺少c7l基因和部分tk基因，但具有hflt3l、抗ctla-4和ox40l插入。使用抗ox40l抗体通过facs分析来确定ox40l在用vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒感染的鼠b16-f10细胞和人sk-mel-28细胞上的表达。预期，大多数鼠b16-f10和sk-mel28细胞二者都将表达ox40l。

使用双侧肿瘤植入模型评估重组病毒的抗肿瘤功效。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(1x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7至8天后，每周两次在小鼠处于麻醉下向小鼠注射：(i)pbs；(ii)腹膜内(ip)vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l；(iii)瘤内(it)vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l；(iv)腹膜内(ip)和瘤内(it)vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l；或(v)瘤内(it)vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l+腹膜内(ip)免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)。监测小鼠的存活并且每周两次测量肿瘤大小。

此实施例的结果将证明vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l的抗肿瘤功效。预期，向患有实体瘤的小鼠腹膜内和/或瘤内施用vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。还预期，vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。进一步预期，与单独的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l或免疫检查点阻断疗法的施用相比，vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将在这方面产生协同作用。

因此，此实施例证明，本发明技术的包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的重组vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒的组合物在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例24：使用vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l重组病毒作为骨架以将il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21插入e5r、k7r和/或b14r基因座中的细胞因子产生重组痘苗病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

此实施例描述了从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的重组vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

将根据前述实施例中所述的同源重组方法对重组病毒进行工程化。例如，表达盒被设计为表达使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)的il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21以及用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp或大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。表达盒侧接有经由同源重组向其中插入盒的基因(例如，e5r基因、k7r基因或b14r基因)的部分序列。将bhk21细胞用重组痘苗病毒以0.05的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒缺少e5r基因、k7r基因和/或b14r基因，但具有il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21插入。使用适当抗体通过facs分析来确定转基因在用重组病毒感染的鼠b16-f10细胞和人sk-mel-28细胞上的表达。预期，大多数鼠b16-f10和sk-mel28细胞二者都将表达一个或多个转基因。

使用双侧肿瘤植入模型评估重组病毒的抗肿瘤功效。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(1x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7至8天后，每周两次在小鼠处于麻醉下时向小鼠注射：(i)pbs；(ii)腹膜内(ip)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒；(iii)瘤内(it)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒；(iv)腹膜内(ip)和瘤内(it)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒；或(v)瘤内(it)的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒+腹膜内(ip)免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)。监测小鼠的存活并且每周两次测量肿瘤大小。

此实施例的结果将证明从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒的抗肿瘤功效。预期，向患有实体瘤的小鼠腹膜内和/或瘤内施用从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。还预期，从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。进一步预期，与单独的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒或免疫检查点阻断疗法的施用相比，从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将在这方面产生协同作用。

因此，此实施例证明，本发明技术的包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的从e5r基因基因座、k7r基因基因座和/或b14r基因基因座内表达转基因il-2、il-12、il-18、il-15和/或il-21的重组vacvδe3l83n-hflt3l-抗ctla-4-δc7l-ox40l病毒的组合物在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例25：具有tk缺失并表达hflt3l和ox40l的重组c7l突变型痘苗病毒(vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l)的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

此实施例描述了重组vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

使用含有表达盒的质粒产生病毒，所述表达盒被设计为表达一个或多个特定目的基因(sg)(例如，ox40l、hftl3l)。表达盒被设计为表达使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)的ox40l和/或hftl3l以及用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp或大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。例如，表达盒侧接有在c7l基因左侧和右侧的c8l和c6r的部分序列，以用于经由同源重组将一个或多个特定目的基因(例如，hflt3l)插入c7基因座中。表达盒在任一侧上可以侧接有胸苷激酶(tk)基因(tk-l、tk-r)，以用于经由同源重组将一个或多个特定目的基因(例如，ox40l)插入tk基因座中。将bhk21细胞用重组痘苗病毒以0.05的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l缺少c7l基因和部分tk基因，但具有hflt3l和ox40l插入。使用抗ox40l和抗hflt3l抗体通过facs分析来确定ox40l和hflt3l在用vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒感染的鼠b16-f10细胞和人sk-mel-28细胞上的表达。预期，鼠b16-f10和sk-mel28细胞二者都将表达ox40l和hflt3l。

使用双侧肿瘤植入模型评估重组病毒的抗肿瘤功效。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(1x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7至8天后，每周两次在小鼠处于麻醉下向小鼠注射：(i)pbs；(ii)腹膜内(ip)vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l；(iii)瘤内(it)vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒；(iv)腹膜内(ip)和瘤内(it)vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒；或(v)瘤内(it)vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒+腹膜内(ip)免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)。监测小鼠的存活并且每周两次测量肿瘤大小。

此实施例的结果将证明vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒的抗肿瘤功效。预期，向患有实体瘤的小鼠腹膜内和/或瘤内施用vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。还预期，vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。进一步预期，与单独的vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒或免疫检查点阻断疗法的施用相比，vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体、抗ctla-4抗体)的组合施用将在这方面产生协同作用。

因此，此实施例证明，本发明技术的包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的重组vacvδc7l-tk(-)-hflt3l-ox40l病毒的组合物在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例26：具有tk缺失并表达抗ctla-4、hflt3l、ox40l和hil-12的重组c7l突变型痘苗病毒(vacvδc7l-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12)的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

此实施例描述了重组vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒的产生以及所述病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合在用于治疗实体瘤的方法中的用途。

将根据前述实施例中所述的同源重组方法对重组病毒进行工程化。例如，表达盒被设计为表达使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)的抗ctla-4、hflt3l、ox40l和/或hil-12以及用作选择标记的在痘苗p7.5启动子控制下的gfp或大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。表达盒侧接有经由同源重组向其中插入盒的基因(例如，c7基因、tk基因或任何其他合适的痘苗病毒基因)的部分序列。将bhk21细胞用重组痘苗病毒以0.05的感染复数(moi)感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12缺少c7l基因和部分tk基因，但具有转基因抗ctla-4、hflt3l、ox40l和hil-12插入。使用适当抗体通过facs分析来确定转基因在用vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒感染的鼠b16-f10细胞和人sk-mel-28细胞中的表达。预期，鼠b16-f10和sk-mel28细胞二者都将表达转基因。

使用双侧肿瘤植入模型评估重组病毒的抗肿瘤功效。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(1x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7至8天后，每周两次在小鼠处于麻醉下向小鼠注射：(i)pbs；(ii)腹膜内(ip)vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12；(iii)瘤内(it)vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒；(iv)腹膜内(ip)和瘤内(it)vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒；或(v)瘤内(it)vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12+腹膜内(ip)免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体)。监测小鼠的存活并且每周两次测量肿瘤大小。

此实施例的结果将证明vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒的抗肿瘤功效。预期，向患有实体瘤的小鼠腹膜内和/或瘤内施用vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。还预期，vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体)的组合施用将诱导抗肿瘤反应、减小肿瘤大小和/或增加存活率。进一步预期，与单独的vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒或免疫检查点阻断疗法的施用相比，vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒和免疫检查点阻断剂(例如，抗pd-l1抗体、抗pd-1抗体)的组合施用将在这方面产生协同作用。

因此，此实施例证明，本发明技术的包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的重组vacvδc7l-tk(-)-抗ctla-4-tk(-)-hflt3l-ox40l-hil-12病毒的组合物在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例27：在免疫的小鼠中，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l与模式抗原鸡卵清蛋白(ova)的共施用增强了脾和引流淋巴结(dln)中ova特异性cd8+和cd4+t细胞以及血清抗ovaigg抗体的产生。

此实施例将证明mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l可以充当疫苗佐剂以增强树突状细胞(dc)的抗原呈递。将小鼠在使用或不使用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(1x10⁷pfu)的情况下用ova(10μg)进行皮下(sc)免疫两次，间隔2周。第二次疫苗接种后1周，对小鼠实施安乐死，随后收集脾、引流淋巴结(dln)和血液用于ova特异性t细胞和抗体评估。为了确定抗ovacd8⁺t细胞反应，将脾细胞(500,000个细胞)与作为ova的mhci类(k^b)限制性肽表位的ova257-264(siinfekl)肽(seqidno:15)一起孵育12h，之后将其针对抗cd8和抗ifn-γ抗体进行染色。为了测试抗ovacd4⁺t细胞反应，将脾细胞(500,000个细胞)与作为ova的mhcii类i-a^d限制性肽表位的ova323-339(isqavhaahaeineagr)肽(seqidno:16)一起孵育12h，之后将其针对抗cd4和抗ifn-γ抗体进行染色。预期与单独的ova相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l与ovasc的共施用导致脾中抗ovaifn-γ⁺cd8⁺t细胞和抗ovaifn-γ⁺cd4⁺t细胞的增加。

预测在dln中观察到，在scova+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l后，抗ovaifn-γ⁺cd8⁺t细胞和抗ovaifn-γ⁺cd8⁺t细胞的相似诱导。简言之，从dln产生单细胞悬浮液，并且将500,000个细胞与ova257-264或ova323-339肽一起孵育。进一步预期，与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ova的施用相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和热imva与ova的组合施用将在这方面将产生协同作用。

实施例28：在产生抗原特异性cd8+和cd4+t细胞反应方面，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l优于完全弗氏佐剂(cfa)。

完全弗氏佐剂(cfa)包含在不可代谢的油(石蜡油和二缩甘露醇一油酸(mannidemonooleate))中的热灭活的结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)。它还含有tlr2、tlr4和tlr9的配体。抗原与cfa一起注射诱导th1优势免疫反应。目前，cfa在人体中的使用由于其毒性概况而不被允许，并且其在动物体内的使用由于注射部位的疼痛反应和组织受损的风险而受限于皮下或腹膜内途径。为了测试mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是否优于cfa，将小鼠用ova抗原+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或ova+cfa皮下疫苗接种两次，间隔2周，随后如实施例27所述，收获所收获的脾、dln和血液用于抗ovacd8⁺和cd4⁺t细胞和抗体反应。

预期，在疫苗接种的小鼠的脾中，与用ova+cfa进行免疫相比，ova与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的皮下共施用将诱导更高水平的抗原特异性cd8⁺和cd4⁺t细胞。

实施例29：在产生抗原特异性cd8⁺和cd4⁺t细胞反应方面，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l优于聚i:c或sting激动剂。

聚ic和sting激动剂是已经作为疫苗佐剂进行研究的先天免疫激活因子。为了测试mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是否优于聚ic和sting激动剂，将小鼠用ova抗原+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或ova+聚ic和sting激动剂皮下疫苗接种两次，间隔2周，随后如实施例27所述，收获所收获的脾、dln和血液用于抗ovacd8⁺和cd4⁺t细胞和抗体反应。

预期，在疫苗接种的小鼠的脾中，与用ova+聚ic和sting激动剂进行免疫相比，ova与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的皮下共施用将诱导更高水平的抗原特异性cd8⁺和cd4⁺t细胞。

实施例30：与mva-ova相比，用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-ova进行的皮肤划痕产生更强的ova特异性cd8+和cd4+t细胞和抗体。

mva是多种感染原和癌症的高度减毒的、非复制性的、安全并且有效的疫苗载体。经由皮肤划痕测试了mva疫苗接种的最佳剂量。在皮肤划痕后，向6-8周龄雌性c57bl/6j小鼠的尾部以10⁵、10⁶和10⁷pfu的剂量施用mva-ova(其编码在p7.5启动子控制下的全长ova)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-ova。疫苗接种后一周，对小鼠实施安乐死并且分离脾以供测试抗原特异性cd8⁺t细胞反应。将骨髓衍生的dc(bmdc)用mva-ova以5的moi感染1h，然后孵育5h，之后将bmdc与脾细胞一起孵育12h。处理细胞以用于针对ifn-γ⁺cd8⁺t细胞的细胞内细胞因子染色(ics)。可替代地，将bmdc与siinfekl肽(seqidno:15)一起孵育1h，然后与脾细胞一起孵育12h。针对与siinfekl肽(seqidno:15)反应的ifn-γ⁺cd8⁺t细胞进行ics。

为了测试sting或batf3依赖性dc、ox40是否在mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-ova诱导的疫苗接种作用中起作用，在皮肤划痕后，还向sting^gt/gt或batf3^-/-或ox40^-/-小鼠的尾部施用10⁶pfu剂量的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-ova。预期，此实施例将证明，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-ova与mva-ova相比是改进的疫苗载体，并且其功能需要sting、batf3依赖性dc和ox40-ox40l相互作用。

实施例31：mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l诱导gm-csf培养的骨髓衍生的树突状细胞(bmdc)的mhc-i表达，但是它不增加抗原的吞噬。

用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l感染bmdc诱导dc成熟，这依赖于sting介导的胞质dna传感途径(dai等人,scienceimmunology2017)。在此实施例中，将mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l对bmdc细胞表面上的mhc-i表达的诱导与聚i:c进行比较。在存在或不存在mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的情况下，将bmdc与ova一起孵育3h或16h，或与聚ic一起孵育16h。使用抗h-2k^b抗体通过facs确定细胞表面mhc-i(h-2k^b)表达。预期，与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l共孵育将增加h-2k^b的细胞表面表达。预期，结果将证明，与聚ic相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是bmdc上mhc-i表达的更强诱导剂。

为了评估bmdc摄取荧光标记的模式抗原ova(ova-647)的能力是否受mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l处理的影响，将bmdc用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l(moi为1)感染1h，然后与ova-647一起孵育1h。通过流式细胞术测量bmdc中吞噬的ova-647的荧光强度。预期，此实验的结果将证明，尽管mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l处理的bmdc经历成熟，但它们吞噬抗原的能力由于成熟而降低。

实施例32：gm-csf培养的bmdc与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ova的共孵育增强体外ot-i和ot-iit细胞的增殖。

将表皮树突状细胞用活的wt痘苗感染抑制dc激活抗原特异性t细胞的能力(deng等人,jvi,2006)。为了测试bmdc的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l感染是否增强抗原特异性ot-i和ot-iit细胞的增殖，在存在或不存在mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的情况下，将bmdc与各种浓度的ova一起孵育3h。将细胞洗涤以除去未吸收的ova或病毒，然后与羧基萤光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(cfse)标记的ot-it细胞共培养3天(bmdc:ot-it细胞＝1:5)。应用流式细胞术测量ot-i细胞的cfse强度。预期，用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l预孵育将增强dc刺激ot-it细胞增殖的能力，如在分裂细胞中通过csfe稀释所指示的。还预期，用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或聚ic预处理增强dc刺激ot-iit细胞增殖的能力，所述细胞识别通过dc上的mhc-ii呈递的ova抗原。进一步预期，与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的施用相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和热imva的组合施用将在这方面将产生协同作用。

实施例33：flt3l培养的bmdc与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ova的共孵育增强体外ot-it细胞的增殖。

fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)是区分batf3依赖性cd103⁺/cd8α⁺dc和浆细胞样dc(pdc)的关键生长因子。在存在或不存在mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的情况下，将flt3l培养的bmdc用ova脉冲处理，然后与cfse标记的ot-i细胞共培养3天(bmdc:ot-i＝1:5)。应用流式细胞术测量ot-i细胞的cfse强度。预期，即使在极低ova浓度下，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l也将刺激ot-i细胞的增殖，所述细胞识别在mhc-i上呈递的ova257-264(siinfekl)肽(seqidno:15)。进一步预期，与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的施用相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和热imva的组合施用将在这方面将产生协同作用。

实施例34：浆细胞样树突状细胞(pdc)在mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l介导的疫苗佐剂作用中起重要作用。

浆细胞样dc(pdc)可以交叉呈递抗原以刺激cd8⁺t细胞反应。为了测试pdc是否在体内mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l介导的佐剂作用中起作用，在用ova+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l进行皮内免疫之前一天和之后一天使用抗pdca-1抗体，这在第0天和第14天进行。在第21天分离脾和dln用于抗原特异性cd8⁺t细胞分析。预期，ova+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的皮内共施用增加脾中cd8⁺t细胞中ifn-γ⁺t细胞的百分比。还预期，pdc的耗尽导致脾中cd8⁺t细胞中ifn-γ⁺t细胞的百分比降低。预期此实验的结果证明了在体内肽疫苗接种模型中，pdc在mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l引起的疫苗佐剂作用中的作用。

实施例35：迁移性树突状细胞子集langerin^-cd11b^-和cd11b⁺dc在ova抗原摄取中是有效的。

许多dc子集存在于淋巴结中，其包括迁移性dc和驻留dc。迁移性dc是mhc-ιι⁺cd11c⁺。驻留树突状细胞群体是mhc-ιι^intcd11c⁺。迁移性dc可以进一步分为cd11b⁺dc、langerin^-cd11b^-dc和langerin⁺dc。langerin⁺dc包括cd103⁺dc和朗格汉斯细胞，而驻留dc由cd8α⁺驻留dc和cd8α^-驻留dc构成。为了测试哪些dc子集在吞噬用荧光染料标记的ova抗原(ova-647)中是有效的并且具有迁移至dln的能力，将ova-647皮内(id)注射到右侧腹，并且在注射后24h收获dln。为了比较ova-647与或不与疫苗佐剂addavax或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的共施用是否影响langerin^-cd11b^-和cd11b⁺dc中ova-647⁺细胞的百分比，将ova-647与或不与addavax或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l一起皮内(id)注射，并且分析langerin^-cd11b^-和cd11b⁺dc中的ova-647⁺dc。预期，ova与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的共施用增加langerin^-cd11b^-和cd11b⁺dc中ova-647⁺细胞的百分比，而ova与addavax的共施用未能增加。addavax是广为接受的基于角鲨烯的水包油纳米乳液，其配方与已经在欧洲获得许可用于辅助流感疫苗的mf59类似。预期，此实验的结果将表明，ova-647与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的共施用增强迁移性dc将吞噬的抗原转运到dln的能力。进一步预期，与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的施用相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和热imva的组合施用将在这方面将产生协同作用。

