检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用

文档序号:26588645发布日期:2021-09-10 20:09阅读:300来源:国知局
检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用

1.本发明属于生物工程技术领域,尤其涉及一种基于mgf360-13l基因检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒、及其应用。


背景技术:

2.非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,asfv)感染引起的一种猪的急性、热性、高度接触性传染病。临床上主要以高热皮肤和内脏器官出血、共济失调和食欲废绝为主要特征,死亡率接近100%。非洲猪瘟是世界动物卫生组织(oie)要求法定报告的动物疫病,我国动物病原微生物名录将其列为一类病。自2018年8月3日中国农村农业部在辽宁省确认非洲猪瘟疫情以来,非洲猪瘟已蔓延至32个省级行政区域,使得近120万头生猪遭到扑杀,对中国养猪业造成了巨大的经济损失,严重威胁畜牧业的健康发展,也给人类公共卫生造成了威胁。asfv属于非洲猪瘟病毒科,非洲猪瘟病毒属,是该科的唯一成员。asfv基因组大小170~190kb,是一种双股dna病毒,编码160~175个基因。用编码vp72蛋白的b646l基因分析不同地区asfv分离株,可以将asfv流行株分为22个主要的基因型,其中流行于中国的主要是基因ii型。
3.目前针对asfv的检测技术主要分为两大类,即基于病毒抗体的免疫学检测方法和基于病毒核酸的pcr检测技术。针对asfv的免疫学检测方法主要有红细胞吸附试验(ha)、直接荧光抗体试验(fat)、酶联免疫吸附试验(elisa)等。免疫学检测方法的优点在于可以准确反应病毒的发生和发展情况。但是,免疫学检测方法试验要求高、费用高、耗时长、敏感性较低。此外,asfv感染早期并不会产生抗体,因此免疫学检测方法的使用受到了局限。近年来,荧光定量pcr由于敏感性高、特异性好、耗时短及定量准确等优点而逐渐被广泛应用。荧光定量pcr主要包括sybr green i法和taqman探针法,taqman探针法相对于sybr green i法具有更高的特异性,应用价值更高。
4.asfv基因组庞大,其基因组中约30%的开放阅读框存在多个拷贝,即多基因家族(multigene families,mgfs),包括mgf100、mgf110、mgf300、mgf360、mgf505(在malawi分离株中命名为530)。mgf编码的多个拷贝提示病毒的选择进化可能与此相关。虽然对mgfs的功能尚待深入研究,但研究已证明mgf在病毒的感染过程中有重要作用。敲除asfv强毒或弱毒株mgf360和530/505的某些基因将导致病毒在巨噬细胞或软蜱体内的复制效率下降,免疫动物后可以提供针对同源病毒或部分异源病毒的保护力;缺失mgf360的10l、11l、12l、13l、14l和mgf530/505-1r、-2r、-3r基因的弱毒株ourt88/3,在体内和体外均可激发较高水平的ifn(interferon)表达,这种缺失毒株可以对某些基因型提供一定的攻毒保护能力;除此之外,同样缺失asfv benin 97/1毒株的上述基因,并使mgf360-9l与mgf 505-4r失活,以此缺失毒株感染猪巨噬细胞可检测到ifn-β的表达水平较原始毒株明显升高,而以这种缺失毒株免疫猪后可以提供一定的免疫保护,且这种保护还与病毒毒力成剂量相关。这些都说明mgf360家族有很大的研究价值,有必要建立针对mgf360家族的检测方法。


技术实现要素:

