一种产生抗体的新方法

一种产生抗体的新方法
发明领域
1.本公开总体上涉及生产抗体的新方法，特别是体外生产全人抗体的方法。
2.背景介绍
3.抗体制备方法已被广泛用于实验室和临床。这些方法包括杂交瘤技术，转基因动物模型和体外免疫。传统的杂交瘤技术是一项主流的成熟技术，包括对动物进行免疫、分离淋巴细胞、将淋巴细胞与永生化细胞(如骨髓瘤)融合、进行抗体人源化和亲和力成熟。可以高通量生产抗体，但是它不得不面对诸多缺点，包括成本高、生产周期长、亲和力低、对重链和轻链的可变区不可预测等问题。转基因动物模型是一种相对较新的技术，其对动物进行了基因修饰以通过未知的机制表达人类抗体可变区。近年来，文献提出了不需要对动物进行免疫的体外免疫技术的概念，其制作过程成本低，操作更快更容易，并且抗体可以是完全人源的，而无需人源化的步骤。然而，使用这种方法成功产生抗体的报道却很少。因此，需要继续开发新的有效的体外免疫技以产生全人抗体。


技术实现要素：

4.本公开提供了一种产生与目的抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：
5.在培养基中混合所述抗原、抗体产生细胞组合物(agc)以及增强抗体产生组合物以形成混合物，
6.培养所述混合物，
7.从所述混合物中获得抗体，
8.其中所述agc包含至少一种b细胞和至少一种其他类型的源自外周血单核细胞(pbmc)的细胞，并且所述抗体增强组合物包含一种或多种脂肪组织衍生的分泌蛋白(adsp)。
9.在某些实施方案中，其中所述抗体增强组合物还包含il2和/或il21。
10.在某些实施方案中，其中所述脂肪组织衍生的分泌蛋白包含一种或多种细胞因子和/或一种或多种细胞粘附分子。
11.在某些实施方案中，其中所述细胞因子包含一种或多种白介素。在某些实施方案中，白介素选自il1β、il1f9、il10、il27、il33、il18bp、il4、il3、il5、il6、il7、il13、il14和il15。在某些实施方案中，白介素选自il1β、il1f9、il10、il27、il33、il18bp。
12.在某些实施方案中，其中所述趋化因子包含一种或多种选自ccl4，ccl8，ccl6，ccl9和ccl11的cc趋化因子。在某些实施方案中，趋化因子包含一种或多种选自cxcl2、cxcl5、cxcl16、cxcl9和cxcl13的cxc趋化因子。
13.在某些实施方案中，其中所述细胞因子选自il
‑
1β，ccl8和cxcl5。在某些实施方案中，细胞因子包含il
‑
1β和ccl8。在某些实施方案中，细胞因子包含ccl8和cxcl5。在某些实施方案中，细胞因子包括il
‑
1β、ccl8和cxcl5。
14.在某些实施方案中，细胞粘附分子选自icam1、csf3r、itgam、siglecf、adam8、chl、
sirpa、nrcam、emilin2、emilin1、tubb6和/或parvb。
15.在某些实施方案中，adsp源衍生自脂肪组织。
16.在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种t卵泡辅助细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞、至少一种t滤泡辅助细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc还包含至少一种脂肪细胞。
17.在某些实施例中，agc包含pbmc。在某些实施方案中，pbmc分离自血液样品，所述血液样品源自人造血干细胞(hsc)、衍生自诱导多能干细胞(ipsc)或源自脐带血。
18.在某些实施方案中，其中所述抗体增强组合物还包含共刺激物、toll样受体(tlr)激动剂、cpg寡脱氧核苷酸(cpg odn)、抗凋亡蛋白、tnf、干扰素(inf)、脂质、avasimid、efnb1、ephb4、从蛋白b2、轴突导向蛋白4c、blimp
‑
1、irf4或其任何组合。
19.在某些实施方案中，共刺激物包含cd40、cd40l、icosl、icos、april、tnf家族的b细胞活化因子(baff)、ox40和/或ox40l。
20.在某些实施例中，cpg odn包括cpg2006和/或d/k cpg。
21.在某些实施方案中，抗凋亡蛋白包括bcl
‑
2、bcl
‑
6、bcl
‑
xl、bcl
‑
w、mcl
‑
1和/或其类似物。
22.在某些实施方案中，tlr激动剂包括tlr1激动剂、tlr2激动剂、tlr3激动剂、tlr4激动剂、tlr5激动剂、tlr6激动剂、tlr7激动剂、tlr8激动剂、tlr7/8激动剂和/或tlr9激动剂。
23.在某些实施方案中，所述方法进一步包括从混合物中分离抗体。在某些实施方案中，所述方法进一步包括获得编码抗体的可变区核酸序列。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在适合于表达抗体或其抗原结合片段的条件下将核酸序列引入宿主细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步包括评估抗体是否特异性结合目的抗原。
24.在某些实施方案中，adsp以至少1ng/ml、10ng/ml或50ng/ml的浓度存在。在某些实施方案中，il2以至少10ng/ml的浓度存在。在某些实施方案中，il21以至少50ng/ml的浓度存在。
25.在某些实施方案中，adsp存在至少1天。在某些实施方案中，il2存在至少1天。在某些实施方案中，il21存在至少1天。
26.本公开在本文中还提供了一种诱导抗体产生细胞组合物(agc)增殖、b细胞活化和分化、b细胞成熟和/或促进agc中类别转换以产生igg的方法，所述方法包括在包含il2、脂肪组织衍生的分泌蛋白和/或il21的培养基中培养所述agc。在某些实施例中，所述agc包括pbmc。在某些实施方案中，目的抗原存在于培养基中。
27.在某些实施方案中，产生的抗体是完全人单克隆抗体。
28.本文还提供了一种产生与目的抗原特异性结合的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：
29.在培养基中混合所述抗原，抗体产生细胞组合物(agc)和抗体增强组合物以形成混合物，
30.培养所述混合物，
31.从所述混合物中获得抗体，
32.其中所述agc包含至少一种b细胞和至少一种其他类型的源自外周血单核细胞
(pbmc)的细胞，并且所述抗体增强组合物包含il2、il21和一种或多种脂肪组织衍生的分泌蛋白(adsps)。
33.在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括从混合物中获得编码抗体的可变区核酸分子。在适合于表达抗体或其抗原结合片段的条件下，任意将核酸分子引入宿主细胞。在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括分离宿主细胞分泌的抗原特异性抗体或其抗原结合片段。
34.本公开在本文中还提供了一种组合物，包含分离的抗体产生细胞组合物(agc)，所述组合物包含至少一种b细胞和至少一种衍生自外周血单核细胞(pbmc)的其他类型的细胞，所述抗体增强组合物，以及一种媒介。在某些实施方案中，其中所述组合物还包含目的抗原。在某些实施方案中，其中所述抗体增强组合物还包含il2和/或il21。在某些实施方案中，其中所述agc包含至少一种b细胞和至少一种t滤泡辅助细胞。在某些实施方案中，其中所述agc包括至少一种b细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞，至少一种t滤泡辅助细胞和至少一种树突细胞。在某些实施例中，agc包括pbmc。
35.在某些实施方案中，agc还包含至少一种脂肪细胞。
36.在某些实施方案中，抗体增强组合物包含一种或多种选自adsp、cd40l、icosl、icos、tlr激动剂及其任何组合的抗体增强因子。
37.本文的公开提供了一种鉴定体外免疫抗体增强因子的方法，包括：
38.a)从来源于经目的抗原免疫的动物淋巴结细胞中分离总rna；
39.b)将步骤a)中分离的总rna的rna水平与未免疫的对照动物的rna水平进行比较，以确定编码蛋白质且表达水平上调的基因；
40.c)在包含所述目的抗原、il2、il21和相关蛋白质的培养基中培养pbmc；
41.d)如果所述蛋白质增强了抗体的产生，则将所述蛋白质鉴定为用于体外免疫的抗体增强因子。
42.在某些实施方案中，细胞是脂肪细胞、t滤泡辅助细胞、b细胞或树突细胞。
43.在某些实施方案中，蛋白质由脂肪细胞、t滤泡辅助细胞、b细胞或树突细胞表达。
44.一方面，本公开提供了一种产生嵌合抗原受体(car)的方法，所述方法包括表达可操作地连接至第二核酸的第一核酸，其中所述第一核酸编码衍生自根据本文提供的方法产生的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域，且其中第二核酸编码t细胞信号传导结构域。
45.一个方面，本公开提供了一种在受试者中治疗癌症的方法，其中所述方法包括：在t细胞中表达可操作地连接至第二核酸的第一核酸，其中所述第一核酸编码衍生自根据本文提供的方法产生的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域，且其中第二核酸编码t细胞信号传导结构域；然后将所述t细胞施用于受试者。在某些实施方案中，其中所述t细胞获自所述受试者。
附图说明
46.图1说明了免疫后浸润到淋巴结中的脂肪细胞中上调基因的rna
‑
seq分析。
47.图2显示了il
‑
1β在刺激抗体产生中的作用。
48.图3显示了ccl8在刺激抗体产生中的作用。
49.图4显示了cxcl5在刺激抗体产生中的作用。
50.图5显示了cxcl13、ccl4、il27、cxcl16和cxcl2在刺激抗体产生中的作用。
51.图6显示了用il
‑
1β增加了抗体产生的特异性而不损害生产效率。图6a和图6b分别显示了在存在或不存在ova的情况下抗ova igg和igm抗体的产生水平。图6c显示了在存在或不存在ova的情况下非特异性抗bsa igg抗体的生产水平。
52.图7显示了在有或没有ova免疫的情况下，小鼠中adspsil
‑
1β、ccl8、cxcl5和il36的表达水平。
具体实施方式
53.本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各种实施例。这样，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等同，改变和修改，并且应当理解，这样的等同实施例将被包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物，专利和专利申请，均通过引用全文并入本文。
54.定义
55.如本文所用，术语“抗体”包括与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白，单克隆抗体，多克隆抗体，多价抗体，多特异性抗体或双特异性(二价)抗体或其功能部分。天然完整抗体包含通过二硫键相互连接的两条重链(h)和两条轻链(l)。每条重链由可变区(vh)和第一，第二和第三恒定区(分别为ch1，ch2和ch3)组成，而每条轻链由可变区(vl)和恒定区(cl)组成。哺乳动物重链分类为α，δ，ε，γ和μ，哺乳动物轻链分类为λ或κ。轻链和重链的可变区负责抗原结合。通常将两条链中的可变区细分为三个高变区，称为互补决定区(cdr)(轻链(l)cdr，包括lcdr1，lcdr2和lcdr3；重链(h)cdr，包括hcdr1，hcdr2，hcdr3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的cdr边界可以通过以下约定来定义或鉴定，这些约定包括kabat,chothia,or al
‑
lazikani(al
‑
lazikani,b.,chothia,c.,lesk,a.m.,j.mol.biol.,273(4),927(1997)；chothia,c.等,j mol biol.dec 5；186(3):651
‑
63(1985)；chothia,c.and lesk,a.m.,j.mol.biol.,196,901(1987)；chothia,c.等,nature.dec 21
‑
28；342(6252):877
‑
83(1989)；kabat e.a.等,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。这三个cdr插入了称为框架区(frs)的侧翼序列之间，它们比cdr保守性更高，并形成了支持高变环的支架。因此，每个vh和vl依次包括三个cdr和四个fr(氨基酸残基n端至c端)：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但是表现出各种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分为五个主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，其特征在于存在α、δ、ε、γ和μ个重链。几种主要抗体类别的亚类包括igg1(γ1重链)、igg2(γ2重链)、igg3(γ3重链)、igg4(γ4重链)、iga1(α1重链)或iga2(α2重链)。
56.如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能的变体抗体之外，包括该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。含有天然突变或在单克隆抗体制备过程中产生的突变体，此类变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明
使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法。
57.如本文所用，关于抗体或抗原结合片段，术语“完全人抗体”是指该抗体或抗原结合片段具有对应于该抗体的氨基酸序列或由其组成的氨基酸序列由人或人免疫细胞产生的产物，或衍生自非人来源，例如利用人抗体库或其他人抗体编码序列的转基因非人动物。在某些实施方案中，完全人抗体不包含衍生自非人抗体的氨基酸残基(特别是抗原结合残基)。
[0058]“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(hvr)(例如互补决定区(cdr))中具有一个或多个氨基酸残基的改变或取代的抗体，与没有这种改变或替换的亲本抗体相比，这种改变或替换提高了抗体对抗原的亲和力。
[0059]
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个cdr的抗体片段形成的片段，或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其他抗体部分。在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗原结合片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv片段、二硫键稳定的fv片段(dsfv)、(dsfv)2、双特异性抗体dsfv(dsfv
‑
dsfv')、二硫键稳定的双价抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scfv)、scfv二聚体(二价双价抗体)、多特异性抗体、驼单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、分离的cdr和二价域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体结合的相同抗原结合。在某些实施方案中，其中所述抗原结合片段可以包含来自特定人抗体的一个或多个cdr。
[0060]
如本文所用，“抗原”或“ag”是指可以刺激抗体产生的化合物、组合物、肽、多肽、蛋白质、rna、dna、细菌病毒或任何免疫原性物质、或细胞培养物中或动物体内的t细胞反应、包括添加到细胞培养物中的组合物(例如杂交瘤)、或注入或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定的体液或细胞免疫产物(例如抗体)发生反应，包括异源抗原诱导的反应。
[0061]