实施例36：mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是经辐照的全细胞疫苗的有效免疫佐剂。

使用经辐照的全细胞疫苗而不是肽肿瘤抗原或新抗原的优势包括：(i)肿瘤细胞提供了可以被宿主免疫系统识别的多种肿瘤抗原；以及(ii)可以绕过鉴定肿瘤抗原或新抗原的需要或时间。分析了将mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l与经辐照的b16-ova一起添加是否改善疫苗接种的功效，以及抗pd-l1的全身性递送是否将进一步改善疫苗接种的功效。为小鼠皮内植入b16-ova，在第3天、第6天和第9天在对侧侧腹用经辐照的b16-ova、b16-ova+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或b16-ova+聚ic对它们进行三次皮内疫苗接种。

预期，用经辐照的b16-ova+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l进行疫苗接种将相比于单独的经辐照的b16-ova延长中位存活期。还预期，在抗pd-l1抗体存在下，用经辐照的b16-ova+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l进行疫苗接种将相比于经辐照的b16-ova+抗pd-l1延长中位存活期。预期，这些结果将证明，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是经辐照的全细胞疫苗接种的有效且安全的疫苗佐剂。

实施例37：mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是新抗原肽疫苗接种的免疫佐剂。

为了测试mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是否可以充当新抗原肽疫苗接种的疫苗佐剂，使用了皮下疫苗接种模型，在所述模型中，首先为小鼠皮内植入b16-f10细胞(7.5x10⁴个细胞/小鼠)。植入后第3天、第7天和第10天，将小鼠用与或不与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或聚i:c一起的新抗原肽(m27(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)(seqidno:17)、m30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl)(seqidno:18)和m48(shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs)(seqidno:19))的混合物在对侧侧腹进行皮下(sc)疫苗接种。监测肿瘤生长和小鼠存活。预期，用单独的新抗原肽进行sc疫苗接种产生全身性抗肿瘤免疫，并且当将新抗原肽混合物与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l共施用时，抗肿瘤作用增强。

实施例38：mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l是病毒抗原肽疫苗接种的免疫佐剂。

病毒抗原是可以被宿主免疫系统识别的有效免疫原。为了测试mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和病毒抗原(如人乳头瘤病毒e7的合成长肽(slp))的组合是否引起抗病毒t细胞，将小鼠用单独的e7slp、或e7slp+mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l、或e7+聚i:c进行皮下疫苗接种两次，间隔两周，随后收获脾，收获dln和血液用于抗cd8⁺和cd4⁺t细胞和抗体反应。为了测试mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l在治疗性疫苗接种模型中的作用，将表达e7的癌细胞(tc-1)进行皮内植入，然后在使用或不使用佐剂的情况下进行疫苗接种，间隔两周，并且跟踪肿瘤体积和小鼠存活。

实施例39：与mva-e7相比，用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-e7进行的皮肤划痕产生更强的抗e7cd8+和cd4+t细胞反应。

表达hpve7基因的重组mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l病毒将通过将在痘苗pse/l启动子控制下的hpve7基因插入mvae5r或k7r基因座中来产生。在皮肤划痕后，向6-8周龄雌性c57bl/6j小鼠的尾部以10⁶和10⁷pfu的剂量施用mva-e7(其编码插入tk基因座中的在pse/l启动子控制下的全长hpve7)或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-e7。疫苗接种后一周，对小鼠实施安乐死并且分离脾以供测试抗原特异性cd8⁺t细胞反应。将骨髓衍生的dc(bmdc)用mva-e7以5的moi感染1h，然后孵育5h，之后将bmdc与脾细胞一起孵育12h。处理细胞以用于针对ifn-γ⁺cd8⁺t细胞的细胞内细胞因子染色(ics)。可替代地，将bmdc与e7肽一起孵育1h，然后与脾细胞一起孵育12h。针对与e7肽反应的ifn-γ⁺cd8⁺t细胞进行ics。

实施例40：与mva-e7相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-e7的鼻内感染相对于肺中tc-1细胞(表达e7)生长为小鼠提供更好的保护。

将六-八周龄的雌性c57bl/6j小鼠用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-e7、或mva-e7(在2x10⁷pfu下)、或pbs对照鼻内感染。鼻内感染后一周，通过尾静脉注射用1x10⁵tc-1细胞攻击小鼠。3周后对小鼠实施安乐死，以评价肺中肿瘤的生长。预期，与mva-e7相比，用mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l-e7进行疫苗接种提供更好的针对肺中e7表达肿瘤细胞生长的保护。

实施例41：测试在产生抗原特异性免疫反应方面，瘤内(it)疫苗接种是否优于皮下(sc)疫苗接种。

基本原理：先前显示，热imva的瘤内(it)注射根除注射肿瘤并且诱导全身性抗肿瘤免疫，这需要batf3依赖性cd103⁺/cd8α⁺dc和sting介导的胞质dna传感途径。热imva的瘤内递送通过激活cgas/sting途径部分改变肿瘤免疫抑制微环境，并且促进cd103⁺dc的肿瘤抗原呈递。假设，与热imva+抗原的皮下递送相比，热imva+模式抗原或新抗原的瘤内递送将增强肿瘤浸润dc的抗原呈递并且产生优异的适应性免疫。

方法：为了测试在产生抗原特异性免疫反应方面，瘤内疫苗接种是否优于皮下疫苗接种，将b16-f10黑色素瘤细胞(5x10⁵个细胞)在右侧腹进行皮内植入。在植入后第7天，当肿瘤的直径为2-3mm时，将mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ova蛋白直接注射到肿瘤中，或者在距右侧腹上的肿瘤1cm处进行皮下注射。在注射后一周，将收集tdln和脾，并且将通过facs分析抗ovacd4和cd8t细胞。

可替代地，将b16-f10新抗原肽混合物(m27/m30/m48)与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l一起直接共注射到右侧腹上的肿瘤中，或者在距离右侧腹上的肿瘤1cm处进行皮下注射。在注射后一周，将收集tdln和脾，并且将其与m27(regvelcpgnkyemrrhgtthslvihd)(seqidno:17)、m30(pskpsfqefvdwenvspelnstdqpfl)(seqidno:18)或m48(shchwndlavipagvvhnwdfeprkvs)(seqidno:19)肽共培养16h用于elispot分析。

实施例42：测试在免疫检查点阻断存在下，在产生抗原特异性免疫反应方面，瘤内(it)疫苗接种是否优于皮下(sc)疫苗接种。

为了测试在免疫检查点阻断抗体(包括抗ctla-4、抗pd-1或抗pd-l1)存在下，在产生抗原特异性免疫反应方面，瘤内疫苗接种是否优于皮下疫苗接种，将b16-f10黑色素瘤细胞(5x10⁵个细胞)在右侧腹进行皮内植入。在植入后第7天，当肿瘤的直径为2-3mm时，将mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ova蛋白直接注射到肿瘤中，或者在距右侧腹上的肿瘤1cm处进行皮下注射，所述注射进行两次，间隔三天。将抗ctla-4、抗pd-1或抗pd-l1或同种型对照抗体腹膜内施用两次，间隔三天。在第二次注射后2天，将收集tdln和脾，并且将通过facs分析抗ovacd4和cd8t细胞。

可替代地，将b16-f10新抗原肽混合物(m27/m30/m48)与mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l一起直接共注射到右侧腹上的肿瘤中，或者在距离右侧腹上的肿瘤1cm处进行皮下注射，所述注射进行两次，间隔三天。将抗ctla-4、抗pd-1或抗pd-l1或同种型对照抗体腹膜内施用两次，间隔三天。在第二次注射后2天，将收集tdln和脾，并且将其与m27、m30或m48肽共培养16h用于elispot分析。

实施例43：e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l重组病毒具有复制能力。

通过将鼠b16-f10黑色素瘤细胞以0.1的moi感染来确定在所述细胞中e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l的复制能力。在感染后的不同时间点(例如，1h、24h、48h和72h)收集细胞，并且通过在bsc40细胞上滴定来确定病毒产量(logpfu)。图24a示出了对感染后小时数作图的病毒产量的图。e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l和vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l二者在b16-f10细胞中都高效复制，在感染后72h病毒滴度分别增加超过1421倍和32142倍。计算感染后72h的病毒产量相对于感染后1h的病毒产量的倍数变化(图24b)。重组病毒e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l和vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l在鼠b16-f10黑色素瘤细胞中进行了高效复制。

表6

图24a和图24b中所示结果的定量数据(在72hpi的倍数变化)。

实施例44：经由感染e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l病毒在b16-f10黑色素瘤细胞中表达抗muctla-4、hflt3l和mox40l

为了确定e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l重组病毒是否能够表达所需的特定基因，将b16-f10鼠黑色素瘤细胞用e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4或e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l以10的moi感染，并且测量抗muctla-4、hflt3l和mox40l的表达。在感染后的不同时间(例如，7h、24h和48h)收集细胞裂解物。进行蛋白质印迹分析以确定抗体和蛋白质的水平。如图25中所示，在用e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l病毒感染的b16-f10细胞中存在抗muctla-4抗体(重链(hc)和轻链(lc))、hflt3l和mox40l蛋白的丰富表达。因此，这些结果证明，本发明技术的重组病毒具有在感染的细胞中从病毒中的不同基因座同时表达多个特定目的基因的能力，并且在用于将所需产品递送至细胞的方法中是有用的。

实施例45：经由感染e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l病毒在b16-f10黑色素瘤细胞中细胞表面表达mox40l。

为了确定mox40l是否在用e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l重组病毒感染的鼠b16-f10细胞表面上表达，将b16-f10细胞用e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l以10的moi感染。在感染后24h使用抗mox40l抗体通过facs确定细胞表面mox40l表达。如图26中所示，在用e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4/c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4/c7l^--mox40l病毒感染的鼠b16-f10细胞中存在mox40l蛋白的丰富细胞表面表达。因此，这些结果证明，本发明技术的重组病毒具有在感染的细胞中表达特定目的基因的能力，并且在用于将所需产品递送至细胞和细胞表面的方法中是有用的。

实施例46：瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1抗体的组合在b16-f10黑色素瘤单侧植入模型中显著增加总体反应和治愈率。

瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1的组合在鼠b16-f10黑色素瘤单侧植入模型中展示出优异的抗肿瘤功效。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠的右侧腹上的剃毛皮肤中。植入后9天，每周两次向肿瘤注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l。以250μg/小鼠腹膜内给予抗pd-l1抗体(图27)。测量单独小鼠的肿瘤体积(图28a至图28c)并监测小鼠的总体存活率(图29a至图29b)。与pbs相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l延迟了肿瘤生长并改善了存活期，中位存活期为13天。与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l相比，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体的组合在根除肿瘤方面显示出更好的抗肿瘤功效，其中在治疗后60％的小鼠无肿瘤并存活。

实施例47：瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1抗体的组合在mc38结肠癌单侧植入模型中显著增加总体反应和治愈率。

瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1的组合在mc38结肠癌单侧植入模型中具有优异的抗肿瘤功效。简言之，将5x10⁵个mc38细胞皮内植入c57bl/6j小鼠的右侧腹上的剃毛皮肤中。植入后9天，每周两次向肿瘤注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l。以250μg/小鼠腹膜内给予抗pd-l1抗体(图30)。测量单独小鼠的肿瘤体积(图31a至图31c)并监测小鼠的总体存活率(图32a至图32b)。与pbs相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l延迟了肿瘤生长并延长了存活期，将中位存活期延长至28天。与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l相比，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体的组合在根除肿瘤方面显示出更好的抗肿瘤功效，其中在治疗后62.5％的小鼠无肿瘤并存活。

实施例48：瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1抗体的组合在mb49膀胱癌单侧植入模型中显著增加总体反应和治愈率。

瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1的组合在mb49膀胱癌单侧植入模型中具有优异的抗肿瘤功效。简言之，将2.5x10⁵个mb49细胞皮内植入c57bl/6j小鼠的右侧腹上的剃毛皮肤中。植入后8天，每周两次向肿瘤注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l，或者每周两次向小鼠施用抗pd-l1抗体。以250μg/小鼠腹膜内给予抗pd-l1抗体(图33)。测量单独小鼠的肿瘤体积(图34a至图34c)并监测小鼠的总体存活率(图35a至图35b)。在用pbs治疗的小鼠中，肿瘤迅速生长，这导致早期死亡，中位存活期为13天。与pbs相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l延迟了肿瘤生长并延长了存活期，将中位存活期延长至23天。与pbs相比，单独的抗pd-l1抗体的腹膜内递送得到部分反应，并且肿瘤生长延迟且中位存活期延长至21.5天，但是小鼠不能排斥肿瘤。与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或单独的抗pd-l1抗体相比，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体的组合在根除mb49肿瘤方面更有效，将中位存活期延长至43.5天。在治疗后，50％的小鼠无肿瘤并存活。

实施例49：自发性乳腺癌对瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1抗体的组合疗法有反应。

瘤内递送mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗pd-l1的组合在自发性乳腺癌中具有优异的抗肿瘤功效。mmtv-pymt雌性以92日龄的平均潜伏期发展出多个可触及的乳腺肿瘤，通常将其用作自发性肿瘤模型(图36)。在第一个肿瘤变得可触及后，将mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l注射到右侧腹上的肿瘤，并且以250μg/小鼠腹膜内给予抗pd-l1抗体。每周两次测量肿瘤大小。收获来自接受itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体治疗的2只小鼠的肿瘤，并且将其处理成单细胞悬浮液，以用抗cd45、cd3、cd8、cd4、cd103和cd69抗体进行表面标记。通过facs分析活的肿瘤浸润t细胞。测量单独小鼠的肿瘤体积(图37)。用pbs治疗的小鼠发展出多个肿瘤，并且肿瘤迅速生长。与pbs相比，瘤内注射mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l延迟了肿瘤生长。与单独的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l相比，itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体的组合在抑制肿瘤发生和生长方面更有效。肿瘤浸润淋巴细胞的facs分析显示，t细胞在pymt肿瘤的肿瘤微环境中是丰富的(图38)。itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体治疗诱导了cd8⁺t细胞中更高百分比的cd103⁺cd69⁺细胞群(图39)，所述细胞群代表激活的记忆样cd8⁺t细胞。itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和ip抗pd-l1抗体治疗没有诱导cd4⁺t细胞中更高百分比的cd103⁺cd69⁺细胞群(图40)，这证明组合疗法在mmtv-pymt肿瘤模型中的抗肿瘤作用主要依赖于cd8⁺t细胞激活。

实施例50：过表达hflt3l或mox40l的b16-f10稳定细胞系的产生。

此实施例展示了过表达hflt3l或mox40l的b16-f10稳定细胞系的产生。简言之，将b16-f10细胞用表达hflt3l或mox40l的逆转录病毒转染。在2μg/ml嘌呤霉素中选择一周后，收获细胞，并且检测细胞表面处的hflt3l(图41a)或mox40l(图41b)表达，并且通过facs进行确认。

实施例51：过表达hflt3l的b16-f10黑色素瘤细胞对mvaδc7l的瘤内递送有更多的反应。

过表达hflt3l的b16-f10黑色素瘤细胞(b16-f10-hflt3l)对mvaδc7l的瘤内递送有更多的反应。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹，并且将5x10⁵个b16-f10-hflt3l黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹。肿瘤植入后九天，每周两次向两个侧腹上的肿瘤瘤内注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l(图42)。测量单独小鼠的右侧腹和左侧腹的肿瘤体积(图43a至图43d)。第二次注射后2天收获肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞(图44a至图44e和图45a至图45e)。用pbs治疗的b16-f10和b16-f10-hflt3l肿瘤具有相似的生长速率。在用mvaδc7l治疗的小鼠中，与b16-f10肿瘤相比，b16-f10-hflt3l肿瘤生长被显著抑制。与pbs组相比，瘤内注射mvaδc7l在b16-f10和b16-f10-hflt3l两种肿瘤中都产生了更高百分比的cd8⁺t细胞(图44a和图45a)和减少的cd4⁺t细胞(图44c和图45c)和cd4⁺foxp3⁺t细胞(图44e和图45e)。itmvaδc7l在b16-f10-hflt3l肿瘤中诱导了更多的cd8⁺颗粒酶b⁺(图44b和图45b)和cd4⁺颗粒酶b⁺t细胞(图44d和图45d)。这些结果证明，过表达hflt3l的b16-f10黑色素瘤细胞对mvaδc7l的瘤内递送有更多的反应，并且t细胞激活增强。

