本发明涉及至少两种组分(组分a和组分b)的组合，组分a是抗ceacam6抗体tpp-3310，组分b是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体，抗pd-1抗体优选纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)，抗pd-l1抗体优选阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab)。
本发明的另一方面涉及本文所述的此类组合用于制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
本发明的又一方面涉及治疗或预防受试者癌症的方法，其包括向所述受试者给予治疗有效量的本文所述的组合。
此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含以下的组合：
-组分a，其是抗ceacam6抗体tpp-3310；
-组分b，其是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体，抗pd-1抗体优选纳武单抗或派姆单抗，抗pd-l1抗体优选阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗，和任选地
-一种或多种药物制剂c；
其中任选地，所述组分a和b之一或两者均为同时(simultaneously)、同时(concurrently)、分别或顺序给药的即用型(readyforuse)药物制剂的形式。
组分a和b优选通过静脉途径给药。
在一些实施方案中，癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌(nsclc)、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌。
背景技术：
癌症是美国第二大最常见的死亡原因，每年导致450,000例死亡。尽管在确定癌症的一些可能的环境和遗传原因方面已取得实质性进展，但仍需要靶向癌症和相关疾病的其他治疗方式。特别地，需要用于治疗与生长/增殖失调有关的疾病的治疗方法。
癌症是对具有后天功能性能力(如增强的对凋亡的生存力/抗性和无限的增殖潜力)的细胞进行选择过程后产生的复杂疾病。因此，优选的是开发用于癌症疗法的药物，以解决已建立的肿瘤的不同特征。
已经在许多肿瘤中描述了针对肿瘤相关抗原的t细胞应答，其通常引起肿瘤特异性记忆t细胞在淋巴器官或在血液中的积累。然而，t细胞针对自体肿瘤细胞反应的能力通常较低。许多肿瘤具有阻断t细胞的效应子功能的能力，这导致了肿瘤免疫疗法的有限活性。对于多种癌症，已证实了t细胞针对肿瘤细胞的无应答性。
免疫系统依赖于多个检查点或“免疫制动子(immunologicalbrake)”，以避免免疫系统在健康细胞上过度活化。肿瘤细胞通常利用这些检查点来逃避免疫系统的检测。ctla-4和pd-1是已经作为癌症疗法的靶点进行研究的检查点。
检查点蛋白调节t细胞活化或功能。已知许多检查点蛋白，例如ctla-4及其配体cd80和cd86；和pd-1及其配体pd-l1和pd-l2。这些蛋白负责t细胞应答的共刺激性或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白调节并维持自我耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。当前，不同的免疫疗法方法正成为各种恶性疾病的有力治疗策略。
最近一个非常著名的癌症免疫疗法成功的实例涉及免疫检查点阻断疗法，所述疗法通过靶向免疫效应子t细胞或抗原呈递细胞(包括肿瘤细胞)上的抑制性分子的单克隆抗体(mab)。用共抑制剂干扰已被证明可释放出强大的抗肿瘤t细胞应答(pardoll:theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy.natrevcancer12:(2012)252–264)。
ctla-4已被证明在某些癌症中被异常上调并存在于t细胞表面，从而抑制了对肿瘤细胞应答的t细胞活化。pd-1是另一个免疫学检查点，已被发现在某些肿瘤中上调；它抑制t细胞功能，从而有助于肿瘤逃避免疫系统的能力。
用于免疫细胞活化，从而用于癌症的免疫疗法的免疫检查点分子的抗体阻断是经过临床验证的方法。在2011年，ctla-4阻断抗体伊匹单抗(ipilimumab)已被fda批准用于转移性黑色素瘤(yervoy)的二线疗法。另一个实例是阻断pd-1/pd-l1轴，对此已批准或正在临床研发几种药物，并且已经报道了在黑色素瘤、肺癌、rcc、膀胱癌等中令人印象深刻的临床反应(shenandzhao:efficacyofpd-1andpd-l1inhibitorsandpd-l1expressionstatusincancer:meta-analysis.bmj2018；362:k3529)。
在2013年，据报道抗ctla4和抗pd1mab的组合治疗可以协同作用于提高晚期黑素瘤患者的生存率和肿瘤消退(wolchok等人:nivolumabplusipilimumabinadvancedmelanoma.nengljmed369:(2013)122–133)。
ceacam6还有助于调节cd8+t细胞应答。在表达多个ceacam家族成员的多发性骨髓瘤中，用抗ceacam6mab或sirna沉默ceacam6治疗，恢复了针对恶性浆细胞的t细胞反应性，这表明ceacam6在cd8+t细胞应答调节中的作用(witzens-harig等人,blood2013may30；121(22):4493-503)。wo2016/150899a2中公开了用于癌症免疫疗法的非常有效的抗cecam6抗体，包括tpp-3310。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。但是，以下参考文献可以为本发明所属领域的技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义，并且只要这些定义与本领域中通常了解的含义一致，就可以参考和使用。此类参考文献包括但不限于singleton等人,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(第2版1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walkered.,1988)；hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology(1991)；和lackie等人,thedictionaryofcell&molecularbiology(第3版1999)；和cellularandmolecularimmunology,eds.abbas,lichtmanandpober,第2版,w.b.saunderscompany。可以咨询本领域普通技术人员可获得的任何其他技术资源，其提供本文所用术语的具有本领域通常理解的含义的定义。为了本发明的目的，进一步定义以下术语。其他的术语在说明书的其他地方定义。如本文和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指出，单数形式“一个(a)”和“该(the)”包括复数参考物。因此，例如，对“一个基因”的提及是对一个或多个基因的提及，并且包括本领域技术人员已知的其等价物，等等。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，特定的多肽序列还隐含包括其保守修饰的变体。
在本文，氨基酸可以用它们众所周知的三个字母符号或iupac-iub生化命名委员会推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可以用它们通常被接受的单字母编码来指代。
根据本发明，术语“抗体”应以其最广泛的含义来理解，并且包括免疫球蛋白分子，例如完整或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选由通常通过二硫键相互连接的四条多肽链，两条重(h)链和两条轻(l)链组成。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区可包含例如三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(cl)组成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和vl通常由三个cdr和最多四个fr组成，从氨基端至羧基端排列，例如按以下顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。
如本文所用，术语“互补决定区”(cdr；例如cdr1、cdr2和cdr3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在对于抗原结合是必需的。每个可变结构域通常具有三个cdr区，标识为cdr1、cdr2和cdr3。每个互补决定区可包含来自kabat定义的“互补决定区”的氨基酸残基(例如关于轻链可变结构域的残基23-34(l-cdr1)、50-56(l-cdr2)和89-97(l-cdr3)以及重链可变结构域的残基31-35(h-cdr1)、50-65(h-cdr2)和95-102(h-cdr3))；(kabat等人,sequencesofproteinsofimmulologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如关于轻链可变结构域的残基26-32(l-cdr1)、50-52(l-cdr2)和91-96(l-cdr3)以及重链可变结构域的残基26-32(h-cdr1)、53-55(h-cdr2)和96-101(h-cdr3)(chothiaandlesk；jmolbiol196:901-917(1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自根据kabat定义的cdr区和高变环的氨基酸。
根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分为不同的“类别”。完整抗体有五种主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些可以进一步分为“亚类”(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。用于本发明的一类优选的免疫球蛋白是igg。
对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别称为[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，抗体是常规已知的抗体及其功能性片段。
“抗-抗原”抗体是指与抗原特异性结合的抗体。例如，抗pd-1抗体特异性结合pd-1，抗cecam6抗体特异性结合cecam6。
术语“特异性结合(specificbinding或bindspecifically)”是指与预定的抗原/靶分子结合的抗体或结合剂。抗体或结合剂的特异性结合通常描述了具有至少10-7m(以kd值表示；即优选kd值小于10-7m的那些)的亲和力的抗体或结合剂，其中该抗体或结合剂对预定的抗原/靶分子的亲和力比对不是预定的抗原/靶分子或密切相关的抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)的亲和力高至少两倍。抗体或结合剂的特异性结合不排除抗体或结合剂与多种抗原/靶分子(例如不同物种的直系同源物)的结合。抗体优选具有至少10-7m(以kd值表示；换句话说，优选kd值小于10-7m的那些)，优选至少10-8m，更优选在10-9m至10-11m范围内的亲和力。可例如通过表面等离子体共振光谱测定kd值。