关于抗体的“fab”是指抗体的单价抗原结合片段，其由单链轻链(可变区和恒定区)通过二硫键与单链重莲的可变区以及第一段恒定区结合组成。fab可以通过木瓜蛋白酶消化抗体铰链区的重链之间的二硫键n
‑
末端残基的来获得。
[0062]“fab'”是指包括一部分铰链区的fab片段，其可以通过胃蛋白酶消化抗体重链之间的二硫键的c末端残基而获得。因此，在铰链区中的少量残基(包括一个或多个半胱氨酸)与fab不同。
[0063]“f(ab')
2”是指fab'的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。
[0064]
关于抗体的“fc”是指由第一重链的第二和第三恒定区通过二硫键结合第二重链的第二和第三恒定区组成的抗体部分。igg和igm fc区包含三个重链恒定区(每条链中的第二、第三和第四重链恒定区)。它可以通过木瓜蛋白酶消化抗体来获得。抗体的fc部分负责各种效应功能，例如adcc和cdc，但在抗原结合中不起作用。
[0065]
关于抗体的“fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体最小片段。fv片段由单条重链可变区结合单条轻链可变区组成。“dsfv”是指二硫键稳定的fv片段，其中单个轻链的可变区和单个重链的可变区之间通过二硫键连接。
[0066]“单链fv抗体”或“scfv”是指轻链可变区和重链可变区直接或通过肽接头序列彼此连接组成的工程抗体(huston js等proc natl acad sci usa,85:5879(1988))。“scfv二聚体”是指包含两个重链可变区和两个轻链可变区以及连接子的单链。在某些实施方案中，
“
scfv二聚体”是二价双抗体或二价scfv(bsfv)，其包含与另一vh
‑
vl部分二聚的vh
‑
vl(通过肽接头连接)，使得一个部分的vh与另一个的vl配位。并形成两个结合位点，它们可以靶向相同的抗原(或肽)或不同的抗原(或肽)。在其他实施方案中，“scfv二聚体”是双特异性双价抗体，其包含与vl1
‑
vh2(也通过肽接头连接)缔合的vh1
‑
vl2(通过肽接头连接)，使得vh1和vl1配位且vh2和vl2配位且每个配对具有不同的抗原特异性。
[0067]“单链fv
‑
fc抗体”或“scfv
‑
fc”是指由与抗体fc区连接的scfv工程抗体。
[0068]“驼单结构域抗体”，“重链抗体”，“纳米抗体”或“hcab”是指包含两个vh结构域且无轻链的抗体(riechmann l.和muyldermans s.,j immunol methods.dec10；231(1
‑
2):25
‑
38(1999)；muyldermans s.,j biotechnol.jun；74(4):277
‑
302(2001)；wo94/04678；wo94/25591；u.s.patent no.6,005,079)。重链抗体最初来自骆驼科(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。尽管没有轻链，但驼抗体具有真实的抗原结合表位(hamers
‑
casterman c.等,nature.jun 3；363(6428):446
‑
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‑
chain antibodies in camelidae；a case of evolutionary innovation,”immunogenetics.apr；54(1):39
‑
47(2002)；nguyen vk.等immunology.may；109(1):93
‑
101(2003))。重链抗体的可变域(vhh域)代表通过适应性免疫应答产生的最小的已知抗原结合单位(koch
‑
nolte f.等,faseb j.nov；21(13):3490
‑
8.epub 2007jun 15(2007))。“双抗体”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含与单个多肽链中的vl结构域相连的vh结构域(vh
‑
vl或vl
‑
vh)(see,e.g.,holliger p.等,proc natl acad sci u s a.jul 15；90(14):6444
‑
8(1993)；ep404097；wo93/11161)。由于接头太短，同一条链上的两个结构域不能配对，因此，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可以靶向不同抗原(或表位)的相同位点。
[0069]“域抗体”是指仅包含重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些实施方案中，两个或更多个vh结构域与肽接头共价连接以形成二价或多价结构域抗体。二价域抗体的两个vh域可以靶向相同或不同的抗原。
[0070]
在某些实施方案中，“(dsfv)
2”包含三个肽链：两个vh部分通过肽接头连接以及二硫键与两个vl部分结合。在两个数值之间具有高度相似性的情况下，本领域技术人员将不会视作或认为这两个数值之间存在显着差异，或者就数值所指示的统计和/或生物学活性而言，差异很小。相反，“基本上更低”是指作为参考值的函数的数值小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％。
[0071]
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子之间，例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方案中，本文提供的抗体或抗原结合片段以约0.01nm至约100nm、约0.1nm至约100nm、0.01nm至约10nm、约0.1nm至约10nm、约0.01nm至约5nm、约0.1nm至约5nm、约0.01nm至约1nm、约0.1nm至约1nm，或约0.01nm至约0.1nm的结合亲和力(kd)特异性结合人和/或非人抗原。如本文所用，k
d
是指解离速率与缔合速率的比率(k
off
/k
on
)，其可以使用表面等离振子共振方法来确定，例如使用诸如biacore的仪器来确定。
[0072]
本文所使用的病症的“处理”、“治疗”或“疗法”可以互换使用，并且包括治疗性处理、预防或防御措施，例如预防或减轻病症、减慢病情发作或发展速度、降低患病的风险、预防或延缓与疾病有关症状的发展、减轻或结束与疾病有关的症状、使疾病完全或部分消退、
治愈疾病或某种组合症状。
[0073]
如本文所用，术语“载体”是指将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入和运输进的媒介，以便在宿主细胞中表达该蛋白质。载体可用于转化，转导或转染宿主细胞，以使其表达在宿主细胞内携带的遗传元件。载体的示例性类型包括但不限于质粒(例如噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac))、病毒载体(噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体或动物病毒)、细菌载体或非流行的哺乳动物载体。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴侣病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头状病毒(例如sv40)。载体可包含多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体(例如细菌载体或游离型哺乳动物载体)可包含复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质衣壳。
[0074]
在本文中可以互换使用的“核酸”或“核酸序列”或“多聚核苷酸”是指脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的多核苷酸，其与参考核酸具有相似的结合特性，并且以与天然核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并的密码子取代可以通过生成序列来实现，其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见batzer等，nucleic acid res.19:5081(1991)；0htsuka等，j.biol.chem.260:2605
‑
2608(1985)；和rossolini等，mol.cell.probes 8:91
‑
98(1994))。
[0075]
如本文所用，术语“宿主细胞”是指已导入外源多核苷酸和/或载体以表达一种或多种外源蛋白的细胞。所述细胞指特定对象的细胞及其后代。宿主细胞可以是原核生物，真核生物，植物细胞，动物细胞或杂交瘤。所述细胞可以是不以所需水平表达蛋白质但包含其核酸的细胞，除非将调节剂引入细胞中或将调节序列引入宿主细胞中，从而使其与核酸可操作地连接。
[0076]
如本文所用，术语“动物”是指哺乳动物，例如人、骆驼科、小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。在某些实施方案中，所述动物是人。
[0077]“分离的”物质已经被人为地从自然状态改变了。如果自然界中出现了“隔离的”成分或物质，则说明它已被更改或从其原始环境中删除，或两者情况都发生了。例如，“分离的”多核苷酸或多肽是分别不含其他多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽，并且与天然状态下的多核苷酸或多肽所伴随的天然成分无关。在某些实施方案中，通过电泳方法(例如使用考马斯蓝或银染色的sds
‑
page，等电聚焦，毛细管电泳)、色谱法(例如离子交换色谱或反相hplc)或lowry方法测定，“分离的”蛋白质通过至少一步纯化至至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的纯度。
[0078]
活化诱导的胞苷脱氨酶，也称为aicda和aid，是一种24kda的酶，其在人中由aicda基因编码。atp是胞苷脱氨酶家族的成员，其参与b细胞中免疫球蛋白基因的体细胞超突变和类别转换重组，并且被认为是二级抗体多样化的主要调节因子。aid诱导dna突变，将胞嘧啶变成尿嘧啶(在dna复制过程中被识别为胸腺嘧啶)，在b淋巴细胞的生发中心发育过程中将c：g转换为t：a或a：t碱基对。在体细胞超突变期间，使抗体突变以产生具有各种亲和力的
抗体变体文库。
[0079]
pr结构域锌指蛋白1也被称为blimp
‑
1，它是prdm1基因在人类中编码的转录阻遏蛋白。blimp
‑
1与β
‑
干扰素(β
‑
ifn)基因启动子的prdi(正调控域i元件)特异性结合，并抑制β
‑
ifn的基因表达。b淋巴细胞、t淋巴细胞、nk细胞和其他免疫细胞中blimp
‑
1蛋白的增加，通过促使分泌抗体的浆细胞的增殖与分化，导致免疫反应。
[0080]
本公开内容提供了一种体外免疫，体外诱导体液应答的方法，即体外产生抗原特异性人抗体，这是由于在体外用抗原培养的天然人b淋巴细胞表面表达的免疫球蛋白对抗原的识别所致。
[0081]
在动物免疫中，生发中心(gcs)是淋巴结和脾脏中的重要部位，其中成熟的b细胞通过体细胞超突变增殖、分化和突变其抗体基因，以实现更高的亲和力，并在免疫反应期间将抗体类别从igm转换到igg。作为亲和力成熟的b细胞和持久性记忆b细胞产生的中心，gc在b细胞体液免疫反应中很重要。在gc中，b细胞在暗区(在这里被称为中心细胞)经历快速且突变的细胞分裂，并迁移到亮区(在这里被称为中心细胞)，在该处滤泡树突状细胞辅助它们被滤泡辅助t细胞选择。那些被选择的b细胞返回暗区以进一步进行分裂和突变。同时，少量的记忆b细胞和浆细胞离开了gc。
[0082]
与动物中的gc不同，在外周血单核细胞(pbmc)中，体外免疫方法能够在体外gc样b细胞中产生抗体。
[0083]
产生抗体的细胞组合物(agc)
[0084]
术语“抗体产生细胞组合物”或“agc”是指在抗体生产合适条件下产生目的抗原特异性抗体的一组细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种其他类型的细胞，其衍生自外周血单核细胞(pbmc)。在某些实施例中，agc包括pbmc。
[0085]
外周血单核细胞(pbmc)是具有圆形核的任何外周血细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。pbmc可以通过本领域的常规技术从全血中提取，例如使用ficoll进行密度梯度离心(一种可分离血液层的亲水性多糖)，将血液分离成顶层血浆，中间层pbmc以及底部的多形核细胞(如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞。pbmc的增殖可以通过本领域已知的方法在体外检测或确认，例如，通过mtt测定法(比色法)、ao/pi(a啶橙和碘化丙啶)染色或细胞计数。在某些实施方案中，pbmc是从全血样品中分离的。在某些实施方案中，pbmc衍生自人造血干细胞(hsc)，诱导性多能干细胞(ipsc)或脐带血。
[0086]
在某些实施方案中，agc是分离的细胞类混合物，其包括淋巴细胞(t细胞、b细胞、nk细胞)、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。
[0087]
在某些实施例中，agc包括pbmc。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞、至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)、至少一种树突细胞、至少一种nk细胞、至少一种单核细胞和至少一种脂肪细胞中的至少一种。
[0088]
例如，在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种t细胞(例如，t滤泡辅助细胞)。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞、至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞和至少一种nk细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种单核细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞、t细胞(例如t滤泡辅助细胞)和至少一种nk细胞。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞、
至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)、至少一种树突细胞和至少一种nk细胞。
[0089]
在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞和至少一种b细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞、至少一种b细胞和至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞、至少一种b细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞、至少一种b细胞、至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)和至少一种树突细胞。
[0090]
在某些实施方案中，b细胞、t滤泡辅助细胞、树突细胞和脂肪细胞中的至少一种是人细胞。在某些实施方案中，b细胞是人b细胞。在某些实施方案中，pbmc衍生自人pbmc。
[0091]
在某些实施方案中，pbmc是从人类供体分离的。在某些实施方案中，pbmc衍生自干细胞。
[0092]