实施例52：过表达mox40l的b16-f10黑色素瘤细胞对mvaδc7l的瘤内递送有更多的反应。

过表达mox40l的b16-f10黑色素瘤细胞(b16-f10-ox40l)对mvaδc7l的瘤内递送有更多的反应。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹，并且将5x10⁵个b16-f10-ox40l黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹。肿瘤植入后九天，每周两次向两个侧腹上的肿瘤瘤内注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l(图46)。每周两次测量单独小鼠的右侧腹和左侧腹的肿瘤体积(图47a至图47d)。第二次注射后2天收获肿瘤，并且通过facs分析肿瘤浸润淋巴细胞(图48a至图48e和图49a至图49e)。即使在pbs治疗组中，b16-f10-ox40l肿瘤的生长也比b16-f10肿瘤缓慢(图47a和图47c)。在用mvaδc7l瘤内治疗的小鼠中，b16-f10肿瘤生长被延迟(图47b)，并且b16-f10-ox40l肿瘤生长被显著抑制(图47d)。与pbs治疗组相比，瘤内注射mvaδc7l在b16-f10肿瘤中产生了更多激活的cd8⁺(图48a和图49a)和cd4⁺t细胞(图48c和图49c)。引人注目地，浸润b16-f10-ox40l肿瘤的99％～100％的cd8⁺和cd4⁺t细胞是颗粒酶b⁺(图48b和图48d；图49b和图49d)。与b16-f10肿瘤相比，更多的cd4⁺foxp3⁺t细胞正在浸润b16-f10-ox40l肿瘤，但是itmvaδc7l高效地将这些细胞从总cd4⁺t细胞中从平均60％耗尽到15％(图48e和图49e)。这些结果证明，过表达ox40l的b16-f10黑色素瘤细胞对mvaδc7l的瘤内递送有更多的反应。ox40l在cd8⁺和cd4⁺t细胞的激活中起重要作用。itmvaδc7l能够耗尽肿瘤微环境中的cd4⁺foxp3⁺t细胞。

实施例53：在b16-f10黑色素瘤单侧植入模型中，fty720治疗增强itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l的抗肿瘤功效，并且肿瘤生长延迟且存活期延长。

为了确定淋巴结t细胞引发和激活对于itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l治疗中的肿瘤根除是否至关重要，使用fty720(图50b)在b16-f10黑色素瘤植入模型中阻断t细胞从淋巴器官离开。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j的右侧腹。肿瘤植入后九天，两次瘤内注射pbs或4x10⁷pfu的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l。从第一次mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l注射前一天开始，在治疗期间每日腹膜内给予在50％乙醇中的25μg的fty720/小鼠(图51)。测量肿瘤大小(图52a至52d；图53a和图53b)并监测存活(图53c和图53d)。图50a是展示fty720的免疫调节功能的机制的图。fty720治疗后，将t细胞捕获在淋巴结中。在用pbs治疗的小鼠中，肿瘤迅速生长并且不受fty720的影响(图52a和图52c)。单独的itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l延迟了肿瘤生长(图52b)。fty720增强了itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l的抗肿瘤作用，并且肿瘤生长延迟(图52d)且存活改善(图53d)。这些结果证明，在itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-muox40l治疗中，肿瘤发展期间肿瘤内积累的t细胞在肿瘤根除中起着至关重要的作用。

实施例54：痘苗e5在痘病毒家族内高度保守。

痘苗e5是341个氨基酸的多肽，在c末端包含来自氨基酸112-222和氨基酸233-328的两个ben结构域(图54a)。ben因其在banp/smar1、痘病毒e5r和nac1中的存在而得名。含ben结构域的蛋白质参与染色质组构、转录调控，并可能参与病毒dna组构。e5在痘病毒家族成员中高度保守。属于野兔痘病毒属(leporipoxgenus)的粘液瘤病毒的e5直系同源物在所有其他痘病毒家族成员中趋异度最大，包括引起人的天花的天花病毒、脱脚病(鼠痘)、牛痘和猴痘(图54b)。

实施例55：痘苗e5是毒力因子。

为了测试痘苗e5是否是毒力因子，通过在侧接基因e4l和e6r处的同源重组来产生重组vacvδe5r病毒。e5r基因被在p7.5启动子控制下的编码mcherry的基因替换(图55a)。使用6-8周龄c57bl/6j雌性小鼠进行鼻内感染实验，所述鼻内感染实验使用2x10⁶pfu的野生型痘苗(wtvacv)和2x10⁷pfu或2x10⁶pfu的具有e5缺失的痘苗病毒(vacvδe5r)。从感染的第二天开始，所有用wtvacv感染的小鼠都迅速减轻了重量。由于在感染后第7天至第8天的重量减轻超过30％，所有小鼠死亡或被实施安乐死(图55b和图55c)。相比之下，用2x10⁶pfu或2x10⁷pfu的vacvδe5r感染的小鼠在感染后第5天和第6天分别平均减轻接近15％或20％的初始重量，然后重量增加，并且从感染中恢复(图55b和图55c)。这些结果表明，与wtvacv相比，vacvδe5r是高度减毒的，并且e5是毒力因子。

实施例56：与mva相比，vacvδe5r从骨髓衍生的树突状细胞(bmdc)诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

bmdc的wtvacv感染未能诱导i型ifn，而mva感染能够诱导(dai等人plospathogens(2014))。检查了从vacv中缺失e5r是否获得了在感染的bmdc中诱导ifnb的能力。在gm-csf存在下培养来自c57bl/6j的骨髓细胞。将bmdc用mva、vacv或vacvδe5r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。提取rna并进行rt-pcr。在感染后21h收集上清液，并且通过elisa测量ifn-β水平。rt-pcr结果证明，与未治疗对照(nt)相比，bmdc的wtvacv感染诱导了29倍ifnb基因表达，mva感染诱导了387倍，并且vacvδe5r诱导了1316倍(图56a)。elisa结果证明，bmdc的vacv感染未能从bmdc诱导ifn-β分泌。然而，用mva或vacvδe5r感染的bmdc的上清液中的ifn-β水平分别为375.5pg/ml和660pg/ml(图56b)。这些结果表明，与mva相比，vacvδe5r从bmdc诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

实施例57：与mva相比，mvaδe5r在bmdc和bmdm中诱导更高水平的ifnb基因表达。

为了测试从mva基因组中缺失e5是否也增强其诱导ifnb基因诱导的能力，通过在侧接基因e4l和e6r处的同源重组来产生重组mvaδe5r，所述同源重组导致e5r基因被在p7.5启动子控制下的编码mcherry的基因替换(图57a)。还通过在侧接基因k5,6l和f1l处的同源重组来产生重组mvaδk7r，所述同源重组也导致k7r基因被在p7.5启动子控制下的编码mcherry的基因替换(图57b)。

通过分别在gm-csf或m-csf存在下培养骨髓细胞来产生bmdc或bmdm。将bmdc和bmdm用mva、mvaδe5r或mvaδk7r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。rt-pcr证明，与“空白”对照相比，bmdc的mvaδe5r、mvaδk7r或mva感染分别导致2452倍、22倍或12倍的ifnb基因诱导(图57c)。在bmdm中，与“空白”对照相比，mvaδe5r、mvaδk7r或mva感染导致4510倍、35倍或4倍的ifnb基因诱导(图57d)。这些结果证明，e5是bmdc和bmdm中ifnb基因诱导的主导抑制剂，并且从mva基因组中缺失e5导致ifnb的显著诱导。这些结果还证明，k7也是bmdc和bmdm中ifnb基因诱导的抑制剂。

实施例58：与mva相比，mvaδe5r在bmdc中诱导更高水平的ifna、ccl4和ccl5基因表达。

将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。rt-pcr分析证明，与mva相比，mvaδe5r还诱导了更高水平的ifna(图58a)、ccl4(图58b)和ccl5(图58c)基因表达。这些结果表明，mvaδe5r感染触发可能有利于将免疫细胞募集到感染部位的i型ifn和趋化因子的诱导。

实施例59：与热灭活的mvaδe5r(热imvaδe5r)相比，mvaδe5r诱导更高水平的ifnb基因表达。

与活的mva相比，热灭活的mva诱导更高水平的i型ifn以及促炎细胞因子和趋化因子(dai等人scienceimmunology(2017))。检查了mvaδe5r与热imvaδe5r感染的bmdc对ifnb基因表达和ifn-β分泌的诱导。简言之，将bmdc用mvaδe5r或热imvaδe5r以0.25、1、3或10的moi感染。1h感染后洗涤细胞并添加新鲜培养基。在感染后14h收集细胞和上清液。通过rt-pcr确定ifnb和e3基因表达。通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平。rt-pcr结果显示，mvaδe5r以剂量依赖性方式诱导ifnb基因表达和ifn-β分泌，并且与热imvaδe5r相比，诱导量高得多。在3或10的moi下，mvaδe5r导致最大诱导水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌(图59a和图59c)。mvaδe5r表达痘苗e3基因，而热灭活的mvaδe5r如预期的那样未能表达(图59b)。

实施例60：mvaδe5r诱导的来自bmdc的ifna和ifnb基因表达和ifn-b蛋白分泌需要胞质dna传感器cgas。

与活的mva、热灭活的mva或热灭活的mvaδe5r相比，bmdc的mvaδe5r感染诱导了高水平的ifna和ifnb基因诱导和ifn-β蛋白分泌。为了确定cgas是否为mvaδe5r诱导的ifn基因表达和蛋白质分泌所需，产生了来自wt和cgas^-/-小鼠的bmdc，并且将其用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。rt-pcr分析显示，mvaδe5r诱导的ifnb(图60a)和ifna(图60b)基因表达依赖于cgas，而mva和mvaδe5r二者在wt或cgas^-/-细胞中都表达e3l基因(图60c)。将来自wt和cgas^-/-小鼠的bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r以10的moi感染，并且在感染后8h和16h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β蛋白水平。在感染后8h，与mva、热imva或热imvaδe5r相比，mvaδe5r从wtbmdc诱导更高水平的ifn-β分泌。与在感染后8h收集的上清液中的水平相比，在感染后16h，来自mvaδe5r感染的wtbmdc的上清液的ifn-β水平甚至更高(图60d)。mvaδe5r感染的bmdc对ifn-β分泌的诱导完全依赖于cgas(图60d)。

实施例61：mvaδe5r诱导的来自bmdc和bmdm的ifnb基因表达和ifn-b蛋白分泌需要sting。

sting是内质网(er)定位蛋白，其对胞质dna传感途径至关重要。在dna结合后，cgas被激活并从atp和gtp产生第二信使环状gmp-amp(cgamp)。cgamp与sting结合，随后激活sting，从而导致转录因子irf3的激活和ifnb基因诱导。为了测试mvaδe5r诱导的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌是否需要sting，从年龄匹配的wt和sting^gt/gt小鼠中产生了bmdc和bmdm，所述sting^gt/gt小鼠缺少功能性sting蛋白。mvaδe5r和热imvaδe5r在wtbmdc中诱导了ifnb基因表达，但在sting^gt/gt细胞中没有(图61a)。类似地，mvaδe5r在wtbmdm中诱导了ifn-β蛋白分泌，但在sting^gt/gt细胞中没有(图61b)。

实施例62：mvaδe5r诱导的来自bmdc的ifn-β蛋白分泌需要irf3、irf7和ifnar1。

转录因子irf3和irf7对于ifnb基因表达的诱导是重要的。i型ifn一旦分泌，便与ifnar结合，从而导致jak/stat途径的激活和ifn刺激基因(isg)的诱导。为了确定irf3、irf7和ifnar1是否为从bmdc和bmdm诱导ifn-β蛋白分泌所需，将来自wt和irf3^-/-小鼠的bmdc和bmdm用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后8h和16h收集上清液。通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平。在irf3^-/-bmdc中，在8h和16h的mvaδe5r诱导的ifn-β分泌分别降低96％和94％(图62a)。另外，在irf3^-/-bmdc中，在8h和16h的mvaδe5r诱导的ifn-β分泌分别降低63％和75％(图62b)。

将来自wt和irf7^-/-小鼠的bmdc用mvaδe5r以10的moi感染，或用模拟对照处理。在感染后16h收集上清液。通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平。在irf7^-/-bmdc中，mvaδe5r诱导的ifn-β分泌降低89％(图62c)。

将来自wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-小鼠的bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后16h收集上清液。通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平。mvaδe5r诱导的ifn-β分泌在cgas^-/-bmdc中被消除，并且在ifnar1^-/-bmdc中降低79％(图62d)。

一并考虑，这些结果证明，irf3/irf7/ifnar1在bmdc对ifn-β产生的诱导中起着重要作用。

实施例63：wtvacv诱导的cgas降解是通过蛋白酶体依赖性途径介导的。

已经确定，wtvacv感染触发鼠胚胎成纤维细胞(mef)和bmdc中cgas的降解。为了确定vacv诱导的cgas降解的机制，将mef用环己酰亚胺(chx)、蛋白酶体抑制剂mg132、泛半胱天冬酶抑制剂z-vad或akt1/2抑制剂viii预处理30min。然后将mef在每种药物存在下用wtvacv感染。在感染后6h收集细胞。蛋白质印迹分析证明，在mg132存在下，wtvacv诱导的cgas降解被阻断(图63a)。作为对照，用dmso或mg132处理mef未影响cgas蛋白水平(图63b)。为了测试痘苗e5是否负责wtvacv介导的cgas降解，在存在或不存在mg132的情况下，将bmdc用wtvacv或vacvδe5r感染(图63c)。bmdc的wtvacv感染导致cgas降解，而vacvδe5r感染并没有。另外，在mg132存在下，wtvacv诱导的cgas降解被阻断。这些结果进一步支持痘苗病毒的e5负责wtvacv诱导的cgas降解。

实施例64：mva中的e5r基因在介导bmdc中的cgas降解中是重要的。

为了测试mva中的e5r基因是否与痘苗e5r基因具有相似的作用，将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后2h、4h、6h、8h和12h收集细胞。还包括没有感染的cgas^-/-bmdc样品。蛋白质印迹分析显示，用mva感染bmdc也引起了cgas的快速降解，而用mvaδe5r感染导致少得多的cgas降解(图64)。这些结果证明，mva中的e5r基因也负责cgas降解。

实施例65：与mva相比，mvaδe5r诱导更高水平的磷酸化stat2。

为了测试bmdc的mvaδe5r感染是否触发更强的ifnr下游信号传导，将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后2h、4h、6h、8h和12h收集细胞。使用抗磷酸-stat2、抗stat2和抗gapdh抗体进行蛋白质印迹分析(图65)。结果证明，与mva相比，mvaδe5r诱导更高水平的p-stat2，尤其是在感染后4h和6h。stat2是诱导ifn刺激基因的重要转录因子。磷酸化stat2从细胞质易位到细胞核，以与ifn敏感反应元件(isre)结合，从而导致isg表达的诱导。这些结果表明，与mva相比，mvaδe5r感染可以通过p-stat2触发数百种isg的更强诱导。一些isg是重要的细胞因子和趋化因子，它们对于t细胞激活和将其他免疫细胞募集到感染部位是重要的。

实施例66：mvaδe5r在感染的bmdc中诱导高水平的cgamp产生。

在dna结合后，cgas被激活，并且将atp和gtp转化为环状gmp-amp(cgamp)，其充当第二信使，导致sting/tbk1/irf3轴的激活和i型ifn的诱导。为了确定mvaδe5r是否导致更高水平的cgamp产生，将2.5x10⁶个bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后2h、4h、6h和8h收集细胞。通过将细胞裂解物与透化分化的thp1-dual^tm细胞一起孵育来测量cgamp浓度，所述细胞通过稳定整合两种诱导型报告构建体而衍生自人thp-1单核细胞细胞系(图66)。在24h收集上清液，并且测量萤光素酶活性(作为irf途径激活的指示)。通过与cgamp标准品进行比较来计算cgamp水平。mvaδe5r在感染后6h诱导了接近400ng/10⁷个细胞，并且在感染后8h诱导了900ng/10⁷个细胞。相比之下，通过此方法未检测到mva诱导的cgamp水平，所述方法比质谱法灵敏度低。鉴于在mvaδe5r感染的前8h期间产生的cgamp水平增加，似乎e5蛋白不仅阻止cgas对亲本病毒dna的识别，还阻止cgas对后代病毒dna的检测。已经显示出e5在病毒微体/病毒工厂中，在那里发生病毒dna复制。这些结果表明，e5抑制cgas的cgamp产生。

实施例67：mvaδe5r从浆细胞样树突状细胞(pdc)诱导ifn-β蛋白分泌。

pdc是有效的i型ifn产生细胞。为了测试pdc的mvaδe5r感染是否诱导i型ifn产生，将从脾细胞中分选的1.2x10⁵个pdc(b220⁺pdca-1⁺)用mva、热imva或mvaδe5r感染。包括未感染的脾细胞作为对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。与mva和热imva相比，mvaδe5r从脾pdc诱导了更高水平的ifn-β蛋白分泌(图67a)；来自mvaδe5r感染的脾pdc的上清液中的517.5pg/ml相比于来自mva感染的脾pdc的上清液中的43.5pg/ml相比于热imva感染的脾pdc的上清液中的220pg/ml(图67a)。

实施例68：mvaδe5r诱导的来自pdc的ifn-β蛋白分泌依赖于cgas。

pdc通常使用内体定位的tlr7和tlr9来检测内体rna和dna，以引起强的i型ifn反应。myd88是tlr7和tlr9二者的衔接子。最近，已经显示cgas对于检测pdc中的胞质dna也是重要的。为了测试cgas或myd88途径对于mvaδe5r诱导的i型ifn产生是否重要，从获自wt、cgas^-/-或myd88^-/-小鼠的flt3l培养的bmdc(b220⁺pdca-1⁺)中分选pdc。将2x10⁵个细胞用mva或mvaδe5r感染。不包括未处理(nt)对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。结果显示，mvaδe5r诱导的ifn-β产生在cgas^-/-flt3l-pdc中被消除，而在myd88^-/-flt3l-pdc中基本不变(图68)。