“功能性片段”、“抗原结合抗体片段”或“抗体片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留与整个抗体结合的抗原特异性结合的能力。本发明的“功能性片段”、“抗原结合抗体片段”或“抗体片段”包括但不限于fab、fab'、fab'-sh、f(ab')2和fv片段；双体；单结构域抗体(dab)、线性抗体；单链抗体分子(scfv)；和由抗体片段形成的多特异性(例如双特异性和三特异性)抗体(c.a.kborrebaeck,editor(1995)antibodyengineering(breakthroughsinmolecularbiology),oxforduniversitypress；r.kontermann&s.duebel,editors(2001)antibodyengineering(springerlaboratorymanual),springerverlag)。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法来治疗患有疾病，或有感染或患有复发疾病风险的受试者。
受试者的“治疗(treatment)”或“疗法(therapy)”是指对受试者进行的任何类型的干预或过程，或向受试者给予活性剂，目的是逆转、减轻、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关的症状、并发症或病状或生化标记的发作、进展、发展、严重程度或复发。
如本文所用，“ceacam6”指“癌胚抗原相关细胞粘附分子6”，也称为“cd66c”(分化簇66c)或非特异性交叉反应抗原或nca或nca-50/90。ceacam6是糖基磷脂酰肌醇(gpi)连接的细胞表面蛋白，其参与细胞间粘附。本文所用的术语“ceacam6”包括人ceacam6(hceacam6)，hceacam6的变体、同种型和物种同系物，以及与hceacam6具有至少一个共同表位的类似物。人ceacam6的参考序列可从uniprotkb/swiss-prot数据库获得，登录号为p40199.3
“程序性死亡1(pd-1)”是指属于cd28家族的免疫抑制受体。pd-1主要在体内先前活化的t细胞上表达，并与两个配体pd-l1和pd-l2结合。本文所用的术语“pd-1”包括人pd-1(hpd-1)，hpd-1的变体、同种型和物种同系物，以及与hpd-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hpd-1序列可在genbank登录号u64863下找到。
“程序性死亡配体-1(pd-l1)”是pd-1的两个细胞表面糖蛋白配体之一(另一个为pd-l2)，其在与pd-1结合时下调t细胞活化和细胞因子分泌。本文所用的术语“pd-l1”包括人pd-l1(hpdl1)，hpd-l1的变体、同种型和物种同系物，以及与hpd-l1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hpd-l1序列可在genbank登录号q9nzq7下找到。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如牛、马、犬、绵羊或猫。优选地，患者是人类。
具体实施方式
出人意料地，观察到pd-1或pd-l1免疫检查点抑制剂和抗cecam6抗体tpp-3310的组合在进行的评估药物组合对肿瘤消退的治疗潜力的体外试验中的作用是大于加和作用的。
因此，本发明提供了至少两种组分(组分a和组分b)的组合，组分a是抗ceacam6抗体tpp-3310，组分b是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体，抗pd-1抗体优选纳武单抗或派姆单抗，抗pd-l1抗体优选阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。
如本文所述和定义的，包含至少两种组分a和b的组合也称为“本发明的组合”。
此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含：
-以下的组合：
-组分a，其是抗ceacam6抗体tpp-3310；
-组分b，其是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体，抗pd-1抗体优选纳武单抗或派姆单抗，抗pd-l1抗体优选阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗，和任选地
-一种或多种药物制剂c；
其中任选地，所述组分a和b之一或两者为同时、同时、分别或顺序给药的即用型药物制剂的形式。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体(组分a)，其用于与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合治疗癌症，其中抗ceacam6抗体包含抗体tpp-3310的h-cdr1、h-cdr2、h-cdr3、l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体(组分a)，其用于与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合治疗癌症，其中抗ceacam6抗体包含抗体tpp-3310的可变重链序列和可变轻链序列。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体(组分a)，其用于与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合治疗癌症，其中抗ceacam6抗体包含抗体tpp-3310的重链区和轻链区。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)，其用于与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合治疗癌症，其中抗pd-1抗体是纳武单抗或派姆单抗，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)，其用于与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合治疗癌症，其中癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌、卵巢癌、间皮瘤、胰腺癌、胃癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌或食道癌。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)，其用于与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合治疗癌症，其中将抗ceacam6抗体、抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体中的至少一种与一种或多种药物制剂(制剂c)同时、分别或顺序结合给药。
本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合给予有需要的患者。
本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合给予有需要的患者，其中抗pd-1抗体是纳武单抗或派姆单抗，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
本发明进一步提供了抗ceacam6抗体tpp-3310(组分a)与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体(组分b)同时、分别或顺序结合用于制备用于治疗癌症的药物的用途，其中抗pd-1抗体是纳武单抗或派姆单抗，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗、阿维单抗或德瓦鲁单抗。这些组分可以通过口服、静脉内、局部、局部装置、腹膜内或鼻腔途径彼此独立给药。
根据另一方面，本发明涵盖了如上所述的用于治疗或预防癌症的组合。
根据另一方面，本发明涵盖了如上所述的此类组合用于制备用于治疗或预防癌症的药物的用途。
组合的组分a
组分a是在wo2016/150899a2中公开的抗ceacam6抗体tpp-3310。wo2016150899a2中公开的其他抗cecam6抗体为例如tpp-3714、tpp-3820、tpp-3821、tpp-3707和tpp-3705。这些抗体是与人ceacam6以高亲和力结合的人或人源化抗体，与猴ceacam6交叉反应，不与任何旁系同源物(paralog)(特别是ceacam1、ceacam3和ceacam5)结合，并且能够缓解ceacam6介导的免疫抑制。
术语“抗ceacam6抗体”涉及特异性结合癌症靶分子ceacam6的抗体，优选具有足以用于诊断和/或治疗应用的亲和力的抗体。在某些实施方案中，抗ceacam6抗体与在不同物种之间保守的表位结合。
tpp-3310是包含含有seqidno:12的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:13的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:14的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:16的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:17的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:18的氨基酸序列的l-cdr3的抗体。
优选地，tpp-3310是包含seqidno:11的可变重链序列(vh)和seqidno:15的可变轻链序列(vl)的抗体。
高度优选地，tpp-3310是包含seqidno:19的重链区(hc)和seqidno:20的轻链区(lc)的抗体。
组合的组分b
组分b是抗体或其抗原结合部分，其特异性地结合程序性死亡-1(pd-1)受体，并抑制pd-1活性(“抗pd-1抗体”)；或是抗体或其抗原结合部分，其特异性地结合程序性死亡配体-1(pd-l1)，并抑制pd-l1活性(“抗pd-l1抗体”)。
抗pd-1抗体
在某些实施方案中，抗pd-1抗体或其抗原结合部分是纳武单抗或具有与纳武单抗相同的cdr区。纳武单抗(商品名“opdivo”；以前命名为5c4、bms-936558、mdx-1106或ono-4538)是一种全人igg4(s228p)pd-1免疫检查点抑制剂抗体，其选择性地阻止与pd-1配体(pd-l1和pd-l2)相互作用，从而阻断抗肿瘤t细胞功能的下调(美国专利号8,008,449)。在另一个实施方案中，抗pd-1抗体或其片段与纳武单抗交叉竞争。
tpp-2596是使用纳武单抗的可变结构域克隆的抗pd-1人igg4(s228p)抗体。