如本文所用，术语“b细胞”是指b淋巴细胞，一种淋巴细胞亚型的白细胞。它们通过分泌抗体而在适应性免疫系统的体液免疫中起作用。b细胞也呈递抗原并分泌细胞因子。在哺乳动物中，b细胞在骨髓中成熟。b细胞在骨髓中成熟后，它们会通过血液迁移到次级淋巴器官(slo)，例如脾脏和淋巴结，在那里b细胞通过循环淋巴液不断接收抗原。与其他两类淋巴细胞(即t细胞和自然杀伤细胞)不同，b细胞在其细胞膜上表达b细胞受体(bcr)，从而使b细胞结合特定抗原，从而针对该抗原发起抗体反应。在这三个b细胞子集中，fo b细胞优先经历t细胞依赖性(td)激活，而边缘区(mz)b细胞和b1 b细胞优先经历t细胞非依赖性(ti)激活。ti抗原激活的b细胞在淋巴滤泡外扩散，但仍在slo中，可能经历免疫球蛋白类别转换，并分化成短寿命的浆细胞，产生早期的弱抗体，主要是igm类，同时还有一些长寿命不增殖的产抗体的浆细胞。b细胞活性增强是通过cd21活化介导的，cd21是一种表面受体，与表面蛋白cd19和cd81形成复合物(这三者合称为b细胞共受体复合物，即bcr)。当bcr结合标记有c3补体蛋白片段的抗原时，cd21结合c3片段，与结合的bcr共连接，并通过cd19和cd81传导信号以降低细胞的激活阈值。
[0093]
在某些实施方案中，b细胞是来自健康供体的pbmc中天然存在的那些b细胞。在某些实施方案中，b细胞是培养的b细胞，从干细胞分化的b细胞或从动物体内分离的b细胞。在某些实施方案中，b细胞是基因工程的b细胞，以产生非天然存在的抗体，例如双特异性抗体。
[0094]
术语“天然b淋巴细胞”是指从未遇到过可以通过其表面免疫球蛋白表达的互补位结合的抗原的b淋巴细胞(b细胞)。这些b细胞直接来自从未与抗原接触的受试者的外周血。因此，这些受试者将相对于所述抗原表现出血清阴性状态，即，它们将表现出对所述抗原具有特异性的血清抗体滴度不可检测。
[0095]
本文使用的术语“t细胞”是指源自胸腺并且主要参与细胞免疫的淋巴细胞。t细胞的实例包括cd4+t细胞(t辅助细胞，th细胞)、cd8+t细胞(细胞毒性t细胞，ctl)、记忆t细胞，调节性t细胞(treg细胞，例如活化的treg和未活化的treg)、凋亡性t细胞、幼稚t细胞或其他t细胞群体。
[0096]
在某些实施方案中，t细胞是来自健康供体的pbmc中天然存在的那些t细胞。在某些实施方案中，t细胞是培养的t细胞，从干细胞分化的t细胞或从动物分离的t细胞。在某些实施方案中，t细胞是基因工程t细胞。
[0097]“t辅助细胞”是通过释放t细胞细胞因子而参与适应性(即针对特定病原体定制
的)免疫系统的t细胞类型，从而抑制或调节免疫应答。t辅助细胞参与b细胞抗体类别的转换，细胞毒性t细胞的活化和生长，以及使吞噬细胞(例如巨噬细胞)的杀菌活性最大化。成熟的t辅助细胞是cd4阳性的，并通过细胞因子释放和细胞间相互作用(例如cd40(在apc上)和cd40l(在t卵泡辅助细胞上))。t辅助细胞可以发展为两种主要的亚型，th1和th2细胞。th1辅助细胞参与针对细胞内细菌和原生动物的细胞免疫系统，并被il
‑
12触发并释放ifn
‑
γ和il
‑
2。th1辅助细胞有助于增强巨噬细胞的杀伤力、cd8+t细胞的增殖、b细胞igg的产生以及ifn
‑
γ分泌cd4+t细胞。th2辅助细胞参与针对细胞外寄生虫的体液免疫系统，并被il
‑
4和il
‑
2触发并释放il
‑
4、il
‑
5、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
13和il
‑
25。th2辅助细胞可帮助嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、刺激b细胞增殖并产生抗体，以及分泌il
‑
4/il
‑
5的cd4+t细胞。t滤泡辅助细胞位于次级淋巴器官b细胞滤泡(如淋巴结、脾脏和peyer斑块)的外围，并通过b细胞滤泡归巢受体cxcr5的组成型表达来鉴定。tfh细胞通过cd40l的表达以及与它们的同源滤泡(fo b)b细胞发生交互作用和交叉信号传递时cd40l的表达以及il
‑
21和il
‑
4的分泌来触发生发中心的形成和维持。
[0098]
术语“抗原呈递细胞”或apc旨在表示表达一个或多个i类和ii类主要组织相容性复合体(mhc)分子(人类中i类和ii类hla分子)的细胞，以及能够将抗原呈递给对该抗原具有特异性的cd4+t和cd8+t淋巴细胞。作为抗原呈递细胞，可以特别提及树突状细胞(dc)、外周血单核细胞(pbmc)、单核细胞、巨噬细胞、b淋巴细胞、淋巴母细胞系以及通过表达i类和i类ii mhc分子，尤其是hla i和hla ii分子等基因修饰的人或动物细胞系。
[0099]
本文使用的术语“细胞毒性t细胞”、“t
‑
杀伤细胞”或“ctl”是可互换的，并且是指识别由癌细胞，病毒感染的细胞或其他方式损坏的细胞产生的特定抗原的t细胞类型。抗原被i类mhc带到细胞表面，在cd8的帮助下，tcr与细胞毒性t细胞上的tcr结合。因此，细胞毒性t细胞是cd8阳性的。
[0100]
记忆t细胞是先前已经经历(遭遇和响应)癌细胞，细菌或病毒抗原的t细胞的子集。记忆t细胞可以是cd4+和/或cd8+t细胞，或记忆细胞毒性t细胞。重新暴露于抗原后，长寿命的记忆t细胞可以介导更快速，更有效的次级反应。此记忆功能可以由cd4+和/或cd8+记忆t细胞提供。长效记忆t细胞不同于效应细胞，效应细胞的寿命很短，通常会在免疫应答后因激活诱导细胞死亡(aicd)而死亡。然而，在两种细胞类型之间，存在过渡形式，例如效应记忆细胞。像效应细胞一样，它们能够在整个身体中巡逻，并在抗原接触后发挥效应功能，并且它们可以增殖，并且比效应细胞寿命更长。
[0101]
本文使用的“调节性t细胞”或“tregs”是指调节免疫系统，维持对自身抗原的耐受性并防止自身免疫反应的t细胞亚群。treg具有免疫抑制作用，参与抑制自我反应性免疫反应。tregs是cd4，clta4，gitr，neuropilin
‑
1和cd25阳性。treg通过接触依赖性机制和细胞因子产生对活化的t细胞执行其抑制功能(fehervari,z.&sakaguchi,curr opin immunol 16,203
‑
8(2004))。tregs还通过与树突状细胞(dc)上的配体直接相互作用来调节免疫反应，例如ctla4与dc上的b7分子相互作用，从而诱导产生吲哚胺2,3
‑
二加氧酶(ido)(fallarino,f.等，nat immunol 4,1206
‑
12(2003))，和cd40l连接(serra,p.等，immunity19,877
‑
89(2003))。
[0102]
如本文所用，“自然杀伤(nk)细胞”是指淋巴细胞，其通常表达细胞表面标志物，但不表达cd3的cd16和/或ncam和/或cd56分子。nk细胞是指以纯化细胞群形式存在于哺乳动
物体内或体外的细胞。nk细胞是一种对先天免疫系统至关重要的细胞毒性淋巴细胞。nk细胞的作用类似于细胞毒性t细胞。
[0103]“树突细胞(dc)”是有效的抗原呈递细胞(apc)，其加工抗原物质并将其在细胞表面上呈递给t细胞。激活后，dc迁移至淋巴结，在淋巴结中它们与t细胞和b细胞相互作用，从而启动并塑造适应性免疫反应。人树突状细胞选择性表达cd83。dc具有多种表面受体，可用来识别各种病原体。此外，dc能够感知各种内源信使，例如细胞因子和趋化因子，以及免疫系统其他细胞上的表面分子。dc通过细胞内信号通路处理各种输入信号，从而触发各种分化程序。树突状细胞能够在体外和体内诱发原代t细胞反应。在体外，dc可装载各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(nestle,f.等，nat.med.,4:328
‑
332(1998))。也可以通过遗传手段转导dc细胞以表达这些肿瘤抗原。为达到免疫的目的，dc也可以直接融合到肿瘤细胞上(kugler,a.等，nat.med.,6:332
‑
336(2000))。
[0104]
在某些实施方案中，dc是来自健康供体pbmc中天然存在的dc。在某些实施方案中，dc是培养的dc，来自干细胞的分化的dc或从动物分离的dc。在某些实施方案中，t细胞是基因工程形式的dc。
[0105]
脂肪细胞是指脂粒细胞和脂肪细胞，是主要组成脂肪组织的细胞。免疫动物后，发现淋巴末梢脂肪细胞与淋巴结紧密结合，甚至浸润到淋巴结中。源自脂肪组织的分泌蛋白(adsp)是指能够增强本文提供的agc产生抗体，与淋巴结相关的脂肪组织内或由其分泌的蛋白。与不进行抗原免疫的动物或进行抗原免疫之前的同一动物相比，对动物进行抗原免疫后，如果其蛋白质水平或rna水平被上调至至少两倍，则可以识别出adsp。尽管adsp由脂肪细胞分泌，但它也可以由外周血单核细胞(pbmc)衍生的其他细胞类型产生和分泌，例如b细胞、t细胞(例如t滤泡辅助细胞)或树突状细胞。
[0106]
在某些实施方案中，脂肪细胞是培养的脂肪细胞、从干细胞分化的脂肪细胞或从动物分离的脂肪细胞。
[0107]
可以从受试者的全血中分离和/或重建至少一种类型的单核细胞，例如b细胞、t细胞(例如t卵泡辅助细胞)、树突细胞、nk细胞、单核细胞、造血干细胞(hsc)、骨髓、新生脐带血(因此称为脐带血单核细胞(cbmc))、羊水或多能干细胞(hpsc)、包括胚胎干细胞(esc)和诱导性多能干单元(ipsc))。在某些实施方案中，其中所述至少一种类型的单核细胞可以来自成人、青少年或儿童。
[0108]
造血干细胞(hsc)位于红色骨髓中，并在造血过程中产生各种类型的成熟血细胞，包括髓样细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红血球、树突状细胞和巨核细胞)或血小板)和淋巴样细胞(t细胞、b细胞和自然杀伤细胞)。骨髓是骨骼中的海绵状或松质半固体组织，由造血细胞(骨髓和淋巴谱系)、骨髓脂肪组织、间充质干细胞(msc)和支持性基质细胞组成。人类骨髓通常每天产生约5000亿个血细胞，这些血细胞通过髓腔内的可渗透脉管正弦波进入循环。淋巴样细胞在其他淋巴样器官(如胸腺)中成熟。
[0109]
脐带血包括许多免疫学上不成熟的新生儿脐带血单核细胞(ucbmc)，并且也被报道是造血干细胞的来源(参见gluckman e等，一例fanconi贫血患者的hla同源同胞脐血造血重建.n engl j med.1989oct 26；321(17):1174
‑
8.)。在体外，单核细胞和/或hsc可以与人多能干细胞(hpsc，包括人胚胎干细胞(esc)和诱导性多能干细胞(ipsc))区分，例如原始
的血内皮细胞前体、成熟的髓样细胞、红系和淋巴样谱系细胞(melinda k.hexum等，人多能干细胞造血干细胞的体内评价,human pluripotent stem cells,2011.pp 433
‑
447。羊水还含有单核细胞和具有造血活性的细胞(参见ditadi a等，人和小鼠羊水c
‑
kit+lin细胞显示造血活性,blood.2009apr 23；113(17):3953
‑
60)。
[0110]
本文提供的用于产生抗体或其抗原结合片段的细胞可以在多种培养基中培养。诸如ham's f10(sigma)、最小必需培养基(mem)(sigma)、rpmi
‑
1640(sigma)和dulbecco's modified eagle's培养基(dmem)(sigma)等市售培养基都适合培养产生抗体的细胞组合物(agc)。另外，ham等,meth.enz.58:44(1979),barnes等，anal.biochem.102:255(1980),u.s.pat.no.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；wo 90/03430；wo 87/00195；或u.s.pat.re.30,985所述的任何培养基都可以用作抗体产生细胞组合物(agc)的培养基。这些介质中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)、缓冲液(例如hepes))、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如gentamycintm药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度添加任何其他必要的补充剂。对于普通技术人员而言，培养条件，例如温度、ph等，是先前抗体生成细胞组合物(agc)使用的那些条件，是显而易见的。
[0111]
抗体增强组合物
[0112]
如本文所用，术语“抗体增强组合物”是指能够增强体外抗体产生系统中抗体产生量的因子集合。在体外免疫条件下，抗体增强组合物能够在产生抗体的pbmc中诱导pbmc的增殖、b细胞活化和分化、b细胞成熟、t细胞分化、抗体亲和力成熟、抗体多样性和/或促进类别转换以产生igg。在某些实施方案中，抗体增强组合物包含一种或多种抗体增强因子。
[0113]
在某些实施方案中，其中所述抗体增强组合物或抗体增强因子选自脂肪组织衍生的分泌蛋白(adsp)、与cd40和cd40l相互作用的化合物、icos
‑
和icos
‑
l
‑
相互作用化合物、tlr激动剂、ox40、ox40l、april(诱导增殖的配体)、baff、cr2、趋化因子(cxcl5、cxcl16、cxcl9、cxcl12(sdf
‑
1)、cxcl13、cxcl16)、flt
‑
3l、白介素(il1(α/β)、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il10、il13、il14、il15、il21、il27、il33、il1f9、il18bp)、sap(信号淋巴细胞活化分子[slam]相关蛋白)、葡萄球菌a株cowan 1颗粒(sac；经热灭活，福尔马林固定)、tlr配体(如脂多糖(lps))、不同的cpg odn或雷西莫德(r
‑
848)、tslp、肿瘤坏死因子(tnf)α、类型i干扰素(例如ifnα/β)、ii型干扰素(例如ifnγ)、脂质、avasimid、efnb1、ephb4(lu等人，science，2017，eaai9264)、从蛋白b2、轴突导向蛋白4c(hu等人，cellreports，2017，19，995
‑
1007)、blimp
‑
1、irf4、细胞粘附分子(icam1、csf3r、itgam、siglecf、adam8、chl1、sirpa、nrcam、emilin2、emilin1、tubb6和parvb)以及任何它们的组合。
[0114]
在某些实施方案中，抗体增强组合物或抗体增强因子选自脂肪组织衍生的分泌蛋白(adsp)、cd40l、icosl、icos、tlr激动剂及其任何组合。
[0115]
在某些实施方案中，脂肪组织衍生的分泌蛋白通过agc，在agc中的b细胞的活化和分化，和/或在agc中的b细胞的成熟来增强抗体产生。
[0116]
在某些实施方案中，被免疫动物中的adsp水平或其rna水平是比未免疫的对照动物或免疫前的同一动物高3
‑
、4
‑
、5
‑
、6
‑
、7
‑
、8
‑
、9
‑
、10
‑
、15
‑
、20
‑
、25
‑
、30
‑
、35
‑
、40
‑
、45
‑
或50倍。
[0117]
抗体增强因子旨在涵盖任何形式，例如，1)天然未加工的分子，“全长”分子链或分子的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体；2)在细胞中处理产生的任何形式；或3)全长片段(例如，截短形式、抗体增强结构域)；通过重组方法产生的修饰形式(例如突变形式、糖基化/peg化、his标签/免疫荧光融合形式)；或4)其他物种的同系物。
[0118]
在某些实施方案中，adsp包含能够增强抗体产生的细胞因子和细胞粘附分子。在某些实施方案中，adsp能够提高总抗体产生中的igg百分比。
[0119]
细胞因子是小蛋白在细胞信号传导中很重要，包括自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导作为免疫调节剂。细胞因子可由免疫细胞产生，例如巨噬细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素和肿瘤坏死因子(tnf)。
[0120]
干扰素(ifn)属于一类称为细胞因子的蛋白质，细胞因子是用于细胞之间通信以触发免疫系统的保护性防御系统的分子，有助于消除病原体。ifn是宿主细胞响应多种病原体(例如病毒、细菌、寄生虫以及肿瘤细胞)的存在而产生和释放的一组信号蛋白。干扰素还具有其他多种功能：它们可以激活免疫细胞，例如自然杀伤细胞和巨噬细胞。它们通过增加主要组织相容性复合体(mhc)抗原的表达来上调抗原呈递，从而增强宿主防御能力。ifn通常分为三类：i型ifn、ii型ifn和iii型ifn。
[0121]