实施例69：mvaδe5r诱导的来自cd103⁺dc的ifn-β蛋白分泌依赖于cgas。

cd103⁺dc是对于交叉呈递抗原重要的常规dc的子集。转录因子batf3对于cd103⁺dc的发育是重要的。cd103⁺dc对于交叉呈递肿瘤抗原和启动抗肿瘤免疫至关重要。为了测试mvaδe5r是否从分选的flt3l-cd103⁺dc诱导ifn-β蛋白分泌以及cgas或myd88对于所述诱导是否重要，从获自wt、cgas^-/-或myd88^-/-小鼠的flt3l培养的bmdc(cd11c⁺cd103⁺)中分选cd103⁺dc。将2x10⁵个细胞用mva或mvaδe5r感染。包括nt对照。在感染后18h收集上清液。通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。结果显示，mvaδe5r从分选的flt3l-cd103⁺dc有效诱导ifn-β蛋白分泌。来自mvaδe5r感染的cd103⁺dc的上清液中的ifn-β浓度是3610pg/ml，而来自mva感染的cd103⁺dc的上清液中的ifn-β浓度是365.5pg/ml(图69)。此外，mvaδe5r从分选的flt3l-cd103⁺dc诱导ifn-β蛋白分泌完全依赖于cgas，并且myd88不是诱导作用所需的(图69)。

实施例70：与mva相比，bmdc的mvaδe5r感染导致更低水平的细胞死亡。

为了定量与mva感染的bmdc相比，在用常规培养基培养几天后活着的mvaδe5r感染的bmdc的分数，将bmdc用mva或mvaδe5r以10的moi感染。感染后16h收获细胞，并且用live/dead可固定活力染料进行染色，并且进行流式细胞术分析。facs结果显示，76.4％的pbs模拟感染的bmdc是活着的，而只有10.5％的用mva感染的bmdc是活着的。相比之下，66.7％的用mvaδe5r感染的bmdc在感染后16h是活着的(图70)。

实施例71：mvaδe5r感染以cgas依赖性方式促进dc成熟。

已知用mvaδe5r感染的bmdc展现出激活的表型，并且树突延伸。cd40和cd86是两种已知的dc激活标记。为了确定mvaδe5r感染是否诱导dc激活，以及dc成熟是否经由cgas依赖性机制发生，将来自wt和cgas^-/-小鼠的bmdc模拟感染或用mva-ova或mvaδe5r-ova以10的moi感染。在感染后16h收集细胞，并且针对dc成熟标记cd40(图71a)和cd86(图71b)进行染色。bmdc表达高水平的mhcii。在mvaδe5r-ova感染后，cd40在wtbmdc上上调，但在cgas^-/-bmdc中没有(图71a)。bmdc的mvaδe5r-ova感染强烈上调了wtbmdc上的cd86表达，但在cgas^-/-bmdc中没有。在mvaδe5r感染后，89.2％的wtbmdc是cd86⁺，而在mvaδe5r感染后，仅16.5％的cgas^-/-bmdc是cd86⁺。wtbmdc中的mva感染产生50.2％cd86⁺bmdc，但仅产生16.3％cd86⁺cgas^-/-bmdc(图71b)。这些结果证明，bmdc的mvaδe5r感染以cgas依赖性方式诱导dc成熟，如表现为成熟标记(包括cd40和cd86)上调。

实施例72：bmdc的mvaδe5r感染促进抗原交叉呈递，如通过t细胞激活所测量的。

为了测试通过mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r诱导的bmdc激活的功能性意义，将bmdc用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r以3的moi感染3h，然后与鸡卵清蛋白(ova)一起孵育3h。将ova蛋白洗掉，然后将细胞与ot-i细胞(其识别ova257-264siinfekl肽)一起孵育3天。bmdc:ot-1细胞比率是1:1。将ot-1细胞用抗cd69和抗cd8抗体进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。点图展示了表达cd69的cd8⁺细胞(图72a至图72g)。结果显示，mvaδe5r感染的ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物产生65.7％cd69⁺cd8⁺t细胞，而mva感染的ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物产生10.1％cd69⁺cd8⁺t细胞。bmdc的热imva或热imvaδe5r感染也导致ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物中ot-1t细胞的激活。这些结果证明，bmdc的mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染促进bmdc的抗原交叉呈递。

实施例73：bmdc的mvaδe5r感染促进抗原交叉呈递，如通过激活的t细胞的ifn-γ产生所测量的。

在实施例72中概述的实验中，在3天bmdc:ot-1t细胞共培养结束时收集上清液。通过elisa确定上清液中的ifn-γ水平。结果证明，mvaδe5r或热imvaδe5r感染的ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物在上清液中产生了高水平的ifn-γ蛋白(图73)。这些结果表明，bmdc的mvaδe5r或热imvaδe5r感染促进bmdc的抗原交叉呈递。

实施例74：bmdc的vacvδe5r感染促进抗原交叉呈递，如通过激活的t细胞的ifn-γ产生所测量的。

先前观察到，bmdc的vacvδe5r感染比mva诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白产生(图56a和图56b)。为了确定bmdc的vacvδe5r感染是否促进抗原交叉呈递，诸位发明人进行了以下实验。简言之，将bmdc用mva、mvaδe5r或vacvδe5r以3的moi感染3h；或者将bmdc与cgamp(20μm)或模拟对照一起孵育3h。随后将bmdc与ova一起孵育3h，然后将ova蛋白洗掉。然后将细胞与ot-i细胞(其识别ova257-264siinfekl肽)一起孵育3天。收集上清液并通过elisa确定ifn-γ水平(图74)。结果证明，mvaδe5r感染的ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物在上清液中产生了最高水平的ifn-γ。与cgamp处理的ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物相比，vacvδe5r感染的ova脉冲处理的bmdc:ot-1t细胞共培养物分泌更高水平的ifn-γ。这些结果表明，bmdc的vacvδe5r感染也促进抗原交叉呈递。

实施例75：从mva基因组中缺失e5r基因改善疫苗接种功效。

mva是重要且安全的疫苗载体。鉴于mva对来自bmdc的ifn-β分泌具有适度诱导作用，并且对dc成熟具有适度的激活作用，对免疫抑制机制的鉴定可以导致基于mva的疫苗载体设计的改进。为了测试从mva中缺失e5r基因是否改善疫苗接种功效，诸位发明人进行了以下实验。简言之，在第0天，通过皮肤划痕或皮内注射用2x10⁷pfu的mva-ova或mvaδe5r-ova对c57bl/6j小鼠进行疫苗接种(图75a)。一周后从被实施安乐死的小鼠中收获脾，并且将其与ova257-264(siinfekl)肽(10μg/ml)脉冲处理的bmdc共培养12h。然后通过流式细胞术测量cd8⁺t细胞中的细胞内ifn-γ水平。(*p<0.05；**p<0.01)。图75b示出了通过皮肤划痕用mva-ova或mvaδe5r-ova疫苗接种后的激活的cd8⁺t细胞。图75c示出了通过皮内注射疫苗接种mva-ova或mvaδe5r-ova后的激活的cd8⁺t细胞。这些结果证明，与用mva-ova进行疫苗接种相比，通过皮肤划痕或皮内注射用mvaδe5r-ova进行疫苗接种产生更高的激活cd8⁺t细胞。因此，从mva基因组中去除e5r基因改善疫苗接种功效。

实施例76：mvaδe5r感染以cgas依赖性方式从鼠原代成纤维细胞诱导ifnb基因表达和ifn-β分泌。

除了树突状细胞和巨噬细胞外，诸位发明人还研究了皮肤真皮成纤维细胞的mvaδe5r感染是否也诱导i型ifn产生。从雌性wt和cgas^-/-c57bl/6j小鼠产生皮肤真皮成纤维细胞。将细胞用mva、mvaδe5r、热imva或热imvaδe5r感染。在感染后16h收集细胞和上清液。rt-pcr结果显示，mvaδe5r感染在wt真皮成纤维细胞中触发了ifnb基因表达，但在cgas^-/-细胞中没有(图76a)。elisa结果证明，mvaδe5r从mvaδe5r感染的wt真皮成纤维细胞诱导了ifn-β蛋白分泌，但在感染的cgas^-/-细胞中没有(图76b)。相比之下，wt的mva感染从wt真皮成纤维细胞诱导了较低水平的ifn-β蛋白分泌(图76b)。mva感染的wt真皮成纤维细胞的上清液中的ifn-β蛋白浓度是350pg/ml，而与之相比，在mvaδe5r感染的wt真皮成纤维细胞的上清液中是10970pg/ml。这些结果证明，e5是mva感染的真皮成纤维细胞中ifn产生的有效抑制剂，并且mvaδe5r对皮肤真皮成纤维细胞产生强的免疫激活作用。这种免疫激活作用可能有助于其通过皮肤划痕或皮内感染的增强疫苗功效。另外，mvaδe5r可能通过类似的机制激活肿瘤基质细胞或癌症相关成纤维细胞，这将有助于其对改变肿瘤免疫抑制微环境的作用。

实施例77：mvaδe5r获得在cgas或ifnar1缺陷型皮肤原代真皮成纤维细胞中复制其dna的能力。

为了测试cgas或ifnar1是否有助于mva或mvaδe5r病毒在皮肤真皮成纤维细胞中的宿主限制，将来自wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-小鼠的皮肤原代真皮成纤维细胞用mva或mvaδe5r以3的moi感染。在感染后1h、4h、10h和24h收集细胞。通过定量pcr确定病毒dna拷贝数。尽管mva在wt真皮成纤维细胞中复制病毒基因组的能力有限，但其复制能力在cgas^-/-细胞中显著增加，并且在ifnar1^-/-细胞中适度增加(图77a和图77b)。例如，在wt真皮成纤维细胞中，与感染后1h的拷贝数相比，在感染后mvadna拷贝数从4h的2倍增加到10h的28倍，并增加到24h的41倍。在cgas^-/-细胞中，与感染后1h的拷贝数相比，在感染后mvadna拷贝数从4h的8倍增加到10h的120倍，并增加到24h的390倍。在ifnar1^-/-细胞中，与感染后1h的拷贝数相比，在感染后mvadna拷贝数从4h的5倍增加到10h的50倍，并增加到24h的107倍(图77a和图77b)。

类似地，在wt真皮成纤维细胞中，与感染后1h的拷贝数相比，在感染后mvaδe5rdna拷贝数从4h的1倍增加到10h的18倍，并增加到24h的21倍。在cgas^-/-细胞中，与感染后1h的拷贝数相比，在感染后mvaδe5rdna拷贝数从4h的1.8倍增加到10h的87倍，并增加到24h的832倍。在ifnar1^-/-细胞中，与感染后1h的拷贝数相比，在感染后mvaδe5rdna拷贝数从4h的1.9倍增加到10h的57倍，并增加到24h的181倍(图77c和图77d)。这些结果证明，真皮成纤维细胞中cgas介导的传感机制在控制mva和mvaδe5r病毒dna复制方面至关重要，并且ifnar介导的i型ifn正反馈环起着部分作用。

实施例78：mvaδe5r获得在cgas缺陷型皮肤原代真皮成纤维细胞中产生感染性后代病毒的能力。

mva在真皮成纤维细胞中是非复制型的。为了确定cgas介导的胞质dna传感途径和ifanr途径是否在限制感染性病毒体的产生中起作用，将来自wt、cgas^-/-或ifnar1^-/-小鼠的皮肤原代真皮成纤维细胞用mva或mvaδe5r以0.05的moi感染。在感染后1h、24h和48h收集细胞。通过在bhk21细胞上滴定来确定病毒滴度。在wt真皮成纤维细胞中，mva和mvaδe5r二者都是非复制型的。然而，在cgas^-/-细胞中，与感染后1h的滴度相比，感染后48h的mva滴度增加了148倍(图78a和图78b)。更引人注目的是，与感染后1h的滴度相比，感染后48h的mvaδe5r滴度增加了583倍(图78c和图78d)。在ifnar1^-/-细胞中，与感染后1h的滴度相比，在感染后48h，mva和mvaδe5r分别将其滴度增加12倍和19倍(图78a至图77d)。这些结果证明，cgas在限制皮肤真皮成纤维细胞中的mva和mvaδe5r二者复制中起关键作用。

实施例79：鼠黑色素瘤细胞的mvaδe5r感染以sting依赖性方式诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

为了确定肿瘤细胞的mvaδe5r感染是否诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌，将wt和sting^-/-b16-f10细胞(通过sting的crispr-cas9基因靶向产生)用mva或mvaδe5r以10的moi感染。在感染后18h收集细胞。提取rna并进行定量实时pcr分析。rt-pcr结果证明，mvaδe5r在wtb16-f10细胞中诱导了ifnb基因表达，但在sting^-/-细胞中没有。在wtb16-f10细胞中，与mvaδe5r相比，mva感染展示出更弱的ifnb基因表达诱导(图79a)。在感染后18h收集的用mva或mvaδe5r感染的wt和sting^-/-b16-f10细胞上清液中ifn-β蛋白水平的elisa结果证明，mvaδe5r从wtb16-f10细胞诱导适度水平的ifn-β蛋白分泌，但在sting^-/-细胞中没有(图79b)。mva感染未导致ifn-β蛋白分泌(图79b)。

实施例80：鼠黑色素瘤细胞的mvaδe5r感染诱导atp释放，其是免疫原性细胞死亡的标志。

图80证明，鼠黑色素瘤细胞的mvaδe5r感染诱导atp释放，其是免疫原性细胞死亡的标志。简言之，将b16-f10细胞用wt痘苗、mva或mvaδe5r以10的moi感染。病毒感染一小时后，洗涤细胞并添加新鲜培养基。在感染后48h收集上清液。通过使用atplite1步发光atp检测测定系统(perkinelmer，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)确定atp水平。结果显示，鼠黑色素瘤细胞的mva和mvaδe5r感染诱导了比痘苗病毒高的atp释放，这证明mva和重组mva诱导了肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡。未来的研究将检查肿瘤细胞的mva或mvaδe5r感染是否也诱导hmgb1释放，其是免疫原性细胞死亡的另一个标志。

实施例81：表达hflt3l和hox40l的重组mvaδe5r的产生。

此实施例描述了表达hflt3l和hox40l的重组mvaδe5r病毒的产生。图81示出了通过在mva基因组的e4l和e6r基因座处的同源重组而产生表达hflt3l和hox40l的重组mvaδe5r的方案。使用pma载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达hflt3l和hox40l二者的单一表达盒。hflt3l和hox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列的盒分隔开。在e4l和e6r基因座处发生的同源重组导致hflt3l和hox40l的表达盒的插入。图82a和图82b证明，重组mvaδe5r-hflt3l-hox40l病毒具有预期插入，如通过pcr分析所确定的。还对dna插入物进行sanger测序，并且序列如预期的那样。

实施例82：通过用mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染的细胞表达hflt3l和hox40l。

为了测试重组mvaδe5r-hflt3l-hox40l病毒是否在感染的细胞的表面上表达hflt3l和hox40l二者，将bhk-21、鼠b16-f10黑色素瘤细胞和人sk-mel28黑色素瘤细胞铺板并用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l以10的moi感染。包括无病毒模拟感染对照。感染后24小时，收获细胞以用hflt3l和hox40l抗体进行表面染色。通过facs分析来分析hflt3l和hox40l的表面表达。图83a是感染后bhk-21细胞中hflt3l和hox40l的表面表达的点图。图83b是感染后b16-f10细胞中hflt3l和hox40l的表面表达的点图。图83c是感染后sk-mel28细胞中hflt3l和hox40l的表面表达的点图。结果证明，mvaδe5r-hflt3l-hox40l在bhk-21、b16-f10和sk-mel28细胞中高效表达hox40l和hflt3l。鉴于mvaδe5r-hflt3l-hox40l在b16-f10或sk-mel28中不复制，hflt3l和hox40l在感染的肿瘤细胞上的表达是稳健的。

进行蛋白质印迹分析以测试mvaδe5r-hflt3l-hox40l病毒是否在bhk21细胞上表达hflt3l和hox40l(图84)。简言之，将bhk21细胞模拟感染，或用mva或mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染。在感染后24h收集细胞裂解物。蛋白质印迹结果显示，hflt3l和hox40l通过mvaδe5r-hflt3l-hox40l感染的bhk21细胞表达，但mva没有(图84)。

实施例83：重组vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l的产生。

此实施例描述了重组痘苗或mva病毒的产生，所述重组痘苗或mva病毒在tk基因座处表达选择性靶向细胞毒性t淋巴细胞抗原4的抗体，并且在e5r基因座中表达人flt3l和鼠ox40l基因(vac-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l)。图85a示出了单一表达盒的示意图，所述单一表达盒被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达抗体的重链和轻链。9d9的重链(muigg2a)和轻链的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，以使得能够进行核糖体跳跃。构建了pcb质粒，所述质粒含有在任一侧上侧接有胸苷激酶(tk)基因的在痘苗pse/l控制下的抗mu-ctla-4基因以及在痘苗p7.5启动子控制下的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。通过在pcb质粒dna与病毒基因组dna之间在tk基因座处的同源重组来产生从tk基因座表达抗mu-ctla-4的重组病毒。图85b示出了使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)在单一表达盒中表达作为融合蛋白的人flt3l和鼠ox40l二者的示意图。人flt3l和鼠ox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开，从而使得能够进行核糖体跳跃。构建了puc57质粒，所述质粒含有在任一侧上侧接有e4l和e6r基因的人flt3l和鼠ox40l融合基因。通过在puc57质粒dna与病毒基因组dna之间在e5r基因座处的同源重组来产生从e5r基因座表达人flt3l和鼠ox40l融合蛋白的重组病毒。为了产生vac-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l，首先将bsc-40细胞用痘苗病毒以0.05的感染复数(moi)感染1h，然后用上述pcb质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的gpt选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以鉴定具有部分tk基因缺失并具有抗muctla-4插入的重组病毒。在tk基因座处发生的同源重组导致抗mu-ctla-4和gpt表达盒插入病毒基因组dna中以产生vac-tk^--抗muctla-4。在第二步中，将bsc-40细胞用vac-tk^--抗muctla-4以0.1的moi感染1h，然后用上述puc57质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过gfp标记和噬斑纯化来选择重组病毒。进行pcr分析以鉴定具有e5r基因缺失并具有人flt3l和鼠ox40l融合基因插入的重组病毒，以产生vac-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l重组病毒。