在其他实施方案中，抗pd-1抗体或其抗原结合部分是派姆单抗或具有与派姆单抗相同的cdr区。派姆单抗(商品名“keytruda”，也称为兰伯丽珠单抗(lambrolizumab)和mk-3475)是针对人细胞表面受体pd-1的人源化单克隆igg4抗体。例如，在美国专利号8,900,587中描述了派姆单抗。
在其他实施方案中，抗pd-1抗体或其抗原结合部分是medi0608(以前为amp-514)或具有与medi0608相同的cdr区。medi0608是针对pd-1受体的单克隆抗体。例如在美国专利号8,609,089,b2中描述了medi0608。
在其他实施方案中，抗pd-1抗体或其抗原结合部分是bgb-a317或具有与bgb-a317相同的cdr区。bgb-a317是在美国公布号2015/0079109中描述的人源化单克隆抗体。
在某些实施方案中，抗pd-1抗体包含：
(i)含有seqidno:2的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:3的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:4的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:6的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:7的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:8的氨基酸序列的l-cdr3，或
(ii)含有seqidno:32的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:33的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:34的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:36的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:37的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:38的氨基酸序列的l-cdr3。
在某些实施方案中，抗pd-1抗体包含：
(i)seqidno:1的可变重链序列(vh)和seqidno:5的可变轻链序列(vl)，或
(ii)seqidno:31的可变重链序列(vh)和seqidno:35的可变轻链序列(vl)。
在某些实施方案中，抗pd-1抗体包含：
(i)seqidno:9的重链区(hc)和seqidno:10的轻链区(lc)，或
(ii)seqidno:39的重链区(hc)和seqidno:40的轻链区(lc)。
抗-pd-l1抗体
在某些实施方案中，抗pd-l1抗体或其抗原结合部分是阿特珠单抗或具有与阿特珠单抗相同的cdr区。在美国专利号8,217,149中描述了阿特珠单抗(商品名“tecentriq”)，也称为mpdl3280a、rg7446)。
tpp-3615是使用阿特珠单抗的可变结构域克隆的抗pd-l1huigg2抗体。
在其他实施方案中，抗pd-l1抗体或其抗原结合部分是阿维单抗或具有与阿维单抗相同的cdr区。在美国2014/0341917中描述了阿维单抗(商品名“bavencio”)，也称为msb0010718c。
在其他实施方案中，抗pd-l1抗体或其抗原结合部分是德瓦鲁单抗或具有与德瓦鲁单抗相同的cdr区。在美国专利号8,779,108或美国2014/0356353中描述了德瓦鲁单抗(商品名“imfinzi”)，也称为medi4736)。
在其他实施方案中，抗pd-l1抗体或其抗原结合部分是bms-936559或具有与bms-936559相同的cdr区。bms-936559(以前为12a4或mdx-1105)是靶向pd-1配体pd-l1的全人igg4单克隆抗体，并在美国专利号7,943,743或wo2013/173223中描述。
在某些实施方案中，抗pd-l1抗体包含：
(iii)含有seqidno:42的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:43的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:44的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:46的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:47的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:48的氨基酸序列的l-cdr3，或
(iv)含有seqidno:52的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:53的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:54的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:56的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:57的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:58的氨基酸序列的l-cdr3，或
(v)含有seqidno:62的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:63的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:64的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:66的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:67的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:68的氨基酸序列的l-cdr3，或
(vi)含有seqidno:22的氨基酸序列的h-cdr1、含有seqidno:23的氨基酸序列的h-cdr2、含有seqidno:24的氨基酸序列的h-cdr3、含有seqidno:26的氨基酸序列的l-cdr1、含有seqidno:27的氨基酸序列的l-cdr2和含有seqidno:28的氨基酸序列的l-cdr3。
在某些实施方案中，抗pd-l1抗体包含：
(iii)seqidno:41的可变重链序列(vh)和seqidno:45的可变轻链序列(vl)，或
(iv)seqidno:51的可变重链序列(vh)和seqidno:55的可变轻链序列(vl)，或
(v)seqidno:61的可变重链序列(vh)和seqidno:65的可变轻链序列(vl)，或
(vi)seqidno:21的可变重链序列(vh)和seqidno:25的可变轻链序列(vl)。
在某些实施方案中，抗pd-l1抗体包含：
(iii)seqidno:49的重链区(hc)和seqidno:50的轻链区(lc)，或
(iv)seqidno:59的重链区(hc)和seqidno:60的轻链区(lc)，或
(v)seqidno:69的重链区(hc)和seqidno:70的轻链区(lc)，或
(vi)seqidno:29的重链区(hc)和seqidno:30的轻链区(lc)。
生产抗体
结合靶分子的抗体或抗原结合抗体片段可以通过本领域普通技术人员使用已知方法(例如化学合成或重组表达)制备。癌症靶分子的结合剂可商购获得或可通过本领域普通技术人员使用已知方法(例如化学合成或重组表达)制备。在wo2007/070538(参见第22页“抗体”)中描述了用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其他方法。本领域技术人员已知如何编制例如噬菌体展示库(例如morphosyshucalgold)，并用于发现抗体或抗原结合抗体片段的过程(参见wo2007/070538第24页及其后页和第70页的ak实施例1、第72页的ak实施例2)。例如在第26页(wo2007/070538)中描述了使用b细胞的dna库制备抗体的其他方法。在wo2007070538的第30-32页描述了，并在queen等人,pros.natl.acad.sci.usa8610029-10033,1989或wo90/0786中详细描述了用于人源化抗体的方法。此外，本领域技术人员通常已知蛋白质的重组表达的方法，并特别已知抗体的重组表达的方法(参见例如bergerandkimmel(guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology,第152卷,academicpress,inc.)；sambrook等人,(molecularcloningalaboratorymanual,(第2版,coldspringharborlaboratorypress；coldspringharbor,n.y.；1989)第1-3卷)；currentprotocolsinmolecularbiology,(f.m.ausabel等人[eds.],currentprotocols,greenpublishingassociates,inc./johnwiley&sons,inc.)；harlow等人,(monoclonalantibodiesalaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(19881,paul[ed.])；fundamentalimmunology,(lippincottwilliams&wilkins(1998))；和harlow等人,(usingantibodiesalaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1998)))。本领域技术人员已知相应的载体、启动子和信号肽，这是蛋白质/抗体表达所必需的。在wo2007/070538的第41-45页中还描述了普通方法。例如，在wo2007/070538第74页及其后页的实施例6中描述了用于制备igg1抗体的方法。技术人员已知，并且例如在wo2007/070538的第80页中描述了允许在抗体与其抗原结合后确定抗体的内化的方法。本领域技术人员能够使用wo2007/070538中所描述的方法，所述方法已用于制备碳酸酐酶ix(mn)抗体，类似于用于制备具有不同靶分子特异性的抗体。
细菌表达
本领域技术人员了解借助于细菌表达可产生抗体、其抗原结合片段或其变体的方式。
通过插入dna序列以及合适的翻译起始和翻译终止信号和功能性启动子构建用于所需蛋白质的细菌表达的合适的表达载体，所述dna序列编码功能性阅读框内的所需蛋白质。载体包含一个或多个表型可选标记和复制起点，以便能够保留载体，并且如果需要，则宿主内使其扩增。用于转化的合适原核宿主包括但不限于大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)和来自假单胞菌属(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)和葡萄球菌属(staphylococcus)的各种物种。细菌载体可基于例如噬菌体、质粒或噬菌粒。这些载体可含有可选标记和细菌复制起点，其衍生自可商购质粒。许多可商购质粒通常含有众所周知的克隆载体pbr322(atcc37017)的元件。在细菌系统中，可以基于待表达蛋白质的预期用途来选择许多有利的表达载体。