肿瘤坏死因子(tnf)超家族是包含tnf同源结构域并形成三聚体的ii型跨膜蛋白的超家族。该超家族的成员可通过细胞外蛋白水解裂解而从细胞膜释放，并起细胞因子的作用。这些蛋白质主要由免疫细胞表达，并调节多种细胞功能，包括调节免疫反应和炎症，还调节增殖、分化、凋亡和胚胎发生。
[0122]
白细胞介素(il)是一种细胞因子，其首先被白细胞表达，具有复杂的免疫调节功能，包括细胞增殖、成熟、迁移和粘附、免疫细胞分化和活化以及炎性和抗炎作用。少数成员充当辅助性t细胞的趋化因子，与趋化因子的作用平行。其他病毒则与细胞对病毒病原体的反应密切相关，使它们类似于ifn。il是对处理感染生理反应的非常重要的介质，并且也对多种疾病的病理生理起着重要的作用。
[0123]
在某些实施方案中，细胞因子是白介素。在某些实施方案中，白介素选自il1β、il1f9、il10、il27il33和il18bp。
[0124]
如本文所用，术语“il10”是指白介素10，一种抗炎细胞因子，也称为人细胞因子合成抑制因子(csif)。il10通过由两个il10受体1和两个il10受体2蛋白组成的受体复合物发出信号。人il10的示例性完整cdna序列的登录号为ay029171.1，而人il10的示例性氨基酸序列的登录号为aak38162.1。术语“il10”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，剪接变体和等位基因变体。
[0125]
如本文所用，术语“il1β”是指白介素
‑
1家族中的一种白介素
‑
1β，其是由单核细胞和巨噬细胞产生的单核因子，并且对应于炎性细胞因子。它是有效的促炎细胞因子。最初被发现是主要的内源热原，它诱导前列腺素合成，嗜中性粒细胞流入和活化，t细胞活化和细胞因子生成，b细胞活化和抗体生成以及成纤维细胞增殖和胶原蛋白生成。促进t细胞的th17分化。与il12/白介素12协同作用，诱导t辅助1(th1)细胞合成ifng(tominaga k.等，int.immunol.2000,12:151
‑
160)。人il1β的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc008678.1，人il1β的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah08678.1。术语“il1β”涵盖
其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0126]
如本文所用，术语“il1f9”是指白介素
‑
1家族成员9，也称为白介素36γ。它是白介素1细胞因子家族的成员。该细胞因子的活性通过白介素
‑
1受体样2(il1rl2/il1r
‑
rp2/il
‑
36受体)介导，并被白介素36受体拮抗剂(il36ra/il1f5/il1delta)特异性抑制。该细胞因子在角质形成细胞中的表达也可以通过多种病原相关分子模式(pamp)来诱导。人il1f9的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc096721.1，人il1f9的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah96721.1。术语“il1f9”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，剪接变体和等位基因变体。
[0127]
如本文所用，术语“il27”是指il
‑
12细胞因子家族的成员白介素27。il27具有促炎和抗炎特性，可调节t辅助细胞发育，抑制t细胞增殖，刺激细胞毒性t细胞活性，诱导b细胞同种型转换，并对先天免疫细胞具有多种作用。人il27的示例性完整cdna序列的登录号为bc062422.1，人il27的示例性氨基酸序列的登录号为aah62422.1的genbank。术语“il27”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0128]
如本文所用，术语“il33”是指il
‑
1家族的成员白介素33，其有效地驱动与t辅助2(th2)相关的细胞因子的产生。il33是st2(il1rl1)的配体，st2是在th2细胞，肥大细胞和第2组先天淋巴细胞上高表达的il
‑
1家族受体。人il33的示例性完整cdna序列的登录号为bc047085.1，人il33的示例性氨基酸序列的登录号为aah47085.1。术语“il33”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和等位基因变体。
[0129]
如本文所用，术语“il18bp”是指白介素
‑
18结合蛋白。该蛋白与il18结合，阻止il18与其受体结合，从而抑制il18诱导的ifn
‑
γ产生。人il18bp的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc044215.1，人il18bp的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah44215.1。术语“il18bp”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0130]
在某些实施方案中，细胞因子是趋化因子。在某些实施方案中，趋化因子包括cc趋化因子。在某些实施方案中，cc趋化因子选自ccl4、ccl8、ccl6、ccl9和ccl11。在某些实施方案中，趋化因子包括cxc趋化因子。在某些实施方案中，cxc趋化因子选自cxcl2、cxcl5、cxcl16、cxcl9和cxcl13。
[0131]
趋化因子是细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白的家族。趋化因子可分为四个主要的亚家族：cxc、cc、cx3c和xc，它们均通过与g蛋白连接的跨膜受体(称为趋化因子受体)相互作用而发挥其生物学作用，该受体在靶细胞表面上选择性存在。趋化因子负责基底白细胞的迁移(稳态)或积极参与炎症反应，将免疫细胞吸引到炎症部位(炎症)。
[0132]
如本文所用，术语“ccl4”是指c
‑
c基序趋化因子4，其为具有炎症和化学动力学性质的单因子。人ccl4的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc107433.1，人ccl4的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aai07434.1。术语“ccl4”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、其剪接变体和等位基因变体。
[0133]
如本文所用，术语“ccl6”是指趋化因子(c
‑
c基序)配体6，属于cc趋化因子家族的小细胞因子。大鼠ccl6的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc079460.1，大鼠ccl6的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah79460.1。可以通过blast找到与示例性氨基酸序列同源的人对应物，例如，ncbi登录号：np_665905.2和np_116741.2。术语“ccl6”涵盖其他
物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0134]
如本文所用，术语“ccl8”是指趋化因子(c
‑
c基序)配体8，属于cc趋化因子家族的小细胞因子。它吸引单核细胞，淋巴细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，并可能在瘤形成和炎症性宿主反应中起作用。人ccl8的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc126242.1，人ccl8的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aai26243.1。术语“ccl8”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0135]
如本文所用，术语“ccl9”是指c
‑
c基序趋化因子9，其为具有炎症，热原和化学动力学性质的单因子。它以高浓度在健康动物的血液中循环。它与高亲和力受体结合，激活嗜中性粒细胞中的钙释放。它还抑制骨髓骨髓未成熟祖细胞的集落形成。小鼠ccl9的示例性完整cdna序列的gi号为85440457，小鼠ccl9的示例性氨基酸序列的ncbi登录号为np_035468.1。可以通过blast找到与示例性氨基酸序列同源的人对应物，例如ncbi登录号：np_665905.2和np_005055.3。术语“ccl9”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、其剪接变体和等位基因变体。
[0136]
如本文所用，术语“ccl11”是指c
‑
c基序趋化因子11，属于cc趋化因子家族的小细胞因子。ccl11通过诱导趋化性选择性地募集嗜酸性粒细胞，因此与过敏反应有关。人ccl11的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc017850.1，人ccl11的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah17850.1。术语“ccl11”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0137]
如本文所用，术语“cxcl2”是指c
‑
x
‑
c基序趋化因子2，其是在体外抑制造血祖细胞增殖的造血趋化因子。人cxcl2的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc015753.1，人cxcl2的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah15753.1。术语“cxcl2”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0138]
如本文所用，术语“cxcl5”是指c
‑
x
‑
c基序趋化因子5，属于cxc趋化因子家族的小细胞因子。它是在炎性细胞因子白介素
‑
1或肿瘤坏死因子
‑
α刺激细胞后产生的。人cxcl5的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc008376.1，人cxcl5的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah08376.1。术语“cxcl5”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0139]
如本文所用，术语“cxcl9”是指趋化因子(c
‑
x
‑
c基序)配体9，属于cxc趋化因子家族的小细胞因子，也被称为γ干扰素(mig)诱导的单因子。cxcl9是由ifn
‑
γ诱导的t细胞趋化因子。人cxcl9的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc063122.1，人cxcl9的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah63122.1。术语“cxcl9”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0140]
本文所用的术语“cxcl13”是指趋化因子(cxc基序)配体13，属于cxc趋化因子家族的小细胞因子，也称为b淋巴细胞趋化因子(blc)或b细胞吸引趋化因子1(bca)
‑
1)是在人类中由cxcl13基因编码的蛋白质配体。cxcl13对属于b
‑
1和b
‑
2子集的b细胞具有选择性趋化作用，并通过与趋化因子受体cxcr5相互作用而引起其作用。cxcl13及其受体cxcr5控制淋巴组织滤泡内b细胞的组织，并在人的肝脏，脾脏，淋巴结和肠道中高表达。cxcl13的基因位于其他cxc趋化因子簇中的人类4号染色体上。在t细胞中，cxcl13的表达被认为反映了t细胞的生发中心起源，特别是反映了称为t卵泡辅助细胞(或tfh细胞)的t细胞的一个子集。人
cxcl13的示例性完整cdna序列的genbank登录号为ef064743.1，人cxcl13前体的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah12589.1。术语“cxcl13”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0141]
如本文所用，术语“cxcl16”是指趋化因子(c
‑
x
‑
c基序)配体16，属于cxc趋化因子家族的小细胞因子。cxcl16由cxc趋化因子结构域，粘蛋白样茎，跨膜结构域和含有可能结合sh2的潜在酪氨酸磷酸化位点的胞质尾部组成。这些是趋化因子的不寻常特征，并允许cxcl16和细胞表面结合分子以及可溶性趋化因子一起表达。cxcl16通常由在淋巴器官的t细胞区域中发现的树突状细胞以及在脾脏的红色髓中发现的细胞产生。响应于cxcl16而结合和迁移的细胞包括t细胞的几个子集，以及自然杀伤性t(nkt)细胞。cxcl16与趋化因子受体cxcr6(也称为bonzo)相互作用。人cxcl16的示例性mrna序列的登录号为af337812.1，人cxcl16前体的示例性氨基酸序列的登录号为aak38275.1。术语“cxcl16”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0142]
细胞粘附分子(cam)是位于细胞表面上的细胞粘附蛋白的一个子集，在与细胞粘附有关的过程中参与与其他细胞或细胞外基质(ecm)的结合。细胞粘附分子帮助细胞彼此粘附并粘附于周围环境。cam包括免疫球蛋白超家族的细胞粘附分子(igcam)，钙黏着蛋白，整联蛋白和c型凝集素样结构域蛋白超家族(ctld)。在某些实施方案中，细胞粘附分子包括icam1、csf3r、itgam、siglecf、adam8、chl1、sirpa、nrcam、emilin2、emilin1、tubb6和parvb。
[0143]
如本文所用，术语“itgam”是指整联蛋白α
‑
m，其涉及单核细胞，巨噬细胞和粒细胞的各种粘附相互作用以及介导补体包被颗粒的摄取。人itgam的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc096346.3，人itgam的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah96346.1。术语“itgam”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0144]
如本文所用，术语“siglecf”是指结合唾液酸的ig样凝集素f，也称为siglec5，其是结合唾液酸的细胞表面蛋白。它主要存在于免疫细胞表面，是i型凝集素的一个子集。小鼠siglecf的示例性完整cdna序列的登录号为bc145038.1，小鼠siglecf的示例性氨基酸序列的登录号为aai45039.1。可以通过blast找到与示例性氨基酸序列同源的人对应物，例如，ncbi登录号：np_003821.1和xp_016882908.1。术语“siglecf”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和等位基因变体。
[0145]
如本文所用，术语“adam8”是指含有整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白质8，其是adam(整合素和金属蛋白酶结构域)家族的成员。这个家族的成员是膜固定蛋白，在结构上与蛇毒双整合蛋白有关，并已参与涉及细胞
‑
细胞和细胞
‑
基质相互作用的多种生物学过程，包括受精，肌肉发育和神经发生。该基因编码的蛋白质可能在神经退行性病变过程中参与细胞黏附。人adam8的示例性完整cdna序列具有genbank登录号d26579.1，人adam8的示例性氨基酸序列具有genbank登录号baa05626.1。术语“adam8”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和等位基因变体。