实施例84：重组vacv-tk^--抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l的pcr验证以及通过用重组病毒感染的细胞表达抗muctla-4抗体。

使用pcr分析验证重组vacv-tk^--抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l(图86a和图86b)。为了确定重组病毒感染是否导致抗ctla-4抗体的产生，将人sk-mel-28黑色素瘤细胞模拟感染或用e3lδ83n-tk^-载体、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4、e3lδ83n-tk^--hflt3l-抗muctla-4-c7l^--mox40l、vacv、vac-tk^--抗muctla-4-c7l^--mox40l或vac-tk^--抗muctla-4-e5r^--hflt3l-mox40l以10的moi感染。在感染后24h收集细胞裂解物，并且使用10％sds-page分离多肽。使用hrp连接的抗小鼠igg(重链和轻链)抗体检测抗muctla-4抗体的全长(fl)、重链(hc)和轻链(lc)。蛋白质印迹分析示出了在病毒感染后，在sk-mel-28黑色素瘤细胞系中抗ctla-4抗体的全长(fl)、重链(hc)和轻链(lc)的表达(图86c)。因此，这些结果证明，本发明技术的重组病毒具有在感染的细胞中表达抗ctla-4抗体的能力，并且在用于将抗体递送至细胞的方法中是有用的。

实施例85：痘苗e5在痘病毒家族中高度保守。

痘苗e5在痘病毒家族中高度保守。图87示出了来自痘病毒家族的多个成员的e5直系同源物的蛋白质序列比对。e5直系同源物在n末端展现出差异，但在中间至c末端展现出高的保守性。图88a示出了来自痘苗wr和改良安卡拉痘苗病毒(mva)的e5的蛋白质序列比对。与vacv相比，mva缺少前10个氨基酸和n末端处的点突变。图88b示出了来自痘苗病毒的e5和为粘液瘤病毒中的e5直系同源物的m31的蛋白质序列比对。m31和来自痘苗病毒的e5共有约20％同源性。

实施例86：痘苗e5的直系同源物粘液瘤病毒m31抑制cgas和sting诱导的ifn-β途径。

为了研究痘苗e5的直系同源物粘液瘤病毒m31在cgas和sting诱导的ifn-β途径中的作用，将hek293t细胞用表达鼠cgas、人sting的质粒与表达e5r、m31r或pcdna载体对照的质粒一起转染。24h后，收获细胞用于萤光素酶测定。图89a证明，e5和m31二者均能够抑制ifn-β产生。粘液瘤m31展示出比e5更强的抑制作用。图89b显示，将hek293t用表达鼠sting的质粒与表达e5r、m31r或pcdna载体对照的质粒一起转染。转染后24h，确定萤光素酶信号。e5未阻断ifn-β产生，而m31仍然抑制sting诱导的ifn-β产生，这证明m31可以在cgas和sting诱导的ifn-β途径的下游起作用。

实施例87：痘苗e5促进cgas泛素化。

为了评估e5是否通过促进cgas泛素化来阻断cgas诱导的ifn-β途径，将hek293t细胞用flag-cgas和ha-泛素转染。24小时后，将细胞用wtvacv或vacvδe5r感染。在6hpi收集细胞裂解物。用抗flag抗体免疫沉淀cgas，并且通过抗ha抗体检测泛素化(图90a)。图90b示出了全细胞裂解物(wcl)上cgas和β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析。vacv在感染后诱导了cgas泛素化，而vacvδe5r诱导了较低水平的cgas泛素化，这证明痘苗e5促进cgas泛素化。

实施例88：在鼠b16-f10黑色素瘤单侧肿瘤植入模型中，瘤内递送mvaδe5r延迟肿瘤生长并延长存活期。

为了测试瘤内递送mvaδe5r是否产生抗肿瘤作用，使用了单侧鼠b16-f10肿瘤植入模型。简言之，将5x10⁵个b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6小鼠的右侧腹。肿瘤植入后八天，每周两次向肿瘤注射pbs或4x10⁷pfu的mva、mvaδe5r或热imva。每周两次测量肿瘤大小并监测小鼠存活(图91a)。小鼠存活率示于图91b中。在用pbs治疗的小鼠中，b16-f10肿瘤迅速生长，这导致早期死亡，中位存活期为11天。瘤内注射mvaδe5r具有优于mva的抗肿瘤作用，从而导致肿瘤生长延迟和存活改善。itmvaδe5r得到了与热imva等效的抗肿瘤作用，在mvaδe5r和热imva两个治疗组中有60％的小鼠存活。

实施例89：与mvaδe5r相比，bmdc的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染导致更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

图92a至图92c显示，与mvaδe5r相比，bmdc的mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染导致更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。图92a至图92c示出了产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r病毒的示意图。第一步涉及通过在c8l和c6r基因座处同源重组，从而用在pse/l启动子控制下的hflt3l替换c7l基因来产生mvaδc7l-hflt3l。第二步涉及通过在tk基因座处同源重组，从而用在pse/l启动子控制下的mox40l替换tk基因来产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l。所得病毒在图5a和图5b中描述。第三步是通过在e4l和e6r基因座处同源重组，从而用在p7.5启动子控制下的mcherry替换e5r基因来产生mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r。图92d示出了在用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染的bmdc中ifnb基因表达的rt-pcr结果。将wt和ifnar^-/-bmdc模拟感染或用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r以10的moi感染。在感染后16h收集细胞并进行rt-pcr。图92e示出了在用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r感染的bmdc的上清液中ifn-β蛋白水平的elisa结果。将wt和ifnar^-/-bmdc模拟感染或用mvaδe5r、mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l或mvaδc7l-hflt3l-tk(-)mox40lδe5r以10的moi感染。在感染后16h收集上清液，并且进行elisa以测量ifn-β蛋白水平。与mvaδe5r和mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l相比，mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r在wtbmdc中在rna水平和蛋白质分泌两个方面诱导了最高的ifn-β产生。在ifnar^-/-bmdc中，通过mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r诱导的ifn-β产生远低于wtbmdc中的产生，这证明mvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40lδe5r诱导的ifn-β产生部分依赖于ifnar途径。

实施例90：产生mvaδc7lδe5r-hflt3l-mox40l和mvaδc7l-ova-δe5r-hflt3l-mox40l。

图93a和图93b示出了产生mvaδc7lδe5r-hflt3l-mox40l和mvaδc7l-ova-δe5r-hflt3l-mox40l的方案。图93a示出了产生mvaδc7lδe5r-hflt3l-mox40l的方案。构建了pma质粒，以使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)在单一表达盒中表达作为融合蛋白的人flt3l和鼠ox40l二者。人flt3l和鼠ox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是2a肽(pep2a)序列的盒分隔开。通过在pma质粒与mvaδc7l病毒基因组之间在e4l和e6r基因座处的同源重组来产生从e5r基因座表达人flt3l和鼠ox40l融合蛋白的重组病毒。图93b示出了产生mvaδc7l-ova-δe5r-hflt3l-mox40l的方案。通过在pma质粒与mvaδc7l-ova病毒基因组之间在e4l和e6r基因座处的同源重组来产生从e5r基因座表达人flt3l和鼠ox40l融合蛋白的重组病毒。

实施例91：粘液瘤m64具有对ifn-β诱导的ifn敏感反应元件激活的抑制作用。

为了确定粘液瘤m62或m64是否具有c7对ifnar信号传导的类似抑制作用，将hek293t细胞用isre-萤火虫萤光素酶报告物、表达海肾萤光素酶的对照质粒prl-tk、表达粘液瘤m62r、粘液瘤m62r-ha、粘液瘤m64r、粘液瘤m64r-ha、痘苗c7l的或对照质粒转染。转染后24h，将细胞在收获之前再用ifn-β处理24h。测量萤光素酶活性。结果证明，粘液瘤m64的瞬时过表达抑制ifn-β诱导的isre激活(图94a)。

为了确定粘液瘤m62或m64是否具有c7对sting诱导的ifnb启动子激活的类似抑制作用，将hek293t细胞用isre-萤火虫萤光素酶报告物、表达海肾萤光素酶的对照质粒prl-tk和表达sting的质粒与表达粘液瘤m62r、粘液瘤m62r-ha、粘液瘤m64r、粘液瘤m64r-ha、痘苗c7l的或对照质粒一起转染。结果证明，粘液瘤m64或m62的瞬时过表达未能抑制sting诱导的ifnb启动子激活(图94b)。

实施例92：本发明技术的工程化痘病毒的瘤内注射与(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))的任何组合的全身性递送的组合在治疗实体瘤方面比单独的it病毒更有效。

为了测试本发明技术的工程化痘病毒(例如，mvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4)的瘤内递送与(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))的任何组合的全身性递送的组合是否与单独的it病毒相比具有优异的针对大型已建立b16-f10黑色素瘤的抗肿瘤功效，将5x10⁵个细胞皮内植入c57b/6小鼠的右侧腹中。肿瘤植入后九天，当肿瘤直径为5mm时，每周两次将它们用(a)itpbs；(b)itmvaδe3l-ox40l、mvaδc7l-ox40l、mvaδc7l-hflt3l-ox40l、mvaδc7lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-ox40l-δc11r、vacvδc7l-ox40l、vacvδc7l-hflt3l-ox40l、vacvδe5r、vacv-tk^--抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l、vacvδb2r、vacve3lδ83nδb2r、vacvδe5rδb2r、vacve3lδ83nδe5rδb2r、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12、vacve3lδ83n-δtk-抗ctla-4-δe5r-hflt3l-ox40l-il-12-δb2r、myxvδm31r、myxvδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm63r、myxvδm64r、mvaδwr199、mvaδe5r-hflt3l-ox40l-δwr199、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40lδwr199-hil-12δc11r-hil-15/il-15α、vacvδe5r-il-15/il-15rα、vacvδe5r-il-15/il-15rα-ox40l、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rα、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200δc11r、vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12δb2rδwr199δwr200-hil-15/il-15rαδc11r、myxvδm63rδm64r、myxvδm62r、myxvδm62rδm63rδm64r、myxvδm31r、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r、myxvδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα、myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-抗ctla-4和/或myxvδm62rδm63rδm64rδm31r-hflt3l-ox40l-il-12-il-15/il-15rα-抗ctla-4+与腹膜内施用(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))治疗。测量肿瘤体积并监测小鼠存活。预期，与单独的工程化痘病毒的施用相比，本发明技术的一种或多种工程化痘病毒和(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和/或(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))的组合施用将导致增强的抗肿瘤作用。

因此，这些结果将显示，本发明技术的工程化痘病毒和(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和/或(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))的组合施用在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。进一步预期，与单独的工程化痘病毒的施用相比，本发明技术的工程化痘病毒和(i)一种或多种免疫检查点阻断剂和/或一种或多种免疫系统刺激剂；(ii)一种或多种抗癌药物；和/或(iii)免疫调节药物(即，芬戈莫德(fty720))的组合施用将在这方面产生协同作用。

实施例93：表达hflt3l和mox40l的重组mvaδe5r的产生

此实施例描述了表达hflt3l和mox40l的重组mvaδe5r病毒的产生。图95示出了通过在mva基因组的e4l和e6r基因座处的同源重组而产生表达hflt3l和mox40l的重组mvaδe5r的方案。使用puc57载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达hflt3l和mox40l二者的单一表达盒。hflt3l和mox40l的编码序列由弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列分隔开。在e4l和e6r基因座处发生的同源重组导致hflt3l和mox40l的表达盒的插入。

实施例94：通过用mvaδe5r-hflt3l-mox40l感染的细胞表达hflt3l和mox40l。

为了测试重组mvaδe5r-hflt3l-mox40l病毒是否在感染的细胞表面上表达hflt3l和mox40l二者，进行了以下实验。将bhk-21、鼠b16-f10黑色素瘤细胞和人sk-mel28黑色素瘤细胞用mva或mvaδe5r-hflt3l-mox40l以moi10感染。包括无病毒模拟感染对照。感染后24小时，收获细胞以用hflt3l和mox40l抗体进行表面染色。通过facs分析来分析hflt3l和mox40l的表面表达。图96a是感染后bhk-21、b16-f10和sk-mel28细胞中hflt3l和mox40l的表面表达的点图。图96b是感染后bhk-21、b16-f10和sk-mel28细胞中hflt3l和mox40l表达的平均荧光强度(mfi)的条形图。结果显示，在感染后24h，mvaδe5r-hflt3l-mox40l在bhk-21、b16-f10和sk-mel28细胞中高效表达mox40l和hflt3l。鉴于mvaδe5r-hflt3l-mox40l在b16-f10或sk-mel28中不复制，hflt3l和mox40l在感染的肿瘤细胞上的表达是稳健的。

实施例95：与mva、mvaδe5r或热imva相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l诱导更强的全身性抗肿瘤t细胞免疫。

进行elispot以评估用mva、mvaδe5r、mvaδe5r-hflt3l-mox40l或热imva治疗的小鼠的脾中抗肿瘤特异性t细胞的产生。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。植入后8天，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤注射4x10⁷pfu的mva、mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或等效量的热imva。收获脾用于elispot分析(图97)。将1,000,000个脾细胞与1.5x10⁵个经辐照的b16-f10细胞在37℃下在抗ifn-γ包被的bdelispot板微孔中一起培养过夜。将脾细胞用经γ-辐照器辐照的b16-f10细胞刺激，并且用抗ifn-γ抗体检测ifn-γ分泌。图98a至图98b示出了来自用pbs、mvaδe5r、mvaδe5r-hflt3l-mox40l或热imva治疗的单独小鼠的每1,000,000个脾细胞的ifn-γ⁺斑点的代表性图像。图99a至图99c示出了来自用pbs、mvaδe5r、mvaδe5r-hflt3l-mox40l或热imva治疗的每个组中单独小鼠的每1,000,000个脾细胞的ifn-γ⁺斑点的数量。这些结果证明，在鼠b16-f10黑色素瘤双侧植入模型中，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l在治疗小鼠中产生抗肿瘤t细胞方面比mva、mvaδe5r或热imva更有效。

实施例96：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射和未注射的远端肿瘤二者中cd8⁺和cd4⁺t细胞的激活。

为了评估itmvaδe5r-hflt3l-mox40l是否导致局部和全身性抗肿瘤免疫的产生，如实施例3中所述那样使用了双侧b16-f10肿瘤植入模型。第二次注射后两天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4和cd8抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物。与热imva相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致未注射肿瘤中总cd8⁺t细胞以及颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比更高(图100a至图100c)。引入注目地，与热imva相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致未注射肿瘤中总cd4⁺t细胞以及颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的百分比更高(图101a至图101c)。另外，与热imva相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l也导致注射肿瘤中总cd8⁺t细胞和颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比更高(图102a至图102c)。另外，与热imva相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l在注射肿瘤中诱导了更高百分比的颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞(图103a至图103c)。这些结果证明，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l在注射和未注射肿瘤二者内诱导细胞毒性cd8⁺t细胞和cd4⁺t细胞方面比热imva更有效，并且证明这些病毒构建体在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例97：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射的远端肿瘤中调节性t细胞的减少。

为了评估itmvaδe5r-hflt3l-mox40l是否影响肿瘤浸润性调节性t细胞，如实施例95中所述那样使用了双侧b16-f10肿瘤植入模型。第二次注射后两天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4、cd8和ox40抗体进行表面标记，以及还用于细胞内foxp3染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物。itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比和绝对数量减少(图103a至图103c)。在pbs、热imva和itmvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗组中，未注射肿瘤中treg的百分比和绝对数量不存在显著差异(图104a至图104c)。ox40l的受体ox40在cd4⁺foxp3⁺t细胞上高度表达(图105a至图105c)。itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中ox40⁺cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比和绝对数量减少(图105a至图105c)，这在未注射肿瘤中没有观察到(图106a至图106c)。ox40在cd4⁺foxp3^-t细胞(图107a至图107c)和cd8⁺t细胞(图108)中未高度表达。这些结果证明，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l减少注射肿瘤中的ox40⁺cd4⁺foxp3⁺t细胞，并且在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例98：瘤内(it)递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l对注射的远端肿瘤中调节性t细胞(treg)的减少依赖于mvaδe5r-hflt3l-mox40l的ox40l表达。

为了评估瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l对treg的减少是否依赖于mox40l表达，使用了双侧b16-f10肿瘤植入模型，并且比较了瘤内递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l与mvaδe5r的降低效率。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入野生c57bl/6j右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。植入后八天，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤注射4x10⁷pfu的mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或pbs。第二次注射后两天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4和cd8抗体进行表面标记，以及还用于细胞内foxp3染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物。在注射肿瘤中，与pbs相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比和绝对数量显著减少(图109a至图109c)。相比之下，瘤内注射mvaδe5r未显著影响cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比(图109a至图109c)。这些结果证明，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l对注射肿瘤中treg的耗尽依赖于重组病毒的ox40l表达。

实施例99：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，与wt小鼠相比，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致ox40^-/-中的注射肿瘤中cd8⁺和cd4⁺t细胞的更强激活。