在转化合适的宿主菌株并使宿主菌株生长为适当的细胞密度后，通过合适的方法(例如，温度变化或化学诱导)对所选择的启动子进行去启动(de-reprimed)/诱导，并且培养细胞额外的时间。通常通过离心收集细胞，并且如果需要，以物理方式或化学方法消化，并保留所得的原始提取物用于进一步纯化。
哺乳动物细胞表达
本领域技术人员了解借助于哺乳动物细胞表达可产生抗体、其抗原结合片段或其变体的方式。
优选的哺乳动物细胞宿主中表达的调控序列包括导致哺乳动物细胞中高表达的病毒元件，例如衍生自以下的启动子和/或表达扩增子：巨细胞病毒(cmv)(如cmv启动子/增强子)、猿猴病毒40(sv40)(例如sv40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(admlp))和多瘤病毒。抗体的表达可以是组成型或调节型(例如，通过添加或去除与tet系统结合的小分子诱导物(例如四环素)诱导)。
为了进一步描述病毒调控元件及其序列，参考例如stinski的美国5,168,062、bell等人的美国4,510,245和schaffner等人的美国4,968,615。重组表达载体同样可以包括复制起点和可选标记(参见例如美国4,399,216、4,634,665和美国5,179,017)。当载体被引入到细胞时，合适的可选标记包括赋予对物质(例如g418、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素、博莱霉素(zeocin/bleomycin)或甲氨蝶呤)抗性的基因或导致宿主细胞的营养缺陷型的可选标记，例如谷氨酰胺合成酶(bebbington等人,biotechnology(ny).1992feb；10(2):169-75)。
例如，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，neo基因赋予对g418的抗性，土曲霉(aspergillusterreus)的bsd基因赋予对杀稻瘟菌素的抗性，嘌呤霉素n-乙酰转移酶赋予对嘌呤霉素的抗性，shble基因产物赋予对博莱霉素的抗性，大肠杆菌潮霉素抗性基因(hyg或hph)赋予对潮霉素的抗性。可选标记(例如dhfr或谷氨酰胺合成酶)也有助于与mtx和msx结合使用的扩增技术。
可以借助标准技术将表达载体转染到宿主细胞中，所述标准技术包括电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、脂质转染、基于聚阳离子的转染例如基于聚乙烯亚胺(pei)的转染和deae-葡聚糖转染。
用于表达抗体、其抗原结合片段或其变体的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，例如cho-k1、cho-s、cho-k1sv[包括dhfr-cho细胞，在urlaubandchasin,(1980)proc.natl.acad.sci.usa77:4216-4220和urlaub等人,cell.1983jun；33(2):405-12中描述，与dhfr-可选标记一起使用，如r.j.kaufmanandp.a.sharp(1982)mol.biol.159:601-621中所述，和其他敲除细胞，如fan等人,biotechnolbioeng.2012apr；109(4):1007-15中详述)、ns0骨髓瘤细胞、cos细胞、hek293细胞、hkb11细胞、bhk21细胞、cap细胞、eb66细胞和sp2细胞。
在表达系统中，也可以瞬态或半稳定的方式影响抗体、其抗原结合片段或其变体的表达，所述表达系统为例如hek293、hek293t、hek293-ebna、hek293e、hek293-6e、hek293freestyle、hkb11、expi293f、293ebnalt75、chofreestyle、cho-s、cho-k1、cho-k1sv、choebnalt85、chos-xe、cho-3e7或cap-t细胞(例如durocher等人,nucleicacidsres.2002jan15；30(2):e9)。
在一些实施方案中，以这样的方式构建表达载体，使得要表达的蛋白质被分泌到生长宿主细胞的细胞培养基中。可以借助本领域技术人员已知的蛋白质纯化方法从细胞培养基中获得抗体、其抗原结合片段或其变体。
纯化
抗体、其抗原结合片段或其变体可以借助众所周知的方法从重组细胞培养物中获得和纯化，其实例包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白a色谱法、蛋白g色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法(hic)、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法(“hplc”)同样可以用于纯化。参见例如colligan,currentprotocolsinimmunology，或currentprotocolsinproteinscience,johnwiley&sons,ny,n.y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章。
本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化的产物、来自化学合成方法的产物以及借助于重组技术在原核或真核宿主细胞中产生的产物。真核宿主包括例如酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。根据为重组表达选择的宿主细胞，表达的蛋白质可以糖基化或非糖基化形式。
在一个优选的实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95重量％的程度，例如通过lowry方法，通过uv-可见光谱或通过sds毛细管凝胶电泳(例如用caliperlabchipgxii、gx90或bioradbioanalyzer仪器)测量，在更优选的实施方案中，超过99重量％，(2)至适合于确定n端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至均质性，借助于考马斯蓝或优选银染色，在还原或非还原条件下通过sds-page测定。
通常，借助于至少一个蛋白质纯化步骤获得分离的抗体。
表1：优选抗体的蛋白质序列
表2：优选抗体的序列
治疗癌症的方法
在本发明的上下文中，术语“癌症”包括但不限于乳腺癌、肺癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、肝癌、眼癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远处转移。那些疾病还包括多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肉瘤和白血病。
乳腺癌的实例包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位导管癌和原位小叶癌。
呼吸道癌症的实例包括但不限于肺癌，特别是小细胞和非小细胞肺癌，以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。
脑癌的实例包括但不限于脑干和垂体胶质瘤、小脑和脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层和松果体肿瘤。
男性生殖器官的肿瘤包括但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器官的肿瘤包括但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。
消化道肿瘤包括但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。
泌尿道肿瘤包括但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌、尿道癌和人乳头状肾癌。
眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。
肝癌的实例包括但不限于肝细胞癌(具有或不具有纤维板层(fibrolamellar)变体的肝细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)和混合性肝细胞胆管癌。
皮肤癌包括但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤，特别是恶性黑色素瘤、默克尔细胞皮肤癌和非黑色素瘤皮肤癌。
头颈癌包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌以及鳞状细胞癌。
淋巴瘤包括但不限于艾滋病相关淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤。
肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。
白血病包括但不限于急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病和毛细胞白血病。
本发明涉及使用本发明的组合治疗或预防癌症的方法，所述癌症特别是(但不限于)结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、淋巴瘤、白血病等。组合可用于在治疗或预防癌症中抑制、阻断、减少、降低(等等)细胞增殖和/或细胞分裂，和/或诱导细胞凋亡，所述癌症特别是(但不限于)结肠直肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、淋巴瘤、白血病等。该方法包括对有需要的哺乳动物(包括人)给予一定量的本发明的组合或其药学上可接受的的盐、异构体、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物或酯；等等，其对治疗或预防癌症是有效的，所述癌症特别是(但不限于)结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、淋巴瘤、白血病等。
本文所述的术语“治疗(treating或treatment)”通常用于例如管理或护理受试者，以用于对抗、减轻、减少、缓解、改善疾病或障碍(例如癌)的病况等的目的。
在优选的实施方案中，癌症是肺癌，特别是非小细胞肺癌(nsclc)、卵巢癌、间皮瘤、胰腺癌或胃癌、结肠直肠癌、头颈癌、膀胱癌、胆管癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌。
剂量和给药
基于已知的评估可用于治疗或预防癌症的化合物的标准实验室技术，所述癌症特别是(但不限于)结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、头颈癌、肝癌、脑癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、淋巴瘤、白血病等，通过标准毒性测试和标准药理学试验确定对哺乳动物中上述鉴定的病况的治疗，并通过将这些结果与用于治疗这些病况的已知药物的结果进行比较，可以容易地确定本发明组合的有效剂量以用于适应症的治疗。根据这样的考虑如特定的组合和使用的剂量单位，给药方式，治疗时间，被治疗患者的年龄、体重和性别，以及被治疗病况的性质和程度，在治疗该病况中给予的活性成分的量可以在很大范围内变化。