[0146]
如本文所用，术语“chl1”是指神经细胞粘附分子l1样蛋白，细胞外基质和细胞粘附蛋白，其在神经系统发育和突触可塑性中起作用。可溶性和膜状形式均促进小脑和海马神经元的神经突向外生长并抑制神经元细胞死亡。人chl1的示例性完整cdna序列的
genbank登录号为bc104918.1，人chl1的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aai04919.1。术语“chl1”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，其剪接变体和等位基因变体。
[0147]
如本文所用，术语“sirpa”是指信号调节蛋白α，也称为酪氨酸
‑
蛋白磷酸酶非受体型底物1，cd47的免疫球蛋白样细胞表面受体。它充当对接蛋白，并诱导ptpn6，ptpn11和其他结合伴侣从胞质溶胶转移到质膜。支持小脑神经元的粘附，神经突增生和神经胶质细胞附着。人sirpa的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc026692.1，人sirpa的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah26692.1。术语“sirpa”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体，剪接变体和等位基因变体。
[0148]
如本文所用，术语“nrcam”是指神经元细胞粘附分子，是在神经元，神经胶质和骨骼肌表面表达的同型结合糖蛋白。它是对大脑和周围神经系统中细胞接触的正常反应所必需的。细胞粘附分子(cams)是免疫球蛋白超家族的成员。人nrcam的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc115736.1，人nrcam的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aai15737.1。术语“nrcam”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和等位基因变体。
[0149]
如本文所用，术语“emilin2”是指弹性蛋白微纤维接口2，其是细胞外基质糖蛋白的emilin家族的成员。它具有细胞粘合能力。人emilin2的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc136541.1，而人emilin2的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aai36542.1。术语“emilin2”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、其剪接变体和等位基因变体。
[0150]
如本文所用，术语“emilin1”是指弹性蛋白微纤维接口1，其是细胞外基质糖蛋白的emilin家族的成员。它具有细胞粘合能力。人emilin1的示例性完整cdna序列的登录号为bc136279.1，人emilin1的示例性氨基酸序列的登录号为aai36280.1。术语“emilin1”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和等位基因变体。
[0151]
如本文所用，术语“tubb6”是指微管蛋白β
‑
6链，微管的主要成分。它与两摩尔gtp结合，一个在β链的可交换位点，另一个在α链的不可交换位点。人tubb6的示例性完整cdna序列的genbank登录号为bc002654.1，人tubb6的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aah02654.1。术语“tubb6”涵盖其他物种的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、剪接变体和等位基因变体。
[0152]
如本文所用，术语“parvb”是指β
‑
parvin，一种衔接蛋白，其在经由ilk的整联蛋白信号传导中以及在通过鸟嘌呤交换因子激活gtpases cdc42和rac1中起作用。它参与肌动蛋白细胞骨架的重组和片状脂蛋白的形成。它在细胞粘附、细胞扩散、细胞极性的建立或维持以及细胞迁移中发挥作用。小鼠parvb的示例性完整cdna序列的登录号为af237770.1，而小鼠parvb的氨基酸序列的示例性登录号为aag27172.1。可以通过blast找到与示例性氨基酸序列同源的人对应物，例如，ncbi登录号：np_001003828.1和np_037459.2。术语“parvb”涵盖其他物种中的同源物，通过蛋白水解加工获得的变体、其剪接变体和等位基因变体。
[0153]
如本文所用，术语“icam1”是指细胞间粘附分子1，一种细胞表面糖蛋白，通常在内皮细胞和免疫系统的细胞上表达。它与cd11a/cd18或cd11b/cd18类型的整联蛋白结合，并且被鼻病毒利用作为进入呼吸道上皮的受体。人icam1的示例性完整cdna序列的登录号为
在免疫反应中起阳性信号的作用。icosl的示例性完整cdna序列的genbank登录号为nm_015259.5，而人icosl的示例性氨基酸序列的genbank登录号为np_056074.1。icosl与cd80/cd86共享19
‑
20％的序列同一性，并以细胞表面蛋白的形式分泌或表达。人icosl具有两个剪接变体(hgl50和b7
‑
h2/b7rp
‑
1/hlicos)，两者均具有相同的胞外域，但在其胞质区的羧基末端不同。在人中，icosl在b细胞、树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞和t细胞上表达。与cd80/cd86不同，icosl不与cd28或ctla
‑
4(cd152)相互作用，但在细胞表面上充当非共价连接的同型二聚体并与icos结合。据报道，人icosl与人cd28和ctla
‑
4结合(参见us专利申请us20160304610)。
[0160]
icos/icos
‑
l的相互作用与体内t细胞介导的免疫反应有关。此外，icos的体内缺陷会导致生发中心(gc)形成受损(gc数量和大小减少)，t细胞依赖性b细胞反应的同种型类别转换缺陷以及il
‑
4和il
‑
13缺陷。产生(参见khayyamian等，在人内皮细胞上表达的icos配体通过记忆性cd4 t细胞共刺激th1和th2细胞因子分泌，pnas,vol.9,no.9,2002,6198
‑
6203)。在gc中，长寿浆细胞(llpc)和记忆b细胞(mbc)进行类别转换和体细胞超突变，以增加抗体亲和力。
[0161]
在某些实施方案中，在icos或icosl存在下培养pbmc可增加由pbmc产生的抗体或其抗原结合片段的总量。
[0162]
可以通过确定它们的亲和力和结合特异性来筛选icos的激动剂。用于确定结合的亲和力和特异性的方法，例如竞争性和非竞争性结合测定法，在本领域中是已知的，包括elisa，ria，流式细胞术等。icos激动剂的作用可以通过检测t细胞被icos激活。可通过检测cd4+t细胞增殖、细胞周期进程、细胞因子(如il
‑
2)释放、cd25和cd69上调等来测量t细胞活化。
[0163]
icos激动剂包括化合物或蛋白质，例如激动剂抗体jtx
‑
2011(jounce therapeutics inc)和gsk3359609(gsk)，以及在美国专利申请us20160304610，us 20170174767以及wo 2012/131004中描述的抗体。
[0164]
本文所用的cd40l也称为cd40配体或cd154，一种主要在活化t细胞上表达的蛋白质(此后其表达已在多种细胞中发现，包括血小板、肥大细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、nk细胞、b淋巴细胞以及非造血细胞)，并且是分子tnf超家族的成员。它与抗原呈递细胞(apc)上的cd40结合，并充当共刺激分子，这在称为t卵泡辅助细胞(tfh细胞)的t细胞子集上尤为重要。在tfh细胞上，cd40l通过将cd40接合在b细胞表面上来促进b细胞成熟和功能，从而促进细胞之间的通讯。示例性的cd40l完整cdna序列的genbank登录号为nm_000074.2，而人cd40l的示例性氨基酸序列的genbank登录号为np_000065.1。
[0165]
如本文所用，短语“b细胞活化因子”或“baff”或“baff”是指肿瘤坏死家族配体，例如tnf家族配体。baff在细胞表面表达，并作为调节蛋白，参与免疫细胞例如b细胞上的膜表面蛋白之间的相互作用。分泌baff是有效的b细胞生长因子，可帮助b细胞增殖并起共刺激剂的作用。据报道，baff对于从记忆细胞中分泌抗体的细胞的存活是至关重要的(avery dv等，j clin invest,2003,112:286
‑
97)。人cd40l的示例性氨基酸序列的genbank登录号为aad25356.1。
[0166]“ox40l”是ox40(cd134)的配体，并且在诸如dc2s(树突状细胞的亚型)的细胞上表达，从而能够扩增th2细胞分化。ox40l也被称为cd252(分化簇252)。据报道，ox40与icos在t
滤泡辅助细胞(tfh)中共表达，并影响tfh细胞与生发中心(gc)中的b细胞之间的相互作用，从而影响b细胞的发育以及浆细胞中浆细胞的成熟。人ox40l的示例性cdna序列的genbank登录号为aj277151.1，人ox40l的示例性氨基酸序列的genbank登录号为cab9654.3。
[0167]
术语“toll样受体(tlr)”是在先天免疫系统(非特异性免疫)中起关键作用的蛋白质家族。它们是单一的，跨膜的非催化受体，通常在前哨细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)上表达，可识别源自微生物的结构保守分子。除细胞外和跨膜结构域外，tlr还包含细胞质的toll
‑
白介素1受体抗性(tir)域。一旦这些微生物突破了诸如皮肤或肠道粘膜等物理障碍，它们就会被tlr识别，从而激活免疫细胞反应。tlr识别高度保守的结构基序，即病原体相关的分子模式(pamp)，它们仅由微生物病原体表达，例如革兰氏阴性菌的脂多糖(lps)和革兰氏阳性菌和鞭毛蛋白的脂蛋白酸(lta)等等，或者是与危险相关的分子模式(damp)，它们是从坏死或垂死细胞释放的内源性分子。许多肿瘤细胞会经历免疫系统介导的坏死，并可能导致通过tlr进一步激活炎症反应。人tlr家族包括在各种免疫细胞类型上表达的tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9和tlr10。鼠标tlr系列包括tlr1
‑
9和tlr 11
‑
13。
[0168]
如本文所用，“toll样受体配体”是指toll样受体的激动剂或拮抗剂。在某些实施方案中，tlr配体是激动剂，例如病原体相关分子模式(pamp)。激活tlr的tlr激动剂的实例包括但不限于咪喹莫特、gs
‑
9620(gilead，参见roethle等，2013)、化合物32(gsk2245035，gsk，参见biggadike等，2016)和瑞西莫德(r848)、咪唑喹啉、包含cpg odn(例如未甲基化的cpg二核苷酸(例如odn2216)和聚i：c，单磷酰脂质a(mpla)或其他脂多糖衍生物、单链或双链rna、鞭毛蛋白、多聚二肽的核酸)的核酸、tslp、肿瘤坏死因子(tnf)α、i型干扰素(例如ifnα/β)、ii型干扰素(例如ifny)、脂质、avasimid、efnb1、ephb4、从蛋白b2、轴突导向蛋白4c、blimp
‑
1和irf4。(参见j.med.chem.roethle等，2013.口服治疗病毒性肝炎的蝶呤酮toll样受体7(tlr7)激动剂的鉴定和优化，j.med.chem.biggadike等，2016.59,1711
‑
1726.一种用于治疗哮喘的高效和选择性鼻内toll样受体7激动剂6
‑
氨基
‑2‑
{[(1s)
‑1‑
甲基丁基]氧基}
‑9‑
[5
‑
(1
‑
哌啶基)戊基]
‑
7,9
‑
二氢
‑
8h
‑
嘌呤
‑8‑
酮(gsk2245035)的发现)
[0169]
文献报道了对tlr类型特异性的tlr激动剂，例如bcg(tlr1、2、4和6)、脂肽(tlr1、2和6)、单磷酰脂质a(mpl)、lps、rc529、as01、as02、as04和吡喃葡萄糖基脂质佐剂(gla
‑
se)(tlr4)、聚(i：c)(tlr3)、鞭毛蛋白(tlr5)、单链和r484/雷西莫德(tlr7和tlr8)或双链(ds)rna(tlr3)、咪喹莫特和1型干扰素(tlr7)、以及含有cpg基序、as15和ic31(tlr9)的dna。从应激或死亡细胞释放的内源性分子，例如热休克蛋白(hsp，tlr2和tlr4)和高迁移率族1号框(hmgb1，tlr2和tlr4)，也被认为是重要的tlr激动剂(参见deng sl等，toll样受体和tlr激动剂在人脑胶质瘤免疫治疗中的作用研究进展，(参见protein cell 2014,5(12):899
–
911；zhang ww和matlashewski g，toll样受体7和/或8激动剂疫苗佐剂免疫增强balb/c小鼠对利什曼原虫的保护性免疫,infection and immunity,aug.2008,p.3777
‑
3783；gauwelaert nd等，tlr4激动剂疫苗佐剂gla
‑
se需要典型和非典型的th1诱导作用机制，plos one.2016jan5；11(1):e0146372；maisonneuve c等，释放nod和toll样激动剂作为疫苗佐剂的潜力.proc natl acad sci u s a.2014aug 26；111(34):12294
‑
9)。
[0170]
在某些实施方案中，其中所述抗体增强组合物在培养开始时添加到培养基中，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14、15、16、17、18、19、20、21天后添加到培养基中。在某
些实施方案中，其中所述抗体增强组合物在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天后从培养基中除去组合物。
[0171]
在某些实施方案中，其中所述抗体增强组合物在抗体增强组合物的两个或多个抗体增强因子在刺激体外抗体产生中表现出协同作用。两种或多种抗体增强因子可以选自adsp、cd40l、icosl、icos、tlr激动剂、共刺激物(cd40、cd40l、icosl、icos、april、tnf家族的b细胞活化因子(baff)、ox40或ox40l)、toll样受体(tlr)激动剂(tlr1激动剂、tlr2激动剂、tlr3激动剂、tlr4激动剂、tlr5激动剂、tlr6激动剂、tlr7激动剂、tlr8激动剂和tlr9激动剂)、cpg寡聚/脱氧核糖核酸或k cpg)、抗凋亡蛋白(bcl
‑
2、bcl
‑
6、bcl
‑
xl、bcl
‑
w、mcl
‑
1或其类似物)、tnf、i型干扰素(例如ifn
‑
αifn
‑
β、ifn
‑
ε、ifn
‑
κ和ifn
‑
ω)、ii型干扰素(例如ifnγ)、脂质、avasimid，、efnb1、ephb4、从蛋白b2、轴突导向蛋白4c、blimp
‑
1和irf4。
[0172]
体外抗体生产
[0173]
本公开提供了一种产生与目的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在培养基中混合抗原，抗体产生细胞组合物(agc)和抗体增强组合物以形成混合物，培养混合物
[0174]
在培养基中混合所述抗原，抗体产生细胞组合物(agc)和抗体增强组合物以形成混合物，
[0175]
培养所述混合物，
[0176]
从所述混合物中获得抗体，
[0177]
其中所述agc包含至少一种b细胞和至少一种其他类型的源自外周血单核细胞(pbmc)的细胞，并且所述抗体增强组合物包含一种或多种脂肪组织衍生的分泌蛋白(adsp)。在某些实施方案中，抗体增强组合物还包含il2和/或il21。
[0178]
在某些实施方案中，其中所述培养之前的b细胞是非成熟的。在某些实施方案中，其中所述培养之前的b细胞不产生针对目的抗原的抗体。
[0179]