为了比较通过瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l在wt和ox40^-/-小鼠中诱导的免疫反应，使用了双侧b16-f10肿瘤植入模型。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入野生型c57bl/6j或ox40^-/-小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。植入后十天，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤注射4x10⁷pfu的mvaδe5r或mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或pbs。第二次注射后两天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4、cd8和ox40抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b、ki67和foxp3染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物(图110)。在野生型和ox40^-/-小鼠二者中，与pbs组相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中总cd8⁺t细胞和cd8⁺颗粒酶b⁺t细胞的百分比和数量更高(图111a至图111e)。瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l还导致来自野生型和ox40^-/-小鼠二者的注射肿瘤中总cd4⁺t细胞和cd4⁺颗粒酶b⁺t细胞的百分比和数量更高(图112a至图112e)。与wt小鼠相比，在ox40^-/-小鼠中，mvaδe5r-hflt3l-mox40l注射的肿瘤中cd8⁺和cd4⁺t细胞中的颗粒酶b表达更高(图111a至图112e)。这些结果表明，ox40表达可能与肿瘤中的免疫抑制有关。由于肿瘤浸润treg表达高水平的ox40，因此不受理论的束缚，假定调节性t细胞上的ox40表达可能对其免疫抑制功能是重要的。

实施例100：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l减少来自野生型小鼠但不减少来自ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中的调节性t细胞。

为了测试瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l对调节性t细胞的减少是否是由于ox40l-ox40相互作用，比较了在来自用pbs或mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的野生型小鼠与用pbs或mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的ox40^-/-小鼠的注射肿瘤中cd4⁺t细胞中cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比。在wt小鼠中，与pbs治疗的肿瘤相比，在mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的肿瘤中，cd4⁺t细胞中cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比减少。相比之下，在ox40^-/-小鼠中，cd4⁺t细胞中cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比在pbs和mvaδe5r-hflt3l-mox40l组中是相似的(图113a至图113b)。在wt小鼠中，ox40⁺foxp3⁺cd4⁺细胞的百分比从pbs治疗的肿瘤中的48％减少至mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的肿瘤中的19％(图114a至图114c)。ox40⁺foxp3⁺cd4⁺细胞绝对数量/克肿瘤从pbs治疗的肿瘤中的–减少至mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的肿瘤中的--(图114b)。如预期的那样，foxp3⁺cd4⁺细胞上的ox40表达是不存在的(图114c)。这些结果表明，mvaδe5r-hflt3l-mox40l诱导的注射肿瘤中treg的减少可能依赖于treg上ox40的表达。

在wt小鼠中，与pbs治疗的肿瘤相比，在mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的肿瘤中，foxp3^-cd4⁺上ox40的表达也降低(图115a至图115c)。不希望受理论的束缚，可能的是ox40l/ox40相互作用可能导致无法检测到这些细胞上的ox40表达。

实施例101：与wt小鼠相比，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致来自ox40^-/-小鼠的未注射肿瘤中cd8⁺和cd4⁺t细胞的更强激活和增殖。

为了测试itmvaδe5r-hflt3l-mox40l是否导致未注射肿瘤中的免疫反应，在用mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs第二次注射后2天收获未注射肿瘤。进行facs分析以评价cd8⁺和cd4⁺t细胞上的颗粒酶b(激活标记)和ki67(增殖标记)表达。与用pbs治疗的那些相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致cd45⁺细胞中cd8⁺细胞的百分比增加，以及cd8⁺细胞中颗粒酶b⁺cd8⁺细胞的百分比增加(图116a至图116e)。另外，与用pbs治疗的那些相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致cd8⁺t细胞中ki67⁺cd8⁺细胞增加(图117a至图117c)。与wt小鼠中的那些相比，在ox40^-/-小鼠中，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l对未注射肿瘤中的cd8⁺t细胞引起了更强的激活和增殖反应(图116a至图117c)。

与用pbs治疗的那些相比，关于来自用itmvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗的小鼠的未注射肿瘤中的cd4⁺t细胞中颗粒酶b⁺cd4⁺和ki67⁺cd4⁺t细胞的百分比得到了类似的观察结果。与wt小鼠中的那些相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l也对ox40^-/-小鼠的未注射肿瘤中的cd4⁺t细胞引起了更强的激活和增殖反应(图118a至图119c)。这些结果表明，ox40在注射和未注射肿瘤二者中负性调节通过itmvaδe5r-hflt3l-mox40l诱导的免疫反应。可能的是ox40对于ox40⁺foxp3⁺cd4⁺t细胞实现其免疫抑制功能，从而抑制cd4⁺和cd8⁺效应t细胞二者的功能而言是重要的。这些结果表明，it免疫原性和ifn诱导mva(如mvaδe5r)与全身性递送ox40阻断剂(如抗ox40l抗体)的组合可能在注射和未注射肿瘤二者中引起强的抗肿瘤作用，并且证明这些病毒构建体在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。实施例102：在b16-f10双侧肿瘤植入模型中，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中局部cd8+t细胞的激活。

为了评估阻断t细胞从淋巴器官运输到外周血是否会影响由itmvaδe5r-hflt3l-mox40l引起的抗肿瘤作用，使用了双侧b16-f10肿瘤植入模型和fty720(抑制淋巴细胞从淋巴组织外出的免疫调节药物)(图xx幻灯片27)。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。植入后七天，每隔一天向每只小鼠腹膜内注射25μgfty720或作为对照的dmso。植入后九天，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤注射4x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs，间隔三天。监测肿瘤生长。第二次注射后两天，收获肿瘤并称重。处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4、cd8和ox40抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b和ki67染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物(图120)。

与dmso对照组相比，在pbs治疗组中，注射和未注射肿瘤二者在fty720存在下均更侵略性地生长(图121)。相比之下，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l抑制来自fty720或dmso治疗的小鼠的注射和未注射肿瘤二者的生长(图121)。

在dmso对照组中，注射肿瘤中的cd45⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比因itmvaδe5r-hflt3l-mox40l而增加。fty720治疗后，cd45⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比稍微低于dmso/pbs组，并且itmvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗未增加cd45⁺细胞中cd8⁺t细胞的百分比(图122a至图122d)xxb)。相比之下，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致dmso和fty720两个组中颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比显著增加(图122a和图122c)。itmvaδe5r-hflt3l-mox40l还导致dmso和fty720两个组中ki67⁺cd8⁺t细胞的百分比增加(图122d)。

另外，与dmso相比，在fty720存在下，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤的tdln中激活的颗粒酶b⁺cd8⁺和ki67⁺cd8⁺t细胞的百分比更高(图123a至图124b)，这表明在fty720存在下，通过itmvaδe5r-hflt3l-mox40l诱导的激活的cd8⁺t细胞被捕获在ln中。这些结果证明，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l激活局部cd8⁺t细胞，并且即使不从淋巴器官募集t细胞也能够抑制肿瘤生长，并且在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例103：瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l延迟at3三阴性乳腺癌模型中的肿瘤生长。

为了评估通过瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l在乳腺肿瘤中产生的抗肿瘤作用，使用了双侧at3鼠乳腺肿瘤植入模型(图125)。简言之，将1x10⁵个at3细胞植入c57bl/6j小鼠的第4脂肪垫。肿瘤植入后14天，将6x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或热imva、或pbs瘤内注射两次，间隔三天。每次注射前测量肿瘤。第二次注射后两天，测量注射肿瘤并收获用于重量测量和facs分析。与热imva或pbs相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致肿瘤生长延迟(图126a)。两次注射后，与热imva或pbs相比，使用itmvaδe5r-hflt3l-mox40l的肿瘤更小(图126b)。这些结果证明，在at3乳腺肿瘤植入模型中，与热imva相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l导致更强的抗肿瘤作用。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在治疗实体瘤中是有用的。

实施例104：在at3三阴性乳腺癌模型中，瘤内(it)注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致注射肿瘤中cd8⁺t细胞的激活和调节性t细胞的减少。

为了评估通过瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l在乳腺肿瘤中诱导的免疫反应，如实施例103中所述那样使用了双侧at3鼠乳腺肿瘤植入模型(图125)。第二次注射后两天，收获注射肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4和cd8抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b和foxp3染色。与热imva或pbs相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致cd8⁺t细胞的百分比和绝对数量更高(图127b)。与热imva相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l还诱导更高百分比的颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞(图127a和图127c)。然而，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l或热imva均未诱导更高百分比的颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞(图128a至图128e)。在itmvaδe5r-hflt3l-mox40l或热imva的情况下，cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比从31％减少至约11％(图129a至图129c)。这些结果证明，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l在at3乳腺肿瘤植入模型中导致cd8⁺t细胞的激活和调节性t细胞的减少，并且在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例105：瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l和全身性递送抗pd-l1抗体的组合治愈双侧b16-f10黑色素瘤。

为了测试与单独的it病毒相比，瘤内递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l和全身性递送抗pd-l1的组合是否具有优异的抗肿瘤功效，使用了双侧鼠b16-f10肿瘤植入模型。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹1x10⁵个)。肿瘤植入后七天，每周两次将mvaδe5r-hflt3l-mox40l(4x10⁷pfu)递送至右侧腹上的较大肿瘤中，伴随腹膜内(ip)注射抗pd-l1(250μg/小鼠)。每周两次测量肿瘤大小并监测小鼠存活(图130)。单独小鼠的注射和未注射肿瘤的体积示于图131a至图131b中。在用pbs治疗的小鼠中，肿瘤迅速生长，这导致早期死亡，中位存活期为12.5天(图131a至图132b)。与pbs相比，瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l导致肿瘤生长延迟和存活改善，将中位存活期延长至25天(图131a至图131b)。用瘤内递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l和腹膜内递送抗pd-l1的组合治疗的小鼠在上次调查时均在存活。九只小鼠中有七只无肿瘤，并且预期被治愈b16-f10黑色素瘤(图131a至图131b)。基于双侧肿瘤模型或大型已建立肿瘤模型中的itmvaδc7l-hflt3l-tk(-)-mox40l和全身性递送抗ctla-4或抗pd-l1的先前组合疗法，不受理论的束缚，预期在双侧肿瘤模型或大型已建立肿瘤模型中，与单独的it病毒相比，瘤内递送mvaδe5r-hflt3l-mox40l和全身性递送抗ctla-4或抗pd-1的组合应产生优异的结果。

实施例106：与mva相比，mvaδe5r-hflt3l-ox40l诱导更高水平的ifnb基因表达。

检查了mvaδe5rhflt3l-hox40l与mva感染的bmdc对ifnb基因表达和ifn-β分泌的诱导。简言之，将bmdc(1x10⁶个)用mvaδe5rhflt3l-hox40l或mva以10的moi感染。1h感染后洗涤细胞并添加新鲜培养基。在感染后6h收集细胞，并且在感染后19h收集上清液。通过rt-pcr确定ifnb基因表达(图132a)。通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平(图132b)。rt-pcr结果显示，mvaδe5rhflt3l-hox40l强烈诱导ifnb基因表达和ifn-β分泌(图132a和图132b)。

实施例107：用mvaδe5r-hflt3l-hox40l离体感染

乳房外佩吉特病(empd)是罕见的生长缓慢的皮肤癌，其发生在上皮中，并且通常起源于外阴、阴囊或肛周区域处的顶泌腺细胞。它通常仅限于上皮，但它可以进展并成为侵袭性的。治疗选择通常是有限的，包括手术、放射疗法、局部咪喹莫特、光动力疗法。分析了将活检标本与mvaδe5r-hflt3l-hox40l一起离体培养如何影响empd中肿瘤浸润淋巴细胞的表型。简言之，用锋利的剃刀将肿瘤组织切成小块，并且用mvaδe5r-hflt3l-hox40l以10的moi感染。感染两天后，将组织在37℃下用胶原酶d()消化45min。将细胞过滤并用抗cd3、cd4、cd8抗体进行染色，随后透化并用抗颗粒酶b和foxp3抗体进行染色。进行facs分析。示出了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞和foxp3⁺cd4⁺t细胞的代表性点图(图133a和图133b)。图134a示出了用mvaδe5r-hflt3l-hox40l或pbs对照感染两天后，cd8⁺细胞中颗粒酶⁺cd8⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝3)。图134b示出了用mvaδe5r-hflt3l-hox40l或pbs对照感染两天后，cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比的图。数据是平均值±sem(n＝3)。这些结果显示，用mvaδe5r-hflt3l-hox40l离体感染empd导致cd8⁺细胞中颗粒酶⁺cd8⁺t细胞的百分比增加并且cd4⁺细胞中foxp3⁺cd4⁺t细胞的百分比减少(图134a和图134b)，从而支持mvaδe5r-hflt3l-hox40l的免疫刺激功能。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例108：mvaδe3lδe5r和mvaδe3lδe5rhflt3l-mox40l重组病毒的产生

为了测试从mvaδe5r或mvaδe5rhflt3l-mox40l中缺失痘苗e3l基因是否改善病毒的免疫原性，产生了mvaδe3lδe5r和mvaδe3lδe5rhflt3l-mox40l。所述过程由多个步骤组成。在第一步中，通过在mva基因组的e4和e6基因座处的同源重组来产生mvaδe5r和mvaδe5rhflt3l-mox40l(图135a和图135b)。在第二步中，使用e3l-mcherryfrt构建体通过在e2l和e4l基因座处的同源重组来从重组病毒中去除内源性e3l(图135c)。通过pcr确认插入e3l基因座中的mcherry构建体的正确整合和纯度。所得病毒缺少e3l和e5r基因二者。为了有利于以后的工程化步骤，将frt位点包括在用于e3l缺失的构建体中。该构建体具有在p7.5启动子近侧的一个frt位点和在mcherry远侧的另一个frt位点。在第三步中，当需要对病毒进行进一步工程化时，允许此病毒在表达flp重组酶的细胞中复制，以便从病毒基因组中去除mcherry。

实施例109：与mvaδe5r相比，mvaδe3lδe5r在bmdc中诱导更高水平的ifnb基因表达，并且所述诱导在很大程度上依赖于cgas。

痘苗e3是重要的毒力因子，其具有n末端z-dna和c末端dsrna结合结构域。在鼻内感染模型中，vacvδe3l的鼻内感染是非致病性的。与mva相比，mvaδe3l诱导更高水平的i型ifn(dai等人,plospathogens2014)。为了测试与mvaδe5r、热imva或mva相比，mvaδe3lδe5r是否诱导更高水平的i型ifn，将来自wtc57bl/6j和cgas^-/-小鼠的bmdc(1x10⁶个)用mvaδe3lδe5r、mvaδe5r、热imva或mva以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。通过rt-pcr确定ifnb基因表达。结果显示，在wtbmdc中，与mvaδe5r相比，mvaδe3lδe5r诱导更高水平的ifnb基因表达。mvaδe5r诱导的ifnb基因表达在cgas^-/-细胞中完全丢失，而mvaδe3lδe5r诱导的ifnb基因表达在cgas^-/-细胞中在很大程度上降低，这表明另外的途径(如mda5/mavs介导的胞质dsrna传感途径)可能在检测bmdc中由此病毒产生的dsrna方面起次要作用(图136)。

实施例110：鼠b16-f10黑色素瘤细胞的mvaδe3lδe5r感染强烈诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

测试了mvaδe3lδe5r和mvaδe5是否能在鼠b16-f10黑色素瘤细胞中诱导ifnb基因表达和蛋白质分泌。将b16-f10细胞用mvaδe3l、mvaδe5r或mvaδe3lδe5r以10的moi感染。在感染后15h收集细胞。在感染后24h收集上清液。rt-pcr分析显示，与mvaδe3l或mvaδe5r(分别为300倍或50倍)相比，b16-f10鼠黑色素瘤细胞的mvaδe3lδe5r感染诱导非常强的ifnb诱导(4000倍)。此差异是高度显著的(p<0.0001)(图137a)。这表明e3l和e5r基因的缺失具有协同作用。elisa结果显示，与用mvaδe3l感染的那些相比，b16-f10细胞的mvaδe3lδe5r感染在感染的细胞的上清液中诱导高得多水平的ifn-β蛋白水平(分别为3498pg/ml与479pg/ml)。mvaδe5r未能在b16-f10细胞中诱导ifn-β蛋白分泌。为了测试哪些核酸传感途径对于检测b16-f10细胞中的mvaδe3lδe5r感染是重要的，使用crispr-cas9产生了mda5^-/-和mda5^-/-sting^-/-b16-f10细胞系，并且使用针对靶向蛋白的蛋白质印迹和靶向外显子的测序验证了相应蛋白和基因的丢失。这些结果显示，mvaδe3lδe5r对ifnb的强诱导在很大程度上是mda5依赖性的，如通过rt-pcr和elisa中mda5^-/-细胞的显著降低水平所示的。

实施例111：鼠b16-f10黑色素瘤细胞的mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l感染强烈诱导感染的细胞表面上的hflt3l和mox40l表达。

为了测试e3l基因的缺失是否影响hflt3l或mox40l的表达，将b16-f10细胞用mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l、mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r感染1h。将细胞洗涤并在新鲜培养基中孵育，并且24h后收获。用抗hflt3l和抗mox40l抗体对细胞进行染色，并且进行facs。图138示出了来自facs的代表性点图，其展示了mox40l或hflt3l细胞在用mvaδe3lδe5rhflt3l-mox40l或mvaδe5rhflt3l-mox40l感染的b16-f10细胞表面上的表达。对照病毒mvaδe3lδe5r感染的b16-f10细胞如预期的那样未能表达hflt3l和mox40l。这些结果表明，e3l基因的缺失未能影响两个转基因hflt3l和mox40l的表达。

实施例112：与mvaδe5r-hflt3l-mox40l相比，瘤内递送mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l诱导更强的抗肿瘤全身性t细胞反应。