待给予的活性成分的总量通常将为每天约0.001mg/kg体重至约200mg/kg体重，并且优选每天约0.01mg/kg体重至约30mg/kg体重。临床上有用的给药时间表从每天给药一到三次到每四周给药一次。此外，“药物假期”，在某段时间内不对患者给药，可能有益于药理作用和耐受性之间的总体平衡。单位剂量可包含约0.5mg至约2,500mg的活性成分，并且可以每天一次或多次或每天少于一次给药。注射(包括静脉内、肌肉、皮下和肠胃外注射)给药的平均剂量和使用输注技术给药的平均剂量优选为0.01至200mg/kg总体重。
当然，针对每个患者的具体初始和连续给药方案将根据以下因素不同：主治诊断医生确定的病况的性质和严重程度，所采用的特定组合的活性，患者的年龄、体重和一般情况，给药时间，给药途径，药物排泄速率，药物组合等。本发明的组合或其药学上可接受的盐或酯或组合物的期望的治疗方式和剂量数可以由本领域技术人员使用常规的治疗测试来确定。
使用如上所述的组分a、如上所述的组分b和组分c：一种或多种其他药物制剂的组合的疗法。
本发明的组分a和组分b的组合可以作为唯一的药物制剂或与一种或多种其他药物制剂结合给药，其中所得的组分a、b和c的组合不会引起不可接受的不良作用。例如，本发明的组分a和b的组合可以与组分c(即一种或多种其他药物制剂)组合，所述药物制剂例如为已知的抗血管生成、抗增生过多、抗炎、镇痛、免疫调节、利尿、抗心律不齐、抗高胆固醇血症、抗血脂异常、抗糖尿病或抗病毒制剂等，以及其混合物和组合。
组分c可为一种或多种药物制剂，如131i-chtnt、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、阿达木单抗(adalimumab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumabemtansine)、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿来替尼(alectinib)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿仑膦酸(alendronicacid)、阿利维a酸(alitretinoin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、氨基乙酰丙酸己酯(hexylaminolevulinate)、氨柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安西司亭(ancestim)、anetholedithiolethione、anetumabravtansine、血管紧张素ii(angiotensinii)、抗凝血酶iii(antithrombiniii)、阿瑞匹坦(aprepitant)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿加来必(arglabin)、三氧化二砷(arsenictrioxide)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿西替尼(axitinib)、阿扎胞苷(azacitidine)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝洛替康(belotecan)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝索单抗(besilesomab)、贝利司他(belinostat)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博莱霉素(bleomycin)、博纳吐单抗(blinatumomab)、硼替佐米(bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、伯舒替尼(bosutinib)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、白消安(busulfan)、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、降钙素(calcitonine)、亚叶酸钙(calciumfolinate)、左亚叶酸钙(calciumlevofolinate)、卡培他滨(capecitabine)、卡罗单抗(capromab)、卡马西平(carbamazepine)、卡铂(carboplatin)、卡波醌(carboquone)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡妥索单抗(catumaxomab)、塞来昔布(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、色瑞替尼(ceritinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮(chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、西多福韦(cidofovir)、西那卡塞(cinacalcet)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯膦酸(clodronicacid)、氯法拉滨(clofarabine)、考比替尼(cobimetinib)、库潘尼西(copanlisib)、克立他酶(crisantaspase)、克唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素d(dactinomycin)、达雷木单抗(daratumumab)、阿法达贝泊汀(darbepoetinalfa)、达拉菲尼(dabrafenib)、达沙替尼(dasatinib)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素(denileukindiftitox)、地诺单抗(denosumab)、地普奥肽(depreotide)、地洛瑞林(deslorelin)、二去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)、右丙亚胺(dexrazoxane)、二溴螺氯铵(dibrospidiumchloride)、卫康醇(dianhydrogalactitol)、双氯酚酸(diclofenac)、达妥昔单抗(dinutuximab)、多西他赛(docetaxel)、多拉司琼(dolasetron)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素(doxorubicin)+雌酮(estrone)、屈大麻酚(dronabinol)、依库丽单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依利醋铵(elliptiniumacetate)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾曲波帕(eltrombopag)、内皮抑素(endostatin)、依诺他滨(enocitabine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、表柔比星(epirubicin)、环硫雄醇(epitiostanol)、依泊汀α(epoetinalfa)、依泊汀β(epoetinbeta)、依泊汀ζ(epoetinzeta)、依铂(eptaplatin)、艾日布林(eribulin)、厄洛替尼(erlotinib)、埃索美美拉唑(esomeprazole)、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、炔雌醇(ethinylestradiol)、依托泊苷(etoposide)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法倔唑(fadrozole)、芬太尼(fentanyl)、非格司亭(filgrastim)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、亚叶酸(folinicacid)、福美司坦(formestane)、福沙匹坦(fosaprepitant)、福莫司汀(fotemustine)、氟维司群(fulvestrant)、钆布醇(gadobutrol)、钆特醇(gadoteridol)、钆特酸葡甲胺(gadotericacidmeglumine)、钆弗塞胺(gadoversetamide)、钆塞酸(gadoxeticacid)、硝酸镓(galliumnitrate)、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、谷卡匹酶(glucarpidase)、氧化型谷胱甘肽(glutoxim)、gm-csf、戈舍瑞林(goserelin)、格拉司琼(granisetron)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor)、组胺二盐酸盐(histaminedihydrochloride)、组氨瑞林(histrelin)、羟基脲(hydroxycarbamide)、i-125粒子(i-125seed)、兰索拉唑(lansoprazole)、伊班膦酸(ibandronicacid)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、咪喹莫特(imiquimod)、英丙舒凡(improsulfan)、吲地司琼(indisetron)、英卡膦酸(incadronicacid)、巨大戟醇甲基丁烯酸酯(ingenolmebutate)、干扰素α(interferonalfa)、干扰素β(interferonbeta)、干扰素γ(interferongamma)、碘比醇(iobitridol)、碘苄胍(iobenguane)(123i)、碘美普尔(iomeprol)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、伊曲康唑(itraconazole)、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊沙佐米(ixazomib)、兰瑞肽(lanreotide)、兰索拉唑(lansoprazole)、拉帕替尼(lapatinib)、iasocholine、来那度胺(lenalidomide)、乐伐替尼(lenvatinib)、来格司亭(lenograstim)、香菇多糖(lentinan)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、左炔诺孕酮(levonorgestrel)、左甲状腺素钠(levothyroxinesodium)、麦角乙脲(lisuride)、洛铂(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、马索罗酚(masoprocol)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美拉胂醇(melarsoprol)、美法仑(melphalan)、美雄烷(mepitiostane)、巯嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、美沙酮(methadone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、氨基乙酰丙酸甲酯(methylaminolevulinate)