本公开还提供了产生特异性结合目的抗原的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：
[0180]
在培养基中混合所述抗原，抗体产生细胞组合物(agc)和抗体增强组合物以形成混合物，
[0181]
培养所述混合物
[0182]
从所述混合物中获得抗体，
[0183]
其中所述agc包含至少一种b细胞和至少一种其他类型的源自外周血单核细胞(pbmc)的细胞，并且所述增强抗体的组合物包含il2、il21和一种或多种脂肪组织衍生的分泌蛋白(adsps))。
[0184]
adsp、il2和il21可以一次或以任何合适的顺序分别引入培养基。il
‑
2和/或il21能够促进b细胞的增殖，并且adsp和抗原能够刺激b细胞产生抗体，并且il21也能够促进抗体从igm向igg的类别转换。在某些实施方案中，首先将il2添加到培养基中，然后添加抗原和adsp，然后添加il21。
[0185]
在某些实施方案中，向培养基中添加adsp产生具有抗原特异性的抗体。在某些实施方案中，adsp包括细胞因子，例如il1β、il1f9、il10、il27、il33、il18bp、趋化因子、例如ccl8、ccl4、cxcl2、ccl6、ccl9、ccl11、cxcl5、cxcl2和cxcl9以及细胞粘附分子、例如icam1、
csf3r、itgam、siglecf、adam8、chl、sirpa、nrcam、emilin2、emilin1、tubb6和parvb。在某些实施例中，adsp包括il1β、ccl8和cxcl5。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的抗体或抗原结合片段以约0.01nm至约100nm、约0.1nm至约100、约0.01nm至约10nm、约0.1nm至约10nm、约0.01nm至约5nm、约0.1nm至约5nm、约0.01nm至约1nm、约0.1nm至约1nm或约0.01nm至约0.1nm的结合亲和力(kd)特异性结合人和/或非人抗原。
[0186]
在培养开始后的第一时间段内，可以将第一组adsps添加到培养基中，然后在第二时间段内，将第二组adsps添加到培养基中。在某些实施例中，在添加第二组adsp之前，去除所述第一组adsp。在某些实施方案中，在第二时间段结束时从混合物中除去所述第二组adsp。在某些实施例中，所述“第一时段”或“第二时段”是指例如0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、一个月或更长时间。在某些实施例中，“第一时段”或“第二时段”具有相同或不同的时间长度(或时间跨度)。在某些实施方案中，第一和/或第二组adsp在混合物中存在0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天栽培开始后的5天、6天、7天、8天、9天、10天。在某些实施例中，第一批和第二组adsp是相同或不同的。
[0187]
在某些实施方案中，其中所述第一组或第二组adsp包括细胞因子，例如il1β、il1f9、il10、il27、il33、il18bp趋化因子例如ccl8、ccl4、cxcl2、ccl6、ccl9、ccl11、cxcl5、cxcl2和cxcl9以及细胞粘附分子例如icam1、csf3r、itgam、siglecf、adam8、chl、sirpa、nrcam、emilin2、emilin1、tubb6和parvb。
[0188]
adsp在混合物中的存在浓度至少为0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35，40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000、3000，4000、5000或更高的ng/ml，或0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50，55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000或更多ml，或0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、24、25、28、30、35、40、45，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或更多nm。
[0189]
在某些实施方式中，il1β以40、400或1000ng/ml的浓度存在于混合物中。在某些实施方案中，ccl8以10、50或100ng/ml的浓度存在于混合物中。在某些实施方案中，cxcl5以1、10或20ng/ml的浓度存在于混合物中。在某些实施方案中，ccl4以5ng/ml的浓度存在于混合物中。在某些实施方案中，cxcl2以10ng/ml的浓度存在于混合物中。在某些实施方案中，cxcl16以2ng/ml的浓度存在于混合物中。
[0190]
在某些实施方案中，il2在混合物中存在0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天，、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、一个月或更长时间。在某些实施方案中，il21在混合物中存在0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、一个月或更长时间。在某些实施方案中，栽培开始后0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，il2和/或il21在混合物中存在。
[0191]
在某些实施方案中，il2以至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更高ng/ml，或以0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70，75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更高μg/ml，或0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、24、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或更多nm的浓度存在于混合物中。
[0192]
在某些实施方案中，il21以至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、1000或更高的ng/ml、或0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更高μg/ml、或0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、24、25、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000或更多nm。
[0193]
在某些实施方案中，il2和il21以1：1、1：2、1：5、1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：150、1：200、1：500、1：1000、1：2000、1：5000、1：10000或1：20000的比例存在于混合物中。
[0194]
在某些实施方案中，其中所述混合物中存在的il2的浓度为10ng/ml。在某些实施方案中，其中所述混合物中存在的il21的浓度为50ng/ml。
[0195]
在某些实施方案中，其中所述混合物还包含抗原。抗原在培养开始时即存在于混合物中，或种植开始后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天。在某些实施方案中，其中所述抗原在混合物中存在至少0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、一个月或更长时间。
[0196]
本公开内容提供了一种诱导抗体产生细胞组合物(agc)增殖、b细胞活化和分化、b细胞成熟和/或促进agc中类别转换以产生igg的方法，其中所述方法包括在包含il2，adsp和/或il21的培养基中培养所述agc。在某些实施例中，agc包括pbmc。
[0197]
可以根据本领域中的已知方案在体外培养agc或pbmc(panda,s.k.和ravindran,b.(2013).人pbmc的体外培养.bio
‑
protocol 3(3):e322.)。刺激后，agc或pbmc的增殖可以使用本领域常用的方法，例如流式细胞术来测量。
[0198]
b细胞的活化和分化是外周血b淋巴细胞经历抗原诱导的活化和分化的过程。活化的b细胞可以使分泌抗体的浆细胞或记忆b细胞比例升高。类转换发生在浆细胞阶段。b细胞可能首先分化为浆母细胞样细胞，然后分化为浆细胞，随后在感染中产生，并且与浆母细胞相比，由于生发中心的亲和力成熟，与浆母细胞相比，它们的抗体具有更高的亲和力(gc)并产生更多抗体(请参阅nutt等，nature reviews immunology.2015,15(3):160)。浆细胞通常是由t细胞依赖性(td)的b细胞活化引起的生发中心反应引起的，但是它们也可能是t细胞依赖性(ti)b细胞活化引起的(参见bortnick等，the journal of immunology.188(11):5389
–
5396))。可以通过本领域已知的方法在体外检测或确认b细胞的活化或分化，例如，通过用cd19，igm，igd，iga抗体进行细胞标记以及使用facs进行细胞分选。可以将记忆b细胞
确定为cd19+igm
‑
iga
‑
igd
‑
，而将产生igg的b细胞识别为cd19+igg+。
[0199]
b细胞发育是淋巴样前体细胞的分化，其分化成最早的独特的b谱系细胞(祖b细胞(pro
‑
b细胞))，其表达跨膜酪氨酸磷酸酶cd45r(或小鼠中的b220)。pro
‑
b细胞的增殖和分化为前体b细胞(pre
‑
b细胞)需要由骨髓基质细胞提供的微环境，该基质直接与pro
‑
b和pre
‑
b细胞相互作用，并分泌各种细胞因子，尤其是il
‑
7，其支持发展过程。
[0200]
b细胞的成熟期取决于淋巴干细胞中免疫球蛋白dna的重排。在b细胞发育过程中，连续的ig
‑
give重排将pro
‑
b细胞转变为表达具有单一抗原特异性migm的未成熟b细胞。之后将形成仍具有单一特异性的成熟幼稚b细胞，同时表达migm和migd。只有能够表达膜结合的μ重链和替代轻链的前b细胞才能沿着发育途径前进。生成有效的pre
‑
b细胞受体后，每个pre
‑
b细胞都会经历多个细胞分裂，可能是6到8次，产生多达256个子代。然后，这些子代前b细胞中的每一个都可以重新排列不同的轻链基因片段，从而增加抗体库的整体多样性。在某些实施方案中，b细胞成熟发生在外周。b细胞成熟可以通过本领域已知的方法在体外检测或确认，例如，通过检测b细胞表面标记，例如，未成熟的b细胞表达migm和migd，而成熟的b细胞表达migg，miga和migd。本领域技术人员将理解，可以使用诸如细胞染色和用针对上述标志物的标记抗体进行细胞分选的方法。
[0201]
类别转换也被称为同种型转换，同型换向或类别转换重组(csr)。这是一种将b细胞产生的免疫球蛋白(抗体)从一种类型改变为另一种类型，例如从同种型igm变为同种型igg和ige的生物学机制。在此过程中，抗体重链的恒定区部分发生了变化，但重链的可变区保持不变。由于可变区不变，因此类别转换不会影响抗原特异性。相反，抗体保留对相同抗原的亲和力，但是可以与不同的效应子分子相互作用(参见honjo等，immunity,01jun 2004,20(6):659
‑
668)。用于测定igg和igm及其水平的方法是本领域已知的，例如，通过使用对同种型特异性的抗体的elisa来进行。
[0202]
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的抗体包含igg。在某些实施方案中，根据本文提供的方法所涉及的的抗体包含igg百分比的增加。
[0203]
在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括从混合物中分离抗体。例如，其中所述方法进一步包括将产生抗体的b细胞与永生细胞系融合以获得杂交瘤。在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括使用本领域已知的分子生物学技术分离抗体基因的rna和克隆单结构域抗体的文库，随后通过使用噬菌体展示进行选择。
[0204]
本文使用的术语“杂交瘤”是指杂交瘤技术过程中的融合杂交细胞，其中所述方法用于产生大量单克隆抗体。收集响应于免疫应答产生抗体的b细胞，然后与永生b细胞癌细胞、骨髓瘤融合，以产生被称为杂交瘤的杂交细胞系，该杂交瘤细胞具有b
‑
的抗体产生能力，骨髓瘤的长寿和生殖能力。杂交瘤可在培养物中生长，每种培养物均从一个活的杂交瘤细胞开始，产生的培养物均由遗传上相同的杂交瘤组成，该杂交瘤每个培养物产生一种抗体(单克隆)，而不是不同抗体的混合物(多克隆)。与多克隆抗体是许多不同抗体分子的混合物相比，每种杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体在化学上都是相同的。
[0205]
选择“噬菌体展示文库”的技术是指通过聚合酶链反应(pcr)分别克隆vh和vl基因库并在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选抗原结合噬菌体的方法，如在winter,g.等，ann.rev.immunol.12(1994)433
‑
455提到的。噬菌体通常以单链fv(scfv)片段或fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库(例如通过本文提供的方法制备的产生抗体的pbmc)提供对
抗原具有高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。同样地，如griffiths,a.d.等，embo j.12(1993)725
‑
734所述，克隆天然库(例如，从人)获取针对广泛的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源，也无需任何免疫。最后，如hoogenboom,h.r.和winter,g.,j.mol.biol.227(1992)381
‑
388等提出，还可以通过克隆干细胞中未重排的v基因片段，并使用包含随机序列的pcr引物来编码高度可变的cdr3区域并在体外完成重排，从而合成天然文库。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利no.us 5,750,373，us 2005/0079574，us 2005/0119455，us 2005/0266000，us 2007/0117126，us 2007/0160598，us 2007/0237764，us 2007/0292936和us2009/0002360。类似的展示文库包括核糖体展示，酵母展示，细菌展示，杆状病毒展示，哺乳动物细胞展示或mrna展示文库(参见，例如，u.s.pat.no.7,244,592；chao等，nature protocols.1:755
‑
768,2006)。这些展示方法是本领域中的所有常规技术，其特定操作可以在相应的教科书或操作手册中找到，例如参见mondon p等，front.biosci.13:1117
‑
1129,2008。
[0206]
在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括获得核酸分子，该分子编码混合物内抗体的可变区。在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括在适合于表达抗体或其抗原结合片段的条件下将核酸分子引入宿主细胞。在某些实施方案中，其中所述宿主细胞是cho细胞。
[0207]