鉴于与mvaδe5r相比，用mvaδe3lδe5r感染bmdc和b16-f10通过激活cgas/sting介导的胞质dna传感途径和mda5/mavs介导的胞质dsrna传感途径来诱导更强的i型ifn产生，不受理论的束缚，假设瘤内递送mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l病毒将诱导更强的抗肿瘤免疫反应。为了测试这一点，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，将2x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l、mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l、等效量的热imva、或pbs向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内(it)注射两次，间隔三天。在第二次注射后2天收获脾，进行elispot分析以评价脾中的肿瘤特异性t细胞。通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和脾细胞(1,000,000个)来进行elispot测定。图139a示出了来自同一治疗组中小鼠的合并脾细胞的一式三份样品的elispot的图像。图139b示出了每1,000,000个脾细胞的ifn-γ⁺斑点的图。这些结果显示，与mvaδe5r-hflt3l-mox40l或热imva相比，itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在治疗的小鼠的脾中产生了最强的抗肿瘤t细胞反应。这些结果表明，在肿瘤中对mda5/mavs介导的胞质dsrna传感途径的激活对于产生强的抗肿瘤适应性免疫反应可能是重要的。

实施例113：瘤内递送mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l延迟b2m缺陷型b16-f10细胞。

在免疫检查点阻断疗法后，在伴有抗性复发的肿瘤中观察到了β2微球蛋白(b2m)基因的突变。为了测试mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l是否对此类肿瘤有效，使用crispr-cas9技术产生了b2m缺陷型b16f10肿瘤模型。β2微球蛋白(b2m)是mhci类复合物的主要组分。facs分析确认，仅用抗b2mgrna转染的细胞高频率地丢失了表面mhc，这指示有效的crispr(数据未示出)。使用细胞分选分离缺少i类表面mhc的细胞。从此分选中选择单一克隆分离株以用于测序和后续体内实验。此b2m^-/-克隆分离株在b2m的外显子2中具有178bp缺失，这消除了b2m的一半编码序列并产生了移码(数据未示出)。

将wt和b2m^-/-b16-f10黑色素瘤细胞(2.5×10⁵个)皮内植入c57b/6j小鼠的右侧腹。为了使b2m肿瘤成功植入，在植入有wt或b2m^-/-b16-f10细胞的小鼠中，使用pk136抗体(在第-1天、第2天和第5天，200μg/小鼠)耗尽nk细胞。允许肿瘤生长10天。之后，每周两次瘤内(it)注射4x10⁷pfu的mvaδe3lδe5rhflt3l-mox40l或pbs。测量肿瘤大小并且监测小鼠的存活(图140)。

图141a示出了用pbs或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l瘤内治疗的小鼠中注射的wt和b2m^-/-b16-f10肿瘤的肿瘤体积。wt和b2m^-/-b16-f10肿瘤二者均对mvaδe5r-hflt3l-mox40l治疗有反应，并且肿瘤生长延迟。图141b示出了四个组的kaplanmeier存活曲线。itmvaδe3lδe5rhflt3l-mox40l病毒对携带b2m缺陷型或wtb16-f10肿瘤的小鼠产生了明确的存活益处。到第24天，未经治疗的小鼠都没有存活，而用mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l治疗的所有携带b2m^-/-肿瘤的小鼠都活着。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例114：在at3三阴性乳腺癌模型中，瘤内(it)注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l诱导注射肿瘤中的cd8⁺t细胞激活和增殖

为了比较通过瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l和mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在乳腺肿瘤中诱导的免疫反应，使用了双侧at3鼠乳腺肿瘤植入模型(图142)。简言之，将1x10⁵个at3细胞植入c57bl/6j小鼠的第4脂肪垫。肿瘤植入后12天，将6x10⁷pfu的mvaδe5r-hflt3l-mox40l、或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l、或pbs瘤内注射两次，间隔三天。第二次注射后两天，收获注射肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4、cd8和ox40抗体进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b、ki67和foxp3染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物。与pbs相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l诱导cd45⁺细胞中更高百分比的cd8⁺t细胞(图143b)。与pbs和mvaδe5r-hflt3l-mox40l相比，在itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l的情况下cd8⁺t细胞的绝对数量更高(图143c)。与pbs相比，mvaδe5r-hflt3l-mox40l或mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l二者均增加了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的百分比(图143a、图143d)。与pbs和mvaδe5r-hflt3l-mox40l相比，在itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l的情况下颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的绝对数量更高(图143e)。itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l还诱导了更高百分比和绝对数量的ki67⁺cd8⁺t细胞(图144a至图144c)。这些结果证明，在at3乳腺癌模型中，与itmvaδe5r-hflt3l-mox40l相比，itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在激活cd8t细胞和促进cd8⁺t细胞增殖方面更有效。因此，这些结果证明，本发明技术的病毒构建体在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例115：在at3三阴性乳腺癌模型中，瘤内(it)注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l激活注射肿瘤中的cd4⁺t细胞并减少调节性t细胞

为了比较通过瘤内注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l和mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l在乳腺肿瘤中诱导的免疫反应，如实施例114中所述那样使用了双侧at3鼠乳腺肿瘤植入模型(图142)。itmvaδe5r-hflt3l-mox40l或itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l后，cd3⁺t细胞中总cd4⁺t细胞的百分比与pbs相比没有变化(图145b)，但是在病毒注射后cd4⁺t细胞的绝对数量显著增加(图145c)。与mvaδe5r-hflt3l-mox40l或pbs相比，itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l还产生了更多的颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞(图145e)。与pbs相比，itmvaδe5r-hflt3l-mox40l或itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l均导致cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比显著降低(图146a、图146b)。病毒注射后，ox40⁺cd4⁺foxp3⁺t细胞的百分比降低(图147a至图147c)。这些结果证明，在at3乳腺癌模型中，itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l诱导cd4⁺t细胞激活并减少调节性t细胞。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例116：在at3三阴性乳腺癌模型中，瘤内(it)注射mvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l减少注射肿瘤中的巨噬细胞和dc。

为了评估itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l是否影响乳腺肿瘤中的髓样细胞群，如实施例114中所述那样使用了双侧at3鼠乳腺肿瘤植入模型(图142)。第二次注射后两天，收获注射肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd19、cd49b、cd45、mhc-ii、cd11c、ly6g、f4/80、ly6c和cd24抗体进行表面标记。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物。与pbs相比，itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l导致总cd45⁺细胞中巨噬细胞的百分比和数量显著降低(图148a、图148b)。在itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l和itmvaδe5r-hflt3l-mox40l的情况下树突状细胞的百分比降低(图148c)，并且cd11b⁺和cd103⁺dc二者的百分比降低(图148e至图148h)。这些结果证明，在at3乳腺癌模型中，itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l减少注射肿瘤中的巨噬细胞和dc。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例117：自发性乳腺癌对itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l和全身性递送抗pd-l1和抗ctla-4抗体的组合疗法有反应。

为了评价itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l与抗pd-l1和抗ctla-4抗体的组合在三阴性乳腺癌中的治疗功效，使用了mmtv-pymt自发性乳腺癌模型。在第一个肿瘤变得可触及后，开始向肿瘤注射mvaδe5r-hflt3l-mox40l。向每只小鼠腹膜内给予250μg抗pd-l1和100μg抗ctla-4抗体。每周两次测量肿瘤大小(图149)。与pbs对照组相比，组合治疗导致肿瘤生长延迟(图150)。此结果证明，自发性乳腺癌对itmvaδe3lδe5r-hflt3l-mox40l和全身性递送抗pd-l1和抗ctla-4抗体的组合疗法有反应。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒组合物在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例118：mvaδe5rhflt3l-mox40lδc11r重组病毒的产生

痘苗c11r编码痘苗生长因子。wt痘苗(西部保留地)基因组具有两个拷贝，而mva基因组具有一个拷贝。在双萤光素酶筛选测定中，c11基因被鉴定为参与抑制cgas/sting途径的八个痘苗早期基因之一(图19和图20)。为了测试从mvaδe5r-hflt3l-mox40l中缺失c11r基因是否增强病毒的i型ifn诱导能力，通过在mvaδe5r-hflt3l-mox40l基因组的c17l/c16l和c10l基因座处的同源重组来产生重组病毒mvaδe5r-hflt3l-mox40lδc11r(图151)。

实施例119：与mvaδe5rhflt3l-mox40l相比，mvaδe5rhflt3l-mox40lδc11r在bmdc中诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

为了测试与mvaδe5r相比，mvaδe5r-hflt3l-mox40lδc11r是否诱导更高水平的i型ifn，将来自wtc57bl/6j小鼠的bmdc(1x10⁶个)用mvaδe5r-hflt3l-mox40lδc11r、或mvaδe5r、或mva以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。在感染后19h收集上清液。通过rt-pcr确定ifnb基因表达。结果显示，与mvaδe5r相比，mvaδe5r-hflt3l-mox40lδc11r诱导更高水平的ifnb基因表达(图152a)。

通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平(图152b)。结果显示，与mvaδe5r相比，bmdc的mvaδe5r-hflt3l-mox40lδc11r感染诱导更高水平的ifn-β蛋白分泌。这些结果表明，从mvaδe5r-hflt3l-mox40l中去除c11r基因进一步改善病毒的ifn诱导能力。

实施例120：mvaδwr199和mvaδe5rhflt3l-mox40lδwr199重组病毒的产生。

痘苗wr199基因编码68kda的锚蛋白重复蛋白，并且是在筛选cgas/sting途径的抑制剂中鉴定的八个痘苗早期基因之一(图19)。为了测试从mva或mvaδe5r-hflt3l-mox40l中缺失wr199基因是否分别增强病毒的i型ifn诱导能力，通过在mva和mvaδe5r-hflt3l-mox40l基因组的b17l和b19r基因座处的同源重组来产生重组病毒mvaδwr199和mvaδe5r-hflt3l-mox40lδwr199(图153)。将frt位点放置在编码mcherry的基因的侧接区域，以有利于荧光颜色去除以便进一步工程化病毒。

实施例121：从mva或mvaδe5rhflt3l-mox40l中缺失wr199基因改善病毒在bmdc中的ifnb基因诱导能力。

为了测试从mva或mvaδe5r-hflt3l-mox40l中缺失wr199基因是否诱导更高水平的i型ifn，将来自wt和cgas^-/-c57bl/6j小鼠的bmdc(1x10⁶个)用mva或mvaδwr199以10的moi感染或用等效量的热imva感染。在感染后6h收集细胞。在感染后19h收集上清液。通过rt-pcr确定ifnb基因表达。结果显示，在bmdc中，与mva相比，mvaδwr199诱导更高水平的ifnb基因表达，但与热imva相比，诱导更低水平的ifnb(图154a)。在cgas^-/-bmdc中，mvaδwr199诱导的ifnb基因诱导完全丢失(图154a)。

四个分离的mvaδe5r-hflt3l-mox40lδwr199克隆。产生了bmdc，并且将细胞用四个克隆之一、mvaδwr199或mvaδe5r感染。rt-pcr分析显示，与mvaδe5r或mvaδwr199相比，mvaδe5r-hflt3l-mox40lδwr199诱导更高水平的ifnb基因表达(图154b)。

通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平(图154c)。结果显示，与mvaδe5r或mvaδwr199相比，bmdc的mvaδe5r-hflt3l-mox40lδwr199感染诱导更高水平的ifn-β蛋白分泌。这些结果表明，从mva或mvaδe5r-hflt3l-mox40l中去除wr199基因进一步改善病毒的ifn诱导能力。

实施例122：具有b2r缺失的重组痘苗病毒(vacvδb2r)的产生。

最近报道了痘苗b2r基因编码降解2',3'-环状gmp-amp(cgamp)的核酸酶，其有助于cgas介导的胞质dna传感途径的免疫逃逸(eaglesham等人,2019)。此基因在痘病毒家族中高度保守。然而，mva中的b2r基因被截短并且蛋白质无活性。从其中痘苗胸苷激酶基因(tk)的vtf7-3西部保留地毒株产生了具有b2r缺失的突变型痘苗，并且发现所述突变型痘苗在皮肤划痕模型中比亲本病毒更减毒。为了独立于tk缺失测试b2r基因缺失对病毒毒力的影响，产生了vacvδb2r突变型病毒，并且在鼻内感染模型中评价了病毒的毒力。

简言之，使用pb2r-frtgfp载体将在痘苗p7.5启动子控制下的gfp插入痘苗病毒(vacv；西部保留地毒株)的b2r基因座中。表达盒在任一侧上侧接有b1r和b3r基因的部分序列(图155)。将bsc40细胞用wt痘苗病毒以0.05的moi感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过其绿色荧光(因gfp插入b2r基因座中)来鉴定重组病毒。在bsc40细胞上对阳性克隆进行4-5次噬斑纯化。进行pcr分析以确认重组病毒vacvδb2r丢失了b2r基因。

实施例123：痘苗b2r基因编码毒力因子。

为了确定痘苗病毒b2r基因是否有助于鼻内感染模型中的毒力，将各组6周龄wt雌性c57bl/6j小鼠用两种不同剂量(2x10⁷或2x10⁶pfu)的vavcδb2r鼻内感染。监测在用vacvδb2r鼻内感染后c57bl/6j小鼠的重量减轻和存活。以任一剂量感染vacvδb2r在感染后第6天左右导致最大重量减轻(初始重量的20％左右)。小鼠在感染后第13天恢复其重量，并且它们全部存活(图156a和图156b)。这些结果表明，与wtvacv(其ld50为2x10⁵pfu)相比，vavcδb2r在鼻内感染模型中高度减毒。

实施例124：重组痘苗病毒vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r的产生。

为了测试b2r和e5r基因二者从wtvacv背景或vacvδe3l83n(其缺少编码n末端83个氨基酸的z-dna结合结构域的dna片段)中复合缺失的影响，产生了vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r。简言之，使用pb2r-frtgfp载体将在痘苗p7.5启动子控制下的gfp插入突变型痘苗病毒vacvδe5r(图157a)或vacvδe3l83nδe5r(其通过从vacvδe3l83n病毒中缺失e5r基因而产生)(图157b)的b2r基因座中。表达盒在任一侧上侧接有b1r和b3r基因的部分序列(图157)。

将bsc40细胞用vacvδe5r或vacvδe3l83nδe5r以0.05的moi感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过其绿色荧光(因gfp插入b2r基因座中)来鉴定重组病毒。然后在bsc40细胞上对阳性克隆进行4-5次噬斑纯化。进行pcr分析以确认重组病毒vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r丢失了b2r基因。

实施例125：重组痘苗病毒vacvδe5rδb2r和vacvδe3l83nδe5rδb2r在鼠鼻内感染模型中高度减毒。

用2x10⁷pfu的vacvδe5r、vacvδb2r、vacvδe3l83nδe5r、vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r对6周龄wt雌性c57bl/6j小鼠进行鼻内感染。监测小鼠的重量减轻和存活(图158)。用vacvδe3l83nδe5rδb2r感染导致这些小鼠的重量减轻最少，其中最大重量减轻为初始重量的10％左右(图158)。与vacvδe5r或vacvδb2r相比，用vacvδe5rδb2r感染也导致较少的重量减轻(图158)。所有的小鼠都从感染中存活下来。这些结果表明，b2r和e5r或者b2r、e5r和e3l83n的复合缺失导致病毒进一步减毒。

实施例126：骨髓衍生的树突状细胞(bmdc)的vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r感染比vacvδb2r或vacvδe5r诱导更高水平的i型ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

痘苗e5r基因表达导致cgas降解(实施例63和实施例64)。痘苗b2r基因编码降解cgamp(其是cgas的产物)的核酸酶。不受理论的束缚，假设从痘苗基因组中双重缺失b2r和e5r基因可以导致感染的bmdc中ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌的诱导增强。

为了测试这一点，将wt和cgas^-/-bmdc用vacvδe3l83nδe5r、vacvδe5rδb2r、vacvδe3l83nδe5rδb2r、vacvδe3l83n、vacvδb2r或vacvδe5r以10的moi感染，或用等效量的热imva感染。在感染后6h收集细胞。提取rna。通过定量pcr分析来确定ifnb基因表达水平。在感染后24h收集上清液，并且通过elisa测量ifn-β水平。rt-pcr结果显示，与未治疗对照相比，bmdc的wtvacv感染诱导了水平高225倍的ifnb基因表达，而与未治疗对照相比，vacvδe3l83n、vacvδb2r、或vacvδe5r、vacvδe3l83nδe5r感染分别诱导了水平高223倍、410倍、3054倍、3117倍的ifnb基因表达。与未治疗对照相比，vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r感染诱导了水平高9970倍和10383倍的ifnb基因表达(图159a)。elisa结果显示，bmdc的vacvδb2r、vacvδe5r或vacvδe3l83nδe5r感染从bmdc诱导了ifn-β蛋白分泌，从而导致上清液中的ifn-β水平分别为22、232和189pg/ml。vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r感染诱导了更高水平的ifn-β分泌，其中上清液中的ifn-β为700和763pg/ml(图159b)。在cgas^-/-bmdc中，减毒的痘苗未能诱导ifnb基因表达或ifn-β蛋白分泌(图159a和图159b)。

这些结果表明，与单一b2r或e5r缺失相比，b2r和e5r的组合缺失从bmdc诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。另外，从用减毒的突变型痘苗感染的bmdc诱导ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例127：与vacvδb2r或vacvδe5r相比，骨髓衍生的树突状细胞(bmdc)的vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r感染诱导更高水平的sting、tbk1和irf3磷酸化。