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、甲基睾酮(methyltestosterone)、甲酪氨酸(metirosine)、米伐木肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、米铂(miriplatin)、二溴甘露醇(mitobronitol)、丙脒腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、莫拉司亭(molgramostim)、莫哌达醇(mopidamol)、盐酸吗啡(morphinehydrochloride)、硫酸吗啡(morphinesulfate)、大麻隆(nabilone)、nabiximols、那法瑞林(nafarelin)、纳洛酮(naloxone)+喷他佐辛(pentazocine)、纳曲酮(naltrexone)、那托司亭(nartograstim)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、奈达铂(nedaplatin)、奈拉滨(nelarabine)、奈立膦酸(neridronicacid)、奈妥吡坦(netupitant)/帕洛诺司琼(palonosetron)、纳武单抗(nivolumab)、喷曲肽(pentetreotide)、尼洛替尼(nilotinib)、尼鲁米特(nilutamide)、尼莫唑(nimorazole)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、尼达尼布(nintedanib)、硝氨吖啶(nitracrine)、纳武单抗(nivolumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥曲肽(octreotide)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉帕尼(olaparib)、奥拉木单抗(olaratumab)、高三尖杉酯碱(omacetaxinemepesuccinate)、奥美拉唑(omeprazole)、昂丹司琼(ondansetron)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥古蛋白(orgotein)、orilotimod、奥希替尼(osimertinib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、羟考酮(oxycodone)、羟甲烯龙(oxymetholone)、奥佐米星(ozogamicine)、p53基因疗法(p53genetherapy)、紫杉醇(paclitaxel)、帕博西尼(palbociclib)、帕利夫明(palifermin)、钯-103粒子(palladium-103seed)、帕洛诺司琼(palonosetron)、帕米膦酸(pamidronicacid)、帕尼单抗(panitumumab)、帕比司他(panobinostat)、泮托拉唑(pantoprazole)、帕唑帕尼(pazopanib)、培门冬酶(pegaspargase)、peg-依泊汀β(peg-epoetinbeta)(甲氧基peg-依泊汀β(methoxypeg-epoetinbeta))、派姆单抗(pembrolizumab)、培非格司亭(pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素α-2b(peginterferonalfa-2b)、派姆单抗(pembrolizumab)、培美曲塞(pemetrexed)、喷他佐辛(pentazocine)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、全氟丁烷(perflubutane)、培磷酰胺(perfosfamide)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、溶链菌(picibanil)、匹鲁卡品(pilocarpine)、吡柔比星(pirarubicin)、匹杉琼(pixantrone)、普乐沙福(plerixafor)、普卡霉素(plicamycin)、聚氨葡糖(poliglusam)、聚磷酸雌二醇(polyestradiolphosphate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)+透明质酸钠(sodiumhyaluronate)、多聚糖k(polysaccharide-k)、泊马度胺(pomalidomide)、帕纳替尼(ponatinib)、卟吩姆钠(porfimersodium)、普拉曲沙(pralatrexate)、泼尼莫司汀(prednimustine)、强的松(prednisone)、甲基苄肼(procarbazine)、丙考达唑(procodazole)、普萘洛尔(propranolol)、喹高利特(quinagolide)、雷贝拉唑(rabeprazole)、雷妥莫单抗(racotumomab)、镭-223氯化物(radium-223chloride)、雷多替尼(radotinib)、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司琼(ramosetron)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷莫司汀(ranimustine)、拉布立酶(rasburicase)、丙亚胺(razoxane)、瑞法替尼(refametinib)、瑞格非尼(regorafenib)、利塞膦酸(risedronicacid)、铼-186依替膦酸(rhenium-186etidronate)、利妥昔单抗(rituximab)、罗拉吡坦(rolapitant)、罗米地辛(romidepsin)、罗米司亭(romiplostim)、罗莫肽(romurtide)、roniciclib、芦卡帕尼(rucaparib)、钐(153sm)来昔决南(samarium(153sm)lexidronam)、沙格司亭(sargramostim)、沙妥莫单抗(satumomab)、促胰液素(secretin)、司妥昔单抗(siltuximab)、西普鲁塞-t(sipuleucel-t)、西佐喃(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、甘氨双唑钠(sodiumglycididazole)、索尼德吉(sonidegib)、索拉非尼(sorafenib)、司坦唑醇(stanozolol)、链脲佐菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、、溶瘤病毒(talimogenelaherparepvec)、他米巴罗汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他喷他多(tapentadol)、他索纳明(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、锝(99mtc)巯诺莫单抗(technetium(99mtc)nofetumomabmerpentan)、99mtc-hynic-[tyr3]-奥曲肽(99mtc-hynic-[tyr3]-octreotide)、替加氟(tegafur)、替加氟(tegafur)+吉莫斯特(gimeracil)+奥替拉西(oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、替西罗莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙利度胺(thalidomide)、塞替派(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、促甲状腺素α(thyrotropinalfa)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、托珠单抗(tocilizumab)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲贝替定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲马多(tramadol)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-美坦新(trastuzumabemtansine)、苏消安(treosulfan)、维甲酸(tretinoin)、曲氟尿苷(trifluridine)+替比嘧啶(tipiracil)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲美替尼(trametinib)、曲洛磷胺(trofosfamide)、促血小板生成素(thrombopoietin)、色氨酸(tryptophan)、乌苯美司(ubenimex)、瓦他拉尼(valatinib)、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、维罗非尼(vemurafenib)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)、维莫德吉(vismodegib)、伏立诺他(vorinostat)、伏氯唑(vorozole)、钇-90玻璃微珠(yttrium-90glassmicrospheres)、净司他丁(zinostatin)、净司他丁苯马聚合物(zinostatinstimalamer)、唑来膦酸(zoledronicacid)、佐柔比星(zorubicin)。
通常，将组分c与本发明的组分a和b的组合结合使用将有助于：
(1)与单独给予任一种制剂相比，在减少肿瘤生长甚至消除肿瘤方面产生更好的功效，
(2)提供给予较少量的被给予的化疗制剂，
(3)提供患者耐受性良好的化学疗法治疗，其有害的药理学并发症比用单一制剂化学疗法和某些其他结合疗法所观察到的少，
(4)提供治疗哺乳动物，特别是人类更广谱的不同癌症类型，
(5)在被治疗的患者中提供更高的应答率，
(6)与标准化学疗法治疗相比，在被治疗患者中提供更长的生存时间，
(7)为肿瘤进展提供更长的时间，和/或
(8)与其他癌症制剂组合产生拮抗作用的已知情况相比，产生至少与单独使用制剂的结果一样好的功效和耐受性结果。
以下实施例描述了本发明的可行性，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例
tpp-3310针对人ceacam6的抗体与针对pd-l1或pd-1的抗体的组合治疗对pd-1阳性病毒肽特异性t细胞活化的作用
由于ceacam6不在啮齿动物(不在啮齿动物直系同源物)中表达，因此不可能进行体内功效研究，并且不能进行临床前体内组合研究来评估药物组合的治疗潜力。
或者，建立体外细胞试验系统以测试针对ceacam6和pd-1或pd-l1的抗体的组合的体外功效和治疗潜力。
在该细胞试验系统中，将pd-1阳性flum1病毒肽特异性t细胞用作效应子t细胞。在针对ceacam6、pd-1或pd-l1的检查点抑制抗体(作为单一制剂或其组合)的存在下，将它们与pd-l1和ceacam6阳性以及负载有flum1肽的癌细胞hcc2935共培养24小时-48小时。测量促炎细胞因子(ifng)的诱导，作为功效的读数。
抗体