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非另有说明，否则特定的多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、snp和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并的密码子取代可以通过生成序列来实现，其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见batzer等，nucleic acid res.19:5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.260:2605
‑
2608(1985)；和rossolini等，mol.cell.probes 8:91
‑
98(1994))。
[0208]
将编码抗体或其抗原结合片段可变区的核酸序列转化宿主细胞以产生抗体，并在适当优化的常规营养培养基中培养，以诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需的序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以通过本领域已知的同源重组产生。
[0209]
在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括获得编码从混合物产生的抗体的可变区的核酸序列。
[0210]
使用常规程序(例如通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序编码单克隆抗体的dna。编码dna也可以通过合成方法获得。
[0211]
在某些实施方案中，其中所述方法进一步包括评估如此产生的抗体或其抗原结合片段是否特异性结合目的抗原。
[0212]
在某些实施方案中，结合特异性的评估通过免疫测定法例如elisa或荧光免疫测定法进行。
[0213]
在某些实施方案中，结合特异性的评估是通过结合亲和力来确定的。根据本文提供的方法产生的抗体或其抗原结合片段的结合亲和力可以由kd值表示。本文使用的kd是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)，可通过使用本领域已知的任何常规方法来确定，包括但不限于表面等离子体激光共振方法、微尺度热泳法、hplc
‑
ms方法和流式细胞仪(例
如facs)方法。在某些实施方案中，可以通过使用流式细胞术方法适当地确定kd值。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相elisa免疫测定来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体(参见例如harlow&lane，使用抗体，实验室手册(1998)，关于可以使用的免疫测定形式和条件的描述，以确定特异性免疫反应性)。通常，特异性或选择性结合反应产生的信号至少是背景信号的两倍，更通常是背景信号的至少10至100倍。
[0214]
备选地，根据本文提供的方法产生的抗体及其抗原结合片段对某些抗原的结合亲和力也可以用“半最大有效浓度”(ec50)值表示，其是指抗体的浓度。观察到其最大作用(例如结合)的50％的抗体。可以通过本领域已知的方法来测量ec50值，例如，夹心测定法例如elisa，蛋白质印迹法，流式细胞术测定法和其他结合测定法。
[0215]
用于体外免疫的组合物
[0216]
本文的公开内容提供了包含抗体产生细胞组合物(agc)的组合物，所述抗体产生细胞组合物(agc)包含至少一种b细胞和衍生自外周血单核细胞(pbmc)的至少一种其他类型的细胞媒介。
[0217]
在某些实施方案中，所述组合物还包含目的抗原。在某些实施方案中，抗体增强组合物还包含il2和/或il21。
[0218]
在某些实施例中，agc包括pbmc。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞、至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)、至少一种树突细胞、至少一种nk细胞、至少一种单核细胞和至少一种脂肪细胞中的至少一种。
[0219]
例如，在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种t细胞(例如，t滤泡辅助细胞)。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞，至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞和至少一种nk细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞和至少一种单核细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种b细胞，t细胞(例如t滤泡辅助细胞)和至少一种nk细胞。在某些实施方案中，agc包括至少一种b细胞，至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)，至少一种树突细胞和至少一种nk细胞。
[0220]
在某些实施方案中，agc还包含脂肪细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞和b细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞，至少一种b细胞和至少一种t细胞(例如t滤泡辅助细胞)。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞，至少一种b细胞和至少一种树突细胞。在某些实施方案中，agc包含至少一种脂肪细胞，b细胞，t细胞(例如t滤泡辅助细胞)和至少一种树突细胞。
[0221]
在某些实施方案中，b细胞、t滤泡辅助细胞、树突状细胞和脂肪细胞中的至少一种是人细胞。在某些实施方案中，b细胞是人b细胞。在某些实施方案中，pbmc衍生自人pbmc。
[0222]
在某些实施方案中，pbmc是从人类供体分离的。在某些实施方案中，pbmc衍生自干细胞。
[0223]
分离的抗体增强因子包括先前在本公开中描述的抗体增强因子。在某些实施方案中，分离的抗体增强因子包括先前描述的分离的adsp、cd40l、icosl、icos、tlr激动剂。
[0224]
组合物中所含的培养基提供了适合于抗体产生细胞组合物(agc)表达针对目标抗原的抗体或其抗原结合片段的条件。培养基可以是固体，液体或半固体，旨在支持微营养菌
或提供必需营养素(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(co2，o2)以维持细胞的生长，并调节细胞的理化环境(ph缓冲液、渗透压、温度)。诸如ham's f10(sigma)、最小必需培养基(mem)(sigma)、rpmi
‑
1640(sigma)和dulbecco's modified eagle's培养基(dmem)(sigma)等市售培养基都适合培养产生抗体的细胞组合物(agc)。另外meth.enz.58:44(1979),barnes等，anal.biochem.102:255(1980),u.s.pat.no.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；wo 90/03430；wo 87/00195；或u.s.pat.re.30,985等人描述的培养基中的一种，都可用作抗体生成细胞组合物(agc)的培养基。这些介质中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)、缓冲液(例如hepes))、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如gentamycintm药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。同时也包括以本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必要的补充剂。培养条件，例如温度，ph等，是先前与选择用于表达的抗体生成细胞组合物(agc)一起使用的那些条件，对于普通技术人员而言是显而易见的。
[0225]
鉴定用于体外免疫的抗体增强因子
[0226]
本文的公开提供了一种鉴定用于体外免疫的抗体增强因子的方法，该方法包括：
[0227]
a)从来源于经用目的抗原免疫的动物的淋巴结的细胞中分离总rna；
[0228]
b)将步骤a)中分离的总rna的rna水平与未免疫的对照动物的rna水平进行比较，以确定编码蛋白质且表达水平上调的基因；
[0229]
c)在包含所述目的抗原、il2、il21和蛋白质的培养基中培养pbmc；
[0230]
d)如果所述蛋白质增强了抗体的产生，则将所述蛋白质鉴定为用于体外免疫的抗体增强因子。
[0231]
在某些实施方案中，细胞是脂肪细胞、t滤泡辅助细胞、b细胞或树突细胞。在某些实施方案中，其中所述蛋白质由脂肪细胞、t滤泡辅助细胞、b细胞或树突状细胞表达。在某些实施方案中，其中所述蛋白质增强igg的产生。
[0232]
嵌合抗原受体(car)
[0233]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含与t
‑
连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scfv))。细胞信号传导或t细胞活化域(参见，例如，kershaw等，supra,eshhar等，proc.natl.acad.sci.usa,90(2):720
‑
724(1993)，和sadelain等，curr.opin.immunol.21(2):215
‑
223(2009))。利用单克隆抗体的抗原结合特性，car能够以非mhc限制的方式将t细胞特异性和反应性重定向至选定的靶标。非mhc限制性抗原识别使表达car的t细胞具有独立于抗原加工的识别抗原的能力，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。此外，car在t细胞中表达时，不会与内源性t细胞受体(tcr)α和β链二聚化
[0234]
在某些实施方案中，car序列包含抗原结合结构域，例如根据本文提供的方法制备的抗体的vh和vl基因区段，以及t细胞信号传导结构域，其包括例如铰链
‑
ch2
‑
ch3、跨膜结构域和一个或多个细胞质信号结构域。在某些实施方案中，跨膜结构域包括但不限于来自cd8α、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154的跨膜结构域。在某些实施方案中，胞质信号传导域包括但不限于来
自cd27、cd28、4
‑
1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd
‑
1、icos、淋巴细胞功能相关抗原
‑
1(lfa
‑
1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7
‑
h3的细胞内共刺激信号传导域，和与cd83、cd54(icam)、cd152(ctla4)、cd273(pd
‑
l2)、cd274(pd
‑
l1)和cd278(icos)特异性结合的配体，以及来自tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的主要信号传导结构域。
[0235]
本公开进一步提供了如此产生的car在免疫疗法中的用途，例如在嵌合抗原受体t细胞疗法(car
‑
t)中的用途。
[0236]
本文还提供了一种产生嵌合抗原受体(car)的方法，所述方法包括表达可操作地连接至第二核酸的第一核酸的步骤，其中所述第一核酸编码衍生自根据本文所述的方法产生的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域，且其中第二核酸编码一个或多个t细胞信号传导结构域。
[0237]
可以对诸如t细胞和自然杀伤(nature killer，nk)细胞的免疫细胞进行基因工程改造以表达car。表达car的t细胞被称为car
‑
t细胞。car可以介导t细胞中的抗原特异性细胞免疫活性，从而使car
‑
t细胞能够消除表达靶抗原的细胞(例如肿瘤细胞)。在一个实施方案中，本文提供的car
‑
t细胞与癌细胞的结合，导致所述car
‑
t细胞的增殖和/或活化，其中所述活化的cat
‑
t细胞可以释放细胞毒性因子，例如细胞毒性。穿孔素，颗粒酶和颗粒溶素，并启动癌细胞的细胞溶解和/或凋亡。
[0238]
在一些实施方案中，car的t细胞活化结构域包含共刺激性信号传导域和tcr信号传导域，它们可以随机或以指定顺序彼此连接，任选地与短肽连接长度为例如2至10个氨基酸之间的接头(例如，甘氨酸
‑
丝氨酸双峰接头)。
[0239]
在一些实施方案中，car进一步包含跨膜结构域。当在细胞中表达时，抗原结合结构域在细胞外，而t细胞激活结构域在细胞内。
[0240]
在某些实施方案中，car包含抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区域和tcr信号传导结构域，其中抗原结合结构域特异性结合抗原并包含抗体的抗原结合片段。
[0241]
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不应将其解释为限制本发明的范围。下文全部或部分描述的所有具体组合物，材料和方法均落入本发明的范围内。这些特定的组成，材料和方法无意于限制本发明，而仅是为了说明落入本发明范围内的特定实施例。本领域技术人员可以开发等同的组合物，材料和方法，而无需行使发明的能力并且不脱离本发明的范围。将理解的是，可以在本文描述的过程中做出许多变化，同时仍然保持在本发明的范围内。发明人的意图是，这样的变化包括在本发明的范围内。
[0242]
实施例
[0243]
实施例1：材料与方法
[0244]
材料：
[0245]
淋巴细胞分离液(mp,cat.v0111a)
[0246]
llme：l
‑
亮氨酰
‑
l
‑
亮氨酸甲酯(bachem,cat.g
‑
2550.0001)
[0247]
ham’s f
‑
12培养基(gibco,cat.11765047)
[0248]
肝素抗凝管(bd,cat.367878)
[0249]
一次性采血针(bd,cat.367237)
[0250]
il2、白细胞介素
‑
2、淋巴因子、tcgf(sinobiological,cat.11848
‑
hnay1
‑
50)
[0251]
bcgf
‑
1、bcgf1、bsf
‑
1、bsf1、il
‑
4、白细胞介素
‑
4(sinobiological,cat.gmp
‑
11846
‑
hnae
‑
100)
[0252]
cd154、cd40配体(sinobiological,cat.10239
‑
h01h
‑
50)
[0253]
ox40l(sinobiological,cat.13127
‑
h04h
‑
100)
[0254]
人icos配体/b7
‑
h2/icoslg(histag)(sinobiological,cat.11559
‑
h08h
‑
100)
[0255]
人icos/ailim/cd278蛋白(his&fc tag)(sinobiological,cat.10344
‑
h03h
‑
100)
[0256]
人白细胞介素
‑
21/il21(sinobiological,cat.gmp
‑
10584
‑
hnae
‑
20)
[0257]
人blys/tnfsf13b/baff(sinobiological,cat.10056
‑
hnch
‑
5)
[0258]
肾上腺素
‑
b1(sinobiological,cat.10894
‑
h08h)
[0259]
羊抗人igg
‑
fc(hrp)(sinobiological,cat.ssa001
‑
1)
[0260]
羊抗人igmμ链(abcam,cat.ab97205)
[0261]
glutamax
tm supplement(gibco,cat.35050
‑
061)
[0262]
mem neaa(gibco,cat.11140
‑
050)
[0263]
丙酮酸钠(gibco,cat.11360
‑
070)
[0264]
dmem(无谷氨酰胺、无丙酮酸钠、无hepes)(gibco,cat.11960
‑
051)
[0265]
青霉素
‑
链霉素，液体(gibco,cat.15140122)
[0266]
重组人胰岛素(yuanye,cat.s31559