5.本发明要解决目前缺乏快速、准确检测非洲猪瘟病毒试剂盒的技术问题,提供一种荧光定量rt-pcr检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、及试剂盒,该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对非洲猪瘟病毒(asfv)进行检测。
6.为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:
7.在本发明的一个方面,提供了一种检测非洲猪瘟病毒的引物对,所述引物对是针对seq id no:1所示非洲猪瘟病毒mgf360-13l基因序列或其部分序列设计的引物对。
8.优选的,所述引物对具有如seq id no:2和seq id no:3所示的碱基序列。
9.在本发明的另一方面,还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的探针,所述探针是特异性针对seq id no:1所示非洲猪瘟病毒mgf360-13l基因序列或其部分序列设计的探针。
10.优选的,所述探针具有如seq id no:4所示的碱基序列。
11.所述探针的5’端标记有荧光报告基团,所述探针的3’标记有荧光淬灭基团。
12.在本发明的另一方面,还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒,所述试剂盒包含上述的引物对。
13.优选的,所述试剂盒还包含上述探针。
14.优选的,所述试剂盒还包括:含有seq id no:1所示非洲猪瘟病毒mgf360-13l基因序列的阳性重组质粒标准品。
15.所述试剂盒采用荧光定量pcr方法进行检测。
16.优选的,所述荧光定量pcr的反应条件为:95℃预变性30秒;95℃变性5秒,62℃退火延伸10秒,40个循环。
17.在本发明的另一方面,还提供了上述试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。
18.本发明检测非洲猪瘟病毒的试剂盒,通过基于非洲猪瘟病毒mgf360-13l基因的taqman探针实时荧光定量pcr检测方法对非洲猪瘟病毒进行检测,最低可检测到79copies/μl,其敏感度比常规pcr高100倍,具有广阔的应用前景。
附图说明
19.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
20.图1是本发明实施例1的标准品扩增曲线图;
21.图2是本发明实施例1的标准曲线图;
22.图3是本发明实施例3的敏感性试验结果图;
23.图4是本发明实施例4的asfv-sy18常规pcr敏感性测试结果图;
24.图5是本发明实施例5的特异性试验结果图。
具体实施方式
25.下列实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克j,拉塞尔dw,著,黄培堂,汪嘉玺,朱厚础,等译.分子克隆实验指南,第3版,北京:科学出版社,2002)中所述的方法进行。
26.实施例1非洲猪瘟病毒taqman实时荧光定量pcr检测方法的建立
27.1材料和方法
28.1.1生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可
29.军事兽医研究所根据生物安全3级实验室(bsl-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求,经军事兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、军事医学研究院生物安全委员会、全军实验动物伦理委员会、军事科学院生物安全委员会逐级上报,获得军委后勤保障部卫生局关于开展高致病性asfv病原及动物研究许可,并已在农业农村部备案,符合国家生物安全等级的要求。
30.1.2质粒、毒株与细胞
31.asfv-sy18株由长春军事兽医研究所流行病学与病毒病防控技术实验室保存,重组质粒pet30a-mgf360-13l由本实验室构建,pam细胞由本实验室制备,wsl细胞由本实验室传代保存。感受态细胞dh-5α购自takara公司。
32.1.3主要试剂
33.dl2,000dna marker,premix ex taq(probe qpcr)等购自takara,dna小提试剂盒(axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒)、质粒小提试剂盒(axypreptm plasmid miniprep kit)购自康宁生命科学。
34.1.4引物与探针
35.针对流行毒株asfv-sy-18株的mgf360-13l基因序列(seq id no:1)设计qpcr的特异性引物q13l-f:5
’-
tgtatagatttgggtggtaatg-3’(seq id no:2),q13l-r:5
’-
aaatatccaaagccaaactatg-3’(seq id no:3)和探针13l-probe:5’6-fam-cttt gaagagggtcgtgccatagcgg-3’tamra-n(seq id no:4),目的片段为146bp;针对mgf360-13l基因的asfv常规检测pcr方法为本实验室建立,13l-f:5
’-
cctctcaagc tttgtatggatcgtgg-3’(seq id no:5)和13l-r:5
’-
ctagctgtctacacaactct cggatg-3’(seq id no:6),目的片段为208bp,引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
36.1.5标准品制备
37.以实验室构建的重组质粒pet-30a-mgf360-13l转化后提取质粒,根据其分子量计算浓度并换算成copies/μl,将计算好拷贝数的模板10倍梯度稀释至100copy/μl以制备标准品。
38.1.6反应体系和反应程序的建立与优化
39.按照premix ex taq(probe qpcr)说明书建立最初的taqman实时荧光定量pcr反应体系为20μl,包含premix ex taq(probe qpcr)10μl,q13l-f(10μm)1.0μl,q13l-r(10μm)1.0μl,13l-probe(10μm)1.0μl,以ddh2o补足至20μl。实时荧光定量pcr反应程序为95℃,30s;95℃,5s,60℃,10s,40个循环。以104copies/μl质粒为模板,按照20μl体系进行荧光定量pcr试验以测试建立的反应体系是否可以正常运行。为获得最佳灵敏度,调整实时荧光定量pcr反应的tm值为52℃、54℃、56℃、58℃、62℃、64℃,以测试实时荧光定量pcr反应的最佳反应温度。通过调整引物浓度(0.1μm~1μm)和探针浓度(0.1μm~0.5μm)来建立最佳实时荧光定量pcr的反应条件。