使用的抗体是tpp-3310(抗ceacam6)，其是针对在癌细胞和骨髓细胞上过表达的免疫检查点分子ceacam6的huigg2抗体；tpp-3615，其是使用阿特珠单抗的可变结构域克隆的抗pd-l1huigg2抗体；和tpp-2596，其是使用纳武单抗的可变结构域克隆的抗pd-1人igg4(s228p)抗体。已将tpp-1238(huigg2)和tpp1240(huigg4)用作同型对照抗体。
细胞系和培养
在rpmi-1640、10％fcs、5％co2中培养hcc2935癌细胞(atcc-crl-2869，肺腺癌)。通过facs分析确认ceacam6和pd-l1表达。对于与病毒肽特异性t细胞的共培养试验，用0.2μg/ml或按指示的病毒flum1肽脉冲癌细胞。
flum1病毒肽特异性t细胞的产生和细胞培养
pd-1表达病毒(流感)肽特异性t细胞由来自hla-a*0201+健康供体的初始pbmc产生，所述健康供体是通过血沉棕黄层(buffycoat)的ficoll密度离心获得的(deutschesroteskreuz,mannheim)。根据制造商的协议，用macs阴性选择试剂盒(miltenyi,130-096-495)富集cd8+t细胞。辐射(35gy)cd8阴性细胞，并在37℃下，在x-vivo-20培养基(化学定义的无血清造血细胞培养基，lonza，#be04-448q)中用1μg/ml的流感hla-a*0201表位gilgfvftl(proimmune)脉冲cd8阴性细胞1.5小时，然后洗涤。用经辐射的t2细胞再刺激细胞，并在第7天用1μg/ml的其相关gilgfvftl肽脉冲细胞。在第14天，将等分试样冷冻。将样品解冻并立即洗涤，然后将其用于功能性试验。在第14天的共培养实验之前，用四聚体(f391-4a-e，proimmune)染色和facs分析确认了病毒肽特异性t细胞的适用性。
体外试验：分析组合抗体在t细胞和癌细胞共培养中的功效
对于共培养，将癌细胞用pbs-edta非酶促地分离5-15分钟，以1,400rpm离心5分钟，洗涤并计数。将癌细胞在x-vivo-20(lonza,#be04-448q)中稀释为1x105细胞/ml，在冰上用tpp-3310、apd-l1和/或同型对照抗体预处理10分钟。孵育后，将10,000个靶癌细胞一式三份接种到96孔elisau板中。
对病毒肽特异性t细胞进行收集，用x-vivo-20洗涤，在x-vivo-20中稀释为2x105细胞/ml，并在冰上用抗pd-1或同型对照抗体预处理10分钟。所有抗体均以30μg/ml的最终浓度应用。对于结合治疗，大约以其半最大有效浓度(ec50)1μg/ml应用tpp-3310，以确保其他抗体对t细胞活化的作用。将预处理的t细胞以20,000细胞/孔接种到靶癌细胞上。
将癌细胞和效应子t细胞与抗体的共培养物在37℃，5％co2下孵育大约20小时。
然后收集上清液，并将共培养板以1400rpm离心3分钟。按照制造商的说明，通过elisa(人ifn-γ-elisa装置，bd，#555142)测量上清液中的ifn-γ水平。用tecaninfinitem200酶标仪测量elisa板的光密度。
使用microsoftexcel2010和graphpadprism6，用配对或不配对的双尾学生t检验对数据进行统计分析。p<0.05的结果被认为是显著的。通过标准曲线计算细胞因子浓度。通过将tpp-3310或给定的组合的值除以各自的同型对照的值来计算因子或比率。
结果
在实验前，将负载有flum1肽的hcc2935癌细胞与flum1病毒肽特异性t细胞共孵育。仅在同源病毒肽的存在下，t细胞的ifn-γ分泌增加。这种增加是剂量依赖性的。在抗ceacam6抗体tpp-3310、抗pd-l1抗体tpp-3615的存在下或在抗pd-1抗体tpp-2596的存在下，共培养物中的ifn-γ分泌(p<0.05至0.0001)进一步增强。全部作为单一制剂给药。这些数据证实，由pd-1阳性flum1病毒肽特异性t细胞和负载有肽的hcc2935癌细胞组成的新建立的细胞试验系统适用于在基准点(benchmarking)和组合实验中测试抗ceacam6、抗pd-1和抗pd-l1抗体的功效。
表3：在含有或不含有针对ceacam6、pd-1或pd-l1的免疫检查点阻断抗体的负载有病毒肽的hcc2935癌细胞的共培养实验中，通过ifng分泌测量的病毒肽特异性t细胞活化的肽特异性。
说明表:用经连续稀释的病毒肽脉冲的hcc2935肺癌细胞(hcc)刺激病毒肽特异性t细胞(tc)。加入30μg/ml的抗体。通过elisa确定分泌的ifn-γ的浓度。数据是ifn-γ的绝对量，以pg/ml为单位。tpp-3310，aceacam6；tpp-3615，apd-l1；tpp-2596，apd1；tpp-1238，tpp-3310和tpp3615、apd-1的同型对照；tpp-1240，tpp-2596的同型对照。
在7个独立的共培养实验(n＝7)中，总体上确定了抗ceacam6抗体tpp-3310与针对pd-l1的抗体的组合的作用。在抗体的存在下，我们一致发现，当以单一制剂或结合给药时，ifng分泌(绝对平均值)增加。在pd-l1抗体的存在下，总ifng增加39.6pg/ml，在抗ceacam6抗体tpp-3310的存在下增加196.6pg/ml，结合给药时增加279.9pg/ml。该结果表明，pd-l1抗体与ceacam6抗体组合时，ifng分泌进一步增强，并且对ifng分泌的作用是是大于加和作用的。
表4：在抗ceacam6和抗pd-l1抗体(作为单一制剂或组合)的存在下，flum1病毒肽特异性t细胞和负载有flum1肽的hcc2935细胞的共培养实验(n＝7)中的总ifng分泌
说明表：用0.2μg/ml的flum1肽脉冲hcc2935肺癌细胞(hcc)，以刺激共培养物中的病毒肽特异性t细胞(tc)。应用30μg/ml的抗体。对于组合治疗(n＝7)，添加1μg/ml的tpp-3310。通过elisa确定分泌的ifn-γ的浓度，数据是同型校正值，以pg/ml表示。tpp-3310，aceacam6；tpp-3615，apd-l1；平均值的t检验，p值(<0.05)：apd-l1相对于ceacam6，p＝0.0439；apd-l1相对于组合，p＝0.001；aceacam6相对于组合，p＝0.16
在另一项研究中，我们在总共7个独立的共培养实验(n＝7)中确定了抗ceacam6抗体tpp-3310与针对pd-1的抗体的组合的作用。在抗体的存在下，我们一致发现，当以单一制剂或结合给药时，ifng分泌(绝对平均值)增加。
在pd-1抗体的存在下，平均总ifng增加76.1pg/ml，在抗ceacam6抗体tpp-3310的存在下增加166.8pg/ml，当结合给药时增加317.9pg/ml。该结果表明，pd-1抗体与ceacma6抗体组合时，ifng分泌进一步增强，并且对ifng分泌的作用是大于加和作用的。
表5：在抗ceacam6和抗pd-1抗体(作为单一制剂或组合)的存在下，flum1病毒肽特异性t细胞和负载有flum1肽的hcc2935细胞的共培养实验(n＝7)中的总ifng分泌
说明表：用0.2μg/ml的flum1肽脉冲hcc2935肺癌细胞(hcc)，以刺激共培养物中的病毒肽特异性t细胞(tc)。应用30μg/ml的抗体。对于组合治疗(n＝7)，添加1μg/ml的tpp-3310。通过elisa确定分泌的ifn-γ的浓度，数据是同型校正值，以pg/ml表示。tpp-3310，aceacam6；tpp-2596，apd-1。
平均值的t检验，p值(<0.05)：apd-1相对于ceacam6，p＝0.13；apd-l1相对于组合，p＝0.0034；aceacam6相对于组合，p＝0.0011
序列表
<110>bayerag
<120>用于治疗癌症的药物组合
<130>bhc181044
<160>70
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>1
glnvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglyarg
151015
serleuargleuaspcyslysalaserglyilethrpheserasnser
202530
glymethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
alavaliletrptyraspglyserlysargtyrtyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleuphe
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalser
100105110
ser
<210>2
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>2
asnserglymethis
15
<210>3
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>3
valiletrptyraspglyserlysargtyrtyralaaspservallys
151015
gly
<210>4
<211>4
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>4
asnaspasptyr
1
<210>5
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>5
gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly
151015
gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr
202530
leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile
354045
tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro
65707580
gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserserasntrpproarg
859095
thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys
100105
<210>6
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>6
argalaserglnservalsersertyrleuala
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<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
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aspalaserasnargalathr
15
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<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
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<213>人工序列
<220>
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<220>
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202530