为了测试从wtvacv基因组中双重缺失b2r和e5r或从wtvacv基因组中三重缺失e3l83n、b2r和e5r是否会诱导cgas-sting信号传导途径的更强激活，将bmdc用vacv、vacvδb2r、vacvδe5r、vacvδe3l83nδe5r、vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r以10的moi感染。在感染后2h、4h和6h收集细胞裂解物。在sds-page凝胶中分离蛋白质，并且将其用针对磷酸化sting、tkb1和irf3的抗体印迹。与vacvδb2r或vacvδe5r相比，vacvδe5rδb2r或vacvδe3l83nδe5rδb2r在感染的bmdc中诱导了更高水平的sting、tbk1和irf3磷酸化(图160)。这些结果表明，从wtvacv基因组中双重缺失b2r和e5r或从wtvacv基因组中三重缺失e3l83n、b2r和e5r导致cgas/sting/tbk1/irf3信号传导途径的更强激活。

实施例128：重组痘苗病毒vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)或vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδb2r)的产生。

此实施例描述了重组vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12或vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r病毒的产生。

图161示出了通过首先在vacvδe3l83n基因组的tk基因座处然后在e5r基因座处的同源重组而产生表达抗muctla-4、hflt3l、mox40l和mil12蛋白的重组vacvδe3l83nδtkδe5r病毒的逐步策略。使用pcb-抗muctla-4gpt载体插入单一表达盒以在痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下表达抗muctla-4抗体重链和轻链。在tk-l和tk-r位点处发生的同源重组导致将抗ctla-4抗体的表达盒插入vacvδe3l83n基因组的tk基因座中，从而产生重组病毒vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4。

使用puc57-hflt3l-mox40l-mil12mcherry载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)在相反的方向上分别表达hflt3l-mox40l融合蛋白和mil12蛋白二者的单一表达盒。hflt3l-mox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列的盒分隔开。e4l和e6r基因座处的同源重组导致将hflt3l-mox40l和mil12的表达盒插入vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4病毒的e5l基因座中。将bsc40细胞用vacvδe3l83n以0.05的moi感染1h，然后用质粒pcb-抗muctla-4gpt转染。在48h收集感染的细胞。通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。进行pcr分析以验证抗muctla-4基因向tk基因座中的插入。

为了将hflt3l-mox40l-mil12表达盒插入vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4病毒的e5r基因座中，将bsc40细胞用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4以0.05的moi感染1h，然后用质粒puc57-hflt3l-mox40l-mil12mcherry转染。在48h收集感染的细胞。通过经选择mcherry阳性噬斑进行至少4-5轮噬斑纯化来分离重组病毒。进行pcr分析以验证hflt3l-mox40l-mil12基因向e5r基因座中的插入。

图162示出了通过从vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒中缺失b2r基因来产生vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r病毒。使用pb2r-frtgfp载体将在痘苗p7.5启动子控制下的gfp插入重组病毒vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12的b2r基因座中。将bsc40细胞用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒以0.05的moi感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过其绿色荧光(因gfp插入b2r基因座中)并且通过亲本病毒中的mcherry来鉴定重组病毒。然后在bsc40细胞上对阳性克隆进行4-5次噬斑纯化。进行pcr分析以确认重组病毒vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒丢失了b2r基因。

实施例129：vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r在bsc40细胞和b16-f10黑色素瘤细胞中具有复制能力。

vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)在bsc40细胞和鼠b16-f10黑色素瘤细胞中的复制能力通过以0.01的moi感染它们来确定。在感染后的不同时间点收集细胞，并且通过在bsc40细胞上滴定来确定病毒产量(logpfu)。图163示出了对感染后小时数作图的病毒产量的图。vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r二者在bsc40细胞和b16-f10黑色素瘤细胞中均高效复制。

实施例130：bmdc的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)感染诱导i型ifnb基因的表达和ifn-β蛋白的分泌。

为了测试重组病毒vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)和vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)是否在bmdc中诱导i型ifn产生，将wt和cgas^-/-bmdc用这些病毒以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。提取rna。通过定量rt-pcr分析来确定ifnb基因表达水平。在感染后24h收集上清液，并且通过elisa测量上清液中的ifn-β水平。rt-pcr结果显示，与未治疗对照相比，bmdc的wtvacv感染诱导了水平高225倍的ifnb基因表达，而与无感染对照相比，vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12或vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r感染分别诱导了水平高1546倍和5501倍的ifnb基因表达(图164a)。ov-vacvδe5rδb2r或ov-vacvδe5r对ifnb基因表达的诱导在cgas^-/-bmdc中被消除。

elisa结果显示，bmdc的vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12或vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r感染从bmdc诱导了ifn-β分泌(图164b)。这些结果表明，vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)或vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r(ov-vacvδe5rδb2r)与wtvacv相比从bmdc诱导了更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。另外，与ov-vacvδe5r相比，bmdc的ov-vacvδe5rδb2r感染诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-b分泌(图164)。因此，与ov-vacvδe5r相比，ov-vacvδe5rδb2r具有更多的免疫激活性。

实施例131：抗muctla-4-hflt3l,mox40l在用e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil12病毒感染的b16-f10黑色素瘤细胞中表达。

为了确定vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)重组病毒是否能够表达所需的转基因，将b16-f10鼠黑色素瘤细胞用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)以10的moi感染。在感染后的不同时间(8、24和48小时)收集细胞裂解物。进行蛋白质印迹分析以确定抗muctla-4和hflt3l蛋白的表达。如图165a中所示，在用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒感染的b16-f10细胞中存在抗muctla-4抗体和hflt3l的丰富表达。还将b16-f10鼠黑色素瘤细胞用vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12以10的moi感染，并且通过facs分析来确定mox40l在细胞表面上的表达。如图165b中所示，99.5％的感染的细胞在细胞表面上表达mox40l。这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒具有在感染的细胞中表达特定目的转基因的能力。

实施例132：瘤内注射的e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒具有在体内植入肿瘤中表达所需转基因的能力。

使用单侧肿瘤植入模型评估重组病毒是否可以在体内植入肿瘤中表达特定转基因。将b16-f10黑色素瘤细胞(5x10⁵个细胞)皮内植入c57bl/6j小鼠的右侧腹上的剃毛皮肤中。肿瘤植入后八天，向肿瘤(直径约4mm)注射vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒。在病毒注射后48小时收集肿瘤样品。蛋白质印迹分析显示，在用表达mil-12的重组病毒治疗的肿瘤中检测到mil-12，但在pbs治疗的肿瘤中没有(图165c)。这些结果证明，重组vacvδe3l83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒可以在体内注射肿瘤中表达所需的特定转基因。

实施例133：经由感染e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12病毒从鼠b16-f10黑色素瘤细胞、4t1乳腺癌细胞和mc38结肠癌细胞分泌mil-12。

为了检查重组病毒感染的细胞是否能够分泌所需的蛋白质，将b16-f10鼠黑色素瘤细胞、4t1乳腺癌细胞和mc38结肠癌细胞模拟感染，或用vacv或e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)以10的moi感染。在感染后24和48小时收集上清液。使用elisa测量上清液中分泌的mil-12的浓度。如图166中所示，在e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)病毒感染的b16-f10黑色素瘤细胞(图166a)、4t1乳腺癌细胞(图166b)和mc38结肠癌细胞(图166c)的上清液中存在高水平的mil-12蛋白。这些结果证明，肿瘤细胞的ov-vacvδe5r感染导致mil-12释放。为了避免mil-12毒性，将细胞外基质标签插入il12p30亚基的c末端。mil12的p40和p30亚基的编码序列由弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列分隔开。将p30亚基的c末端用基质结合序列标记。

实施例134：在双侧b16-f10肿瘤植入模型中，瘤内注射e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12(ov-vacvδe5r)比ht-imva更有效。

为了测试重组病毒e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12的体内肿瘤杀伤活性，使用了双侧肿瘤植入模型。将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(1x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。在植入后7至8天后，每周两次向右侧腹上的较大肿瘤(直径约3mm或更大)瘤内注射pbs、ht-imva、e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12或e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12+腹膜内(ip)注射抗pd-l1抗体(250μg/小鼠)。监测小鼠的存活并且每周两次测量肿瘤大小。图167a示出了肿瘤体积，并且图167b示出了实验的kaplan-meier存活曲线。图167b显示，具有pbs模拟治疗的肿瘤的小鼠生长极快，并且所述小鼠死亡时具有14天的中位存活期。将ht-imva注射至肿瘤中将中位存活时间延长至18天。注射e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12将中位存活期增加至30天。瘤内注射e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12+腹膜内注射抗mupd-l1抗体(250μg/小鼠)也将中位存活期增加至30天。图167a展示了注射肿瘤和未注射肿瘤随时间推移测量的肿瘤体积。这些结果证明，通过工程化e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12表达抗muctla-4、hflt3l、mox40l和mil-12能够在注射和未注射肿瘤二者中减小肿瘤体积并且减慢肿瘤生长，从而证明远位效应。因此，这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

实施例135：与e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12或热imva相比，瘤内递送e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12δb2r诱导更强的抗肿瘤全身性t细胞反应。

与e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12相比，用e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r感染bmdc诱导更强的i型ifn产生。不受理论的束缚，假设瘤内递送e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r病毒会诱导更强的抗肿瘤免疫反应。为了测试从e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12中进一步缺失b2r是否会增强抗肿瘤功效，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57b/6j小鼠的左侧腹和右侧腹(右侧腹5x10⁵个并且左侧腹2.5x10⁵个)。肿瘤植入后七天，将2x10⁷pfu的e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r、e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12、或等效量的热imva、或pbs向右侧腹上的较大肿瘤中瘤内注射两次，间隔三天。在第二次注射后3天收获脾，进行elispot分析以评价脾中的肿瘤特异性t细胞。通过在96孔板中共培养经辐照的b16-f10细胞(150,000个)和脾细胞(1,000,000个)来进行elispot测定。图168a示出了每1,000,000个脾细胞的ifn-γ⁺斑点的图。图168b示出了来自同一治疗组中小鼠的合并脾细胞的一式三份样品的elispot的图像。这些结果显示，与e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12或热imva相比，瘤内注射e3lδ83n-δtk-抗muctla-4-δe5r-hflt3l-mox40l-mil-12-δb2r在治疗小鼠的脾中产生了最强的抗肿瘤t细胞反应。

实施例136：具有tk-e3l83n-e5r缺失并表达抗huctla-4、hflt3l、hox40l和hil-12的重组痘苗病毒(vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-hil-12)的产生。

此实施例描述了重组vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4-δe5r-hflt3l-hox40l-il-12病毒的产生。

图169示出了通过首先在vacvδe3l83n基因组的tk基因座处然后在e5r基因座处的同源重组而产生表达抗huctla-4、hflt3l、hox40l和hil12蛋白的重组vacvδe3l83nδtkδe5r病毒的逐步策略。使用pcb-抗huctla-4gpt载体插入单一表达盒以在痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)控制下表达抗huctla-4抗体重链和轻链。在tk-l和tk-r位点处发生的同源重组导致将抗huctla-4抗体的表达盒插入vacvδe3l83n基因组的tk基因座中，从而产生重组病毒vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4。使用puc57-hflt3l-hox40l-hil12mcherry载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)在相反的方向上分别表达hflt3l-hox40l融合蛋白和hil12蛋白二者的单一表达盒。hflt3l-hox40l的编码序列由包含弗林蛋白酶切割位点接着是pep2a序列的盒分隔开。e4l和e6r基因座处的同源重组导致将hflt3l-hox40l和hil12的表达盒插入vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4病毒的e5l基因座中。将bsc40细胞用vacvδe3l83n以0.05的moi感染1h，然后将用质粒pcb-抗muctla-4gpt转染。将在病毒后48h收集感染的细胞。将通过在包含mpa、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基中进一步培养来选择重组病毒，并且进行噬斑纯化。将进行pcr分析以验证抗muctla-4基因向tk基因座中的插入。为了将hflt3l-hox40l-hil12表达盒插入vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4病毒的e5r基因座中，将bsc40细胞用vacvδe3l83n-δtk-抗huctla-4以0.05的moi感染1h，然后将用质粒puc57-hflt3l-hox40l-hil12mcherry转染。将在病毒后48h收集感染的细胞。将通过经选择mcherry阳性病毒噬斑进行噬斑纯化来分离重组病毒。将进行pcr分析以验证hflt3l-hox40l-hil12基因向e5r基因座中的插入。将对痘苗b2r、b18r和wr199基因进行进一步缺失以增强此病毒的先天免疫反应。

实施例137：重组粘液瘤病毒粘液瘤δm063r和粘液瘤δm064r的产生。

粘液瘤m063r(m63r)和m064r(m64r)是痘苗c7的直系同源物。为了测试从亲本基因组中缺失m063r或m064r是否改善粘液瘤病毒的ifn诱导能力，诸位发明人通过在转染质粒和亲本粘液瘤病毒基因组的同源臂处的同源重组产生了粘液瘤δm063r和粘液瘤δm064r(图170)。使用puc57载体插入被设计为使用痘苗病毒合成早期和晚期启动子(pse/l)表达egfp的单一表达盒。在m062r和m064r基因座处发生的同源重组导致egfp表达盒的插入和m063的缺失。类似地，在m063r和m065r基因座处发生的同源重组导致egfp表达盒的插入和m064的缺失。简言之，将bgmk细胞用亲本粘液瘤病毒粘液瘤δm127-mcherry(粘液瘤-mcherry)以0.05的moi感染1h，然后用上述质粒dna转染。在48h收集感染的细胞。通过其绿色荧光(因egfp插入m063或m064基因座中)并且通过亲本病毒中的mcherry来鉴定重组病毒。然后在bgmk细胞上将双重阳性克隆纯化6-8次。进行pcr分析以确认重组病毒粘液瘤δm063r(δm63r)和粘液瘤δm064r(δm064r)分别丢失了m063r和m064r基因。

实施例138：与亲本病毒相比，粘液瘤δm063r和粘液瘤δm064r在bmdc中诱导更高水平的ifnb基因表达和ifn-β蛋白分泌。

为了测试从亲本粘液瘤病毒(粘液瘤-mcherry)中缺失m063r基因或m064r基因是否诱导更高水平的i型ifn，将来自wtc57bl/6j小鼠的bmdc(1x10⁶个)用粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm063r、粘液瘤δm064r或mva以10的moi感染。在感染后6h收集细胞。在感染后19h收集上清液。通过rt-pcr确定ifnb基因表达。结果显示，在bmdc中，粘液瘤δm063r和粘液瘤δm064r二者与粘液瘤-mcherry相比均诱导更高水平的ifnb基因表达，但与mva相比诱导更低水平的ifnb(图171a)。

通过elisa确定上清液中的ifn-β蛋白水平(图171b)。结果显示，与粘液瘤-mcherry相比，bmdc的粘液瘤δm064和粘液瘤δm063感染二者均诱导更高水平的ifn-β蛋白分泌。这些结果表明，从粘液瘤病毒中去除痘苗c7直系同源物进一步改善病毒的ifn诱导能力。

实施例139：在b16-f10黑色素瘤模型中，瘤内递送粘液瘤-mcherry或粘液瘤δm064r在治疗后两天的注射肿瘤中诱导cd8和cd4t细胞激活。

为了评估瘤内递送亲本粘液瘤病毒或粘液瘤δm064r是否改变免疫抑制肿瘤微环境，进行了以下实验。简言之，将b16-f10黑色素瘤细胞皮内植入c57bl/6j小鼠右侧腹(5x10⁵个细胞)和左侧腹(2.5x10⁵个细胞)上的剃毛皮肤中。植入后七天，仅向右侧腹上的较大肿瘤注射一次4x10⁷pfu的粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064、或mvaδe5r、或pbs。注射后两天，收获肿瘤并且处理细胞以用抗cd3、cd45、cd4、cd8进行表面标记，以及还用于细胞内颗粒酶b染色。通过facs分析肿瘤中的活免疫细胞浸润物(图172)。图173a示出了颗粒酶b⁺cd8⁺t细胞的代表性点图。it粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064或mvaδe5r导致注射肿瘤中cd8⁺t细胞的激活。图173b显示，与用pbs治疗的那些相比，it粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064或mvaδe5r导致注射肿瘤中cd45⁺细胞的数量更高。图173c显示，与用pbs治疗的那些相比，it粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064或mvaδe5r导致注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd8⁺细胞的百分比更高。图174a示出了颗粒酶b⁺cd4⁺t细胞的代表性点图。it粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064或mvaδe5r导致注射肿瘤中cd4⁺t细胞的激活。图174b显示，与用pbs治疗的那些相比，it粘液瘤-mcherry、粘液瘤δm064或mvaδe5r导致注射肿瘤中颗粒酶b⁺cd4⁺细胞的百分比更高。这些结果证明，本发明技术的重组痘病毒在用于治疗实体瘤的方法中是有用的。

等效物

本发明技术并非受限于本申请中描述的具体实施方案，所述实施方案旨在作为本发明技术的单独方面的单一说明。对于本领域技术人员将清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行许多修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和设备外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和设备。此类修改和改变意图落在所附权利要求的范围内。本发明技术仅由所附权利要求的条款以及此类权利要求授权的等效物的全部范围来限定。应理解，本发明技术不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然它们可以改变。还应理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的。

另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(markushgroup)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开文本因此也按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。

如由本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何所列范围均可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如由本领域技术人员将理解，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞均包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，如由本领域技术人员将理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。

本文所提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物都通过引用以其整体而并入，包括所有图形和表格，并入程度使其不会与本说明书的明确教导内容不一致。

其他实施方案在以下权利要求中提出。

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技术研发人员：L·邓;J·沃尔乔克;S·舒曼;T·梅古布;N·杨;Y·王;G·梅佐;P·戴;W·王
技术所有人：纪念斯隆凯特琳癌症中心
我是此专利的发明人

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