‑
100mg)
[0267]
rpmi 1640培养基(gibco,cat.21875091)
[0268]
dapi(4’,6
‑
二氨基
‑2‑
苯基吲哚；储存液：5mg/ml溶解于dh2o；thermo fisher,cat.no.d1306)
[0269]
tmb显色底物(tiangen,cat.pa107
‑
01)
[0270]
fbs(gibco,cat.10099141)
[0271]
pbs(8117158)
[0272]
e6446二盐酸盐(mce,cat.hy
‑
12756a)
[0273]
抗人cd3 pe
‑
cy7(ebioscience,cat.bg
‑
05121
‑
77
‑
100)
[0274]
抗人cd21 pe(ebioscience,cat.85
‑
12
‑
0219
‑
42)
[0275]
鼠抗人cd35
‑
fitc(ebioscience,cat.05
‑
9600
‑
02)
[0276]
鼠抗人cd19 percp
‑
cy5.5(ebioscience,cat.bg
‑
11211
‑
70
‑
100)
[0277]
图像阅读器(biotek,cat.cytation 5)
[0278]
96孔酶标板(corning,cat.9018)
[0279]
人il1β(novoprotein,cat.cg93)
[0280]
人ccl8(novoprotein,cat.cc95)
[0281]
人cxcl5(novoprotein,cat.cf14)
[0282]
鼠cxcl16(novoprotein,cat.cc44)
[0283]
重组人cxcl13(sb,cat.10621
‑
hnae)
[0284]
重组人ccl4(sb,cat.10899
‑
h08y)
[0285]
重组人il27(sb,cat.10076
‑
h085)
[0286]
人cxcl2(novoprotein,cat.c096)
[0287]
鸡ova(sigma,cat.a5378
‑
1g)
[0288]
总rna提取试剂盒(takara,cat.9767)
[0289]
方法：
[0290]
小鼠免疫
[0291]
卵清蛋白(ova)用作抗原。通过依次免疫blab/c小鼠，开发出了针对ova的单克隆抗体。通过足垫注射途径对balb/c小鼠进行所有注射免疫。第一次以及随后的几次，每只小鼠注射ova与adju
‑
phos和cpg混合，最后一次，在无佐剂存在情况下，注射包含10ugova的dpbs。针对该方案，在第0、3、6、10、13、17、20和24天对blab/c小鼠进行免疫。
[0292]
组织分离
[0293]
用异氟烷麻醉小鼠，在无菌条件下打开那些小鼠的腹部。收集腹部皮下脂肪层，弃去内侧的淋巴结，其余组织保存在
‑
20℃下。
[0294]
淋巴周围脂肪组织的总rna提取
[0295]
用鸡卵清蛋白(ova)免疫小鼠，并在30天后收获淋巴结。解剖出与淋巴结相关的脂肪组织。总rna通过总rna分离试剂盒(takara，目录9767)提取。
[0296]
rna
‑
seq
[0297]
我们准备了样品并将其发送至anoroadgenome公司进行rna测序，并通过r语言分析了数据。
[0298]
人外周血单个核细胞(pbmc)的制备
[0299]
制备了用于pbmc培养的培养基：(rpmi1640：dmem：ham's f12＝1：1：2)(erdf)补充了10％fbs。从几个健康的供体(约40毫升/次/人)中收获新鲜的pbmc。如先前在人单克隆抗体书中所述，通过密度梯度离心分离pbmc。用血细胞计数器计数细胞数。
[0300]
体外免疫
[0301]
洗涤pbmc并用10％fbs+erdf稀释。将细胞密度调节至1
×
107细胞/ml，用0.25mm llme处理约20分钟。丢弃上清液，并用10％fbs+erdf重悬细胞。将细胞密度调整为9
×
105cells/ml。将细胞悬浮液转移至96孔板中，并分别加入2ug/ml抗原，10ng/ml il2、50ng/ml il21，cd40l，icos，合成的tlr7/8激动剂。在37℃，5％co2下将组织培养7天。更换培养基的一半，并在第7天添加细胞因子/活化剂混合物。在37℃，5％co2下将细胞培养7
‑
21天。在第7天，第14天或第21天收集上清液，以通过elisa分析抗体的产生，而沉淀物则用于通过pcr或rt
‑
pcr测试基因表达。收集的细胞也用于elispot检测以及facs分析。
[0302]
与抗体增强组合物一起孵育后抗体水平的测量
[0303]
在添加细胞因子或抗体增强组合物和抗原的第7天或第14天之后，收获上清液，并将其添加到抗原ova包被的平板中。温育2小时后，加入带hrp标签的抗人igg或抗人igm，使用tmb作为底物测量抗原特异性抗体的量。数据代表2次重复的平均值。误差棒代表sd。显示了3个独立实验的一个代表性数据。
[0304]
流式分析
[0305]
我们分析了aireii(bd)上的染色细胞，并使用flowjo软件(tree star)处理了流式细胞仪数据。将pbmc收集到snap
‑
lock微管中。为了分析t细胞或b细胞，除非另有说明，将试管保持在4℃。离心后，洗涤细胞并重悬于pbs中。为了分析t滤泡辅助细胞，分别用cd3
‑
fitc(bd)，cd4
‑
percp
‑
cy
tm
5.5(bd)，cxcr5
‑
pe/cy7(biolegend)和cd45ra
‑
pe(ebioscience)抗体对pbmc进行染色。用cd3+cd4+cxcr5+cd45ra
‑
鉴定t卵泡辅助细胞。为了分析类似b细胞
的gc，pbmc用cd19
‑
pe(ebioscience)，gl7
‑
alexa fluor 488(ebioscience)，fas
‑
apc(ebioscience)抗体染色。gc样b细胞定义为cd19+gl7+fas+。
[0306]
逆转录pcr
[0307]
用biorad icycler进行定量rt
‑
pcr，并且使用2
‑
(δδct)方法计算相对于gapdh标准化的相对mrna表达水平。
[0308]
酶联免疫吸附试验
[0309]
将elisa板以5μg/ml的抗原在4℃下包被过夜，并在pbst(含有0.5％tween
‑
20)中洗涤。在添加细胞培养上清液和辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体之前，用5％bsa封闭板(稀释：hrp结合的igg特异性抗体(jackson)和hrp标记的igm特异性抗体的稀释比例为2,500分之一。tmb底物溶液用于测量显色。
[0310]
酶联免疫斑点分析(elispot)
[0311]
将硝酸纤维素的96孔mahas4510板(millipore)在4℃条件下，用50mm碳酸氢钠缓冲液(ph 9.6)(5μg/ml)包被过夜。洗涤板，并在37℃下用rpmi1640中的10％胎牛血清封闭2h。pbmc以3
×
10^5细胞/孔接种，并在37℃下孵育24小时。然后使用与辣根过氧化物酶偶联的2,000倍稀释的山羊抗人igg抗体并在37℃孵育2小时，检测斑点形成细胞(sfc)。通过添加trueblue底物溶液底物(kpl，盖瑟斯堡，马里兰州)评估抗体结合。
[0312]
使用具有关于数据分布和方差特征的适当基础假设的统计检验。除非另有说明，否则使用双向anova来比较不同组的终点均值。使用prism6(graphpad)进行回归和绘图。
[0313]
实施例2：抗体生产刺激因子的效率
[0314]
如wo2018/205917中所述，pbmc的体外扩增包括可在体外培养系统中形成生发中心样结构的产生抗体的b细胞，t细胞，树突细胞和脂肪细胞。已证明il2，il21，icosl，icos，cd40l和toll样受体(tlr)激动剂对b细胞中的抗体产生具有刺激作用。
[0315]
具体地，在体外抗体产生系统中，il2和/或il21促进pbmc的增殖，包括促进b细胞，t细胞和树突细胞群(参见wo2018/205917的图1和3)；il21还促进从igm到igg的类别转换(参见wo2018/205917的图3a
‑
3b)；icosl和icos均可诱导b细胞产生抗体，而icosl和cd40l协同增强igg的产生，而不是单独地靠icosl或cd40l增强(参见wo2018/205917的图2a
‑
2b和4a
‑
4b)。
[0316]
此外，tlr激动剂(例如合成的tlr7/8激动剂和tlr9激动剂)也充当增强的抗体产生的关键因素，结果表明tlr7/8激动剂比cd40l更有效。刺激抗ova抗体的产生(参见wo2018/205917的图6a)。对于igg抗体，tlr7/8激动剂在体外14天比在体外7天和21天更有效(50nm和500nm tlr激动剂效应分别比cd40l高3.5倍和10.0倍)(图6a)
[0317]
wo2018/205917的图10显示了tlr9激动剂cpg odn(2μg/ml)在添加因子后第14天(针对igg和igm)，与cd40l作用类似，刺激抗ova抗体的产生。
[0318]
通过tlr7(咪喹莫特，500nm)激动剂或tlr7/8激动剂增加了aid的表达(通过诱导抗体基因的超突变而参与b细胞亲和力成熟)和blimp
‑
1的表达(表明活性b细胞的增殖和分化)。wo2018/205917的图8和图9均显示，在刺激aicda和blimp
‑
1的表达中，tlr7激动剂和合成的tlr7/8激动剂效果远优于cd40l。在wo2018/205917的图8和图9中还表明，与cd40l相比，tlr7具有通过诱导超突变以及更高的富集抗体变体的优越能力。
[0319]
wo2018/205917的图11a
‑
11c显示低浓度的tlr9拮抗剂e6446(例如0.02μm和0.2μ
m)促进tlr7/8激动剂对抗体igg产生的作用，表明tlr7/8激动剂与低浓度的tlr9拮抗剂e6446之间的协同作用。然而，对于igg和igm产生，高浓度的e6446(10μm)逆转了在7天和14天培养物中tlr7/8激动剂的作用(参见wo2018/205917的图11d
‑
11f)。
[0320]
wo2018/205917的图11g显示了在体外阻断tlr9(分别为0.02μm和0.2μme6446二盐酸盐)后，用tlr7/8激动剂刺激pbmc导致igg应答和细胞活性显着增加，表明tlr7/8激动剂促进树突细胞的激活，其被高浓度的tlr9拮抗剂e6446部分逆转。
[0321]
wo2018/205917的图12a
‑
12i显示il2和il21分别与icos，cd40l或合成的tlr7/8激动剂组合使用，产生协同效应，互补性地增强igg的产生。
[0322]
wo2018/205917的图13a
‑
13f显示icos(24nm，55nm，100nm)，cd40l(10nm，24nm，55nm)，tlr7/8激动剂(0.1nm，50nm，500nm)调节igg和igm应答。在4μg/ml ova，10ng/ml il2和50ng/ml il21存在下，存在剂量依赖性。
[0323]
实施例3：鉴定增强抗体产生的源自脂肪组织的蛋白质
[0324]
在寻找可刺激抗体产生的脂肪组织来源的蛋白质时，进行了rna seq，分析以鉴定在抗原免疫后，与淋巴结相关脂肪组织中上调的基因。通过rna
‑
seq技术对来自免疫或者非免疫的脂肪组织的总rna进行处理，然后进行差异基因表达分析。
[0325]
使用“增加2倍”作为截止标准，免疫后从脂肪组织中总共上调了273个基因(见图1)。在这些基因中，有69个基因编码分泌蛋白。详细分析表明，这些分泌蛋白可分为三类：细胞因子、趋化因子和细胞粘附分子，列于表1。
[0326]
表1免疫后上调的脂肪组织来源的分泌蛋白的完整列表。
[0327]
[0328][0329]
实施例4：脂肪组织来源的分泌蛋白(adsp)在抗体产生中的作用
[0330]
先前的工作已经确定，可以通过将抗原(例如ova)应用于人外周血单核细胞(pbmc)，并与调节因子组合孵育一或两周，从而在体外产生特异性抗体。两个必需因子是il2和il21(在此统称为“基本”或“基本培养基”)。icos，cd40l，tlr7/8激动剂可以进一步刺激抗体产生。为了测试表1中上调的adsp，进行了进一步的实验。
[0331]
在以下所有进行的实验中，使用anova进行统计分析，然后进行特别测试。数据代表3次重复的平均值，误差棒代表sd。***，p<0.001，****，p<0.0001。
[0332]
1.1.白介素的效率
[0333]
测试了示例性细胞因子il1β。pbmc与ova，基础培养基和一些已知的刺激因子icos，cd40l，tlr7/8激动剂或il1β(不同剂量)(1.5
×
10^5细胞/孔，96孔板)在体外孵育。7或14天后，收集上清液，并通过elisa测定法测量igg/igm抗体的产生。图2显示了3个独立实验的代表性数据。通常，il1β在刺激抗体产生方面的作用与tlr7/8激动剂相似，但优于icos和cd40l。
[0334]
1.2.趋化因子的效率
[0335]
1.2.1ccl8
[0336]
除了使用ccl8代替il1β以外，与实施例3第1.1节所述完全相同地进行实验(参见图3)。对于igg生产，ccl8的作用不如tlr7/8激动剂，但优于icos和cd40l。
[0337]
1.2.2cxcl5
[0338]
除了使用cxcl5代替il1β以外，与实施例3第1.1节所述完全相同地进行实验(参见图4)。对于体外培养14天的igg，cxcl5的作用是剂量依赖性的，在20ng/ml时，cxcl5的效果不及tlr7/8激动剂，但优于icos和cd40l。
[0339]
1.3其他adsps的效率
[0340]
除了分别使用cxcl13，ccl4，il27，cxcl16，cxcl2代替il1β以外，与实施例3第1.1节所述的实验完全相同，参见图5。对于14天的体外igg生产，ccl4，il27，cxcl16，cxcl2的效果优于单独的basic。对于体外生产14天的igm，cxcl13，ccl4，il27，cxcl16的效果优于单独的basic。
[0341]
实施例5：体外免疫试验，在adsp存在下产生的抗原特异性抗体
[0342]
为了研究组分在体外免疫系统中的独立功能，进行与实例3第1.1节完全相同的实验。将培养的pbmc用il
‑
1β，ccl8，cxcl5或tlr7/8激动剂r848(1.5
×
10^5细胞/孔，96孔板)处理14天。收获培养基，通过elisa测定法测量ova特异性igg(图6a)或igm(图6b)抗体的产生。通过bsa包被elisa板测量非特异性抗体，以确定它们是否以及与bsa结合的量(图6c)。显示了3个独立实验的代表性数据。统计资料：方差分析(anova)，然后进行事后分析。数据代表3次重复的平均值，误差棒代表sem。**，p<0.01，****，p<0.0001。
[0343]
基于在存在或不存在抗原ova的情况下产生的抗体(抗
‑
ova igg，抗
‑
ova igm和抗
‑
bsa igg)，在“基本培养基”条件下产生的抗体是在没有抗原刺激的情况下产生的那些
抗体，表明它们是非特异性的，并且“基本培养基”可能非特异性地激活产生抗体的b细胞(请参见图6a
‑
6c中的第三幅“单独基本培养基”)，与在抗原ova存在下的抗ova igm和抗bsa igg相比，il
‑
1β可高水平促进抗ova igg的生成，表明il
‑
1β特异性刺激ova特异性b细胞(即抗原特异性b细胞)的激活(参见图6a
‑
6c中的第四个面板“基本+ova”。ccl8和cxcl5在生成抗ova igg和抗ova igm抗体时，可以类似地刺激ova特异性b细胞的激活。
[0344]
实施例6：小鼠中adsps的表达
[0345]
进行该实验以研究在有或没有用ova免疫(10μg/次，8次，参见图7)的情况下，来源于淋巴结的脂肪组织中il
‑
1β、ccl8、cxcl5、il36的表达水平。通过定量rt
‑
pcr和2
‑
(δδot)方法进行定量分析，确定不同因素的mrna水平。从健康的免疫过(样本)或没有免疫(对照)ova的balb/c小鼠收集脂肪组织。actb表达用作内参。显示了3个独立实验的代表性数据。在图7中，使用anova测试进行了统计分析。****，p＜0.0001。
[0346]
虽然已经参考特定实施例(其中一些是优选实施例)具体示出和描述了本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本文公开的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。