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151015
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gly
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151015
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<212>prt
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<220>
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<400>29
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
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202530
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225230235240
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245250255
gluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluval
260265270
glnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthr
275280285
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290295300
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420425430
asnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly
435440445
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<212>prt
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<220>
<223>抗体序列
<400>30
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserthrala
202530
valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
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tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly
505560
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65707580
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100105110
proservalpheilepheproproseraspgluglnleulyssergly
115120125
thralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarggluala
130135140
lysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasnsergln
145150155160
gluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrserleuser
165170175
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180185190
alacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthrlysser
195200205
pheasnargglyglucys
210
<210>31
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
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glnvalglnleuvalglnserglyvalgluvallyslysproglyala
151015
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202530
tyrmettyrtrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
354045
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505560
lysasnargvalthrleuthrthraspserserthrthrthralatyr
65707580
metgluleulysserleuglnpheaspaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargargasptyrargpheaspmetglypheasptyrtrpglygln
100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>32
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>32
asntyrtyrmettyr
15
<210>33
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>33
glyileasnproserasnglyglythrasnpheasnglulysphelys
151015
asn
<210>34
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>34
argasptyrargpheaspmetglypheasptyr
1510
<210>35
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>35
gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly
151015
gluargalathrleusercysargalaserlysglyvalserthrser
202530
glytyrsertyrleuhistrptyrglnglnlysproglyglnalapro
354045
argleuleuiletyrleualasertyrleugluserglyvalproala
505560
argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser
65707580
serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglnhisserarg
859095
aspleuproleuthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys
100105110
<210>36
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>36
argalaserlysglyvalserthrserglytyrsertyrleuhis
151015
<210>37
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>37
leualasertyrleugluser
15
<210>38
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>38
glnhisserargaspleuproleuthr
15
<210>39
<211>447
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>抗体序列
<400>39
glnvalglnleuvalglnserglyvalgluvallyslysproglyala
151015
servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr
202530
tyrmettyrtrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet
354045
glyglyileasnproserasnglyglythrasnpheasnglulysphe
505560
lysasnargvalthrleuthrthraspserserthrthrthralatyr
65707580
metgluleulysserleuglnpheaspaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaargargasptyrargpheaspmetglypheasptyrtrpglygln
100105110
glythrthrvalthrvalserseralaserthrlysglyproserval
115120125
pheproleualaprocysserargserthrsergluserthralaala
130135140
leuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalser
145150155160
trpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalaval
165170175
leuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalpro
180185190
serserserleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislys
195200205
proserasnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglypro
210215220
procysproprocysproalaproglupheleuglyglyproserval
225230235240
pheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthr
245250255
progluvalthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspproglu
260265270
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serserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislysval
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