40.1.7荧光定量标准曲线的建立与绘制
41.分别以稀释好的标准品质粒为模板,根据优化好反应条件进行实时荧光定量pcr反应。利用graphpad prism 8软件,根据标准品质粒的拷贝数和实时荧光定量pcr反应的ct
值绘制标准曲线并计算公式。
42.2.结果
43.2.1实时荧光定量pcr反应体系和反应程序的优化
44.为提高实时荧光定量pcr反应的灵敏度,对引物、探针的最佳浓度配比以及tm值进行摸索(表1和表2)。经优化后建立的taqman荧光定量pcr反应体系为:premix ex taqtm(takara,大连)10μl、上/下游引物(13l-f/13l-r,10μm)各2μl、探针(13l-probe,10μm)0.8μl、模板1μl、水补足至20μl。优化后的实时荧光定量pcr方法最佳反应条件为:95℃,30s;95℃,5s,62℃,10s,40个循环。
45.表1不同tm值下的ct值
46.温度52℃54℃56℃58℃60℃62℃64℃ct值23.88
±
1.2925.21
±
0.0324.18
±
0.2823.65
±
0.225.07
±
0.0923.15
±
0.2623.7
±
0.31
47.表2不同探针和引物浓度配比的ct值
[0048][0049]
2.2实时荧光定量pcr标准曲线的建立
[0050]
经过紫外分光光度计测定的质粒溶液质量浓度为112ng/μl,重组质粒长度为6454bp,根据公式计算标准品拷贝数为6.02
×
10
23
copies/mol
×
112ng/μl/(6454
×
660g/mol)=1.58
×
10
10
copies/μl。调整质粒的浓度为1
×
108copies/μl,然后用ddh2o 10倍倍比稀释至1
×
100copy/μl,以这些质粒作为标准品。取1μl稀释好的标准品质粒为模板,按照优化好的实时荧光定量pcr体系进行扩增,标准品质粒108copies/μl~104copies/μl得到的ct值平均数依次是17.25、22.05、25.83、29.6、32.82,扩增曲线如图1所示,使用graphpad prism 8绘制的标准曲线如图2所示。曲线斜率为-3.869,r2=0.9935,直线方程为y=-3.869lgx+48.72(图2)。将待测样品的ct值代入标准曲线方程,即可通过计算得到起始病毒核酸量,以此来达到检测的目的。
[0051]
实施例2实时荧光定量pcr的重复性试验
[0052]
以108copies/μl~104copies/μl浓度的标准品质粒为模板进行实时荧光定量pcr试验,每个样品重复3次,通过计算ct值的变异系数cv来评价建立的实时荧光定量pcr试验的稳定性。
[0053]
将不同拷贝数的标准品(108~104copies/μl)重复测定3次,将试验结果进行统计分析,对建立的实时荧光定量pcr检测方法的重复性进行考查。结果见表3。由表3可知,同一稀释度的ct值差值较小,重复性较好。3次标准曲线具有良好的重复系数和扩增效率。
[0054]
表3实时荧光定量pcr反应的精确度和重复性
[0055][0056]
实施例3实时荧光定量pcr的敏感性试验
[0057]
以108copies/μl~100copy/μl浓度的标准品质粒为模板,以最佳反应条件进行实时荧光定量pcr试验,确定反应的最小检出量。
[0058]
将标准品作连续10倍倍比稀释,分别以108copies/μl、107copies/μl、106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl的重组质粒为模板进行荧光定量pcr反应,以出现阳性曲线所用模板的最高稀释度为其敏感度,结果见图3。由图3可知,建立的实时荧光定量pcr检测方法可检测到的最低质粒浓度1000copies/μl。
[0059]
实施例4实时荧光定量pcr试验和普通pcr试验对比
[0060]
在采用实时荧光定量pcr试验的同时,进行普通pcr反应,比较两种检测方法的敏感性。
[0061]
将病毒滴度为10
7.5
tcid
50
/ml的asfv/sy-18株病毒以未感染asfv的健康猪血清10倍倍比稀释以模拟病毒感染猪后在血液内的状态。取200μl倍比稀释的带毒血清提取dna,分别以普通pcr和实时荧光定量pcr进行检测。结果表明(见表4),建立的实时荧光定量pcr方法最低可以检测到79copies/μl,对应病毒滴度为10
2.5
tcid
50
/ml,ct值为36.58,稀释度为10-5
。同时用普通pcr进行检测,结果表明常规pcr可以检测到稀释度为10-3
的病毒(图4),图4中,m.dl2000 dna marker;1.空白对照;2~9.asfv-sy18 dna连续10倍倍比稀释后,从10-7~
100,使用普通pcr的mgf360-13l引物进行常规pcr检测。因此建立的实时荧光定量pcr方法敏感度比常规pcr高100倍。
[0062]
表4以asfv-18的dna为模板的敏感性试验
[0063][0064]
实施例5实时荧光定量pcr的特异性试验
[0065]
以建立的实时荧光定量pcr方法对常见的猪传染病毒包括猪伪狂犬病毒(prv)、猪蓝耳病病毒(prrs)、猪瘟病毒(csfv)、猪细小病毒(ppv)、猪圆环病毒(pcv2)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪腺病毒(padv)、猪副流感病毒5型(piv5)进行检测,以评价引物和探针的特异性。将实验室保存的病毒组织样品与含1%牛血清0.1mol/l pbs(ph值为7.2)溶液混
合,在研钵中研磨后取200μl上清液备用。利用axyprep体液病毒dna/rna小量试剂盒(康宁,吴江)提取dna病毒和rna病毒的核酸。rna病毒的核酸进行反转录以获得cdna,反转录体系如下:rnase ribonuclease inhibitor(索莱宝,北京),2μl;5
×
m-mlv buffer,4μl;m-mlv reverse transcriptase(takara,大连),1μl;random primers(100μm)(takara,大连),1μl;dntp(10mm),1μl;rna模板+depc水,10μl。反应程序为30℃,10min;42℃,60min;70℃,10min。取病毒dna或者cdna 2μl为模板进行实时荧光定量pcr反应。每次检测时设定阳性对照和阴性对照,当阴性对照实验结果为阴性,阳性对照实验结果为阳性时整个试验有效,可进一步判定结果。
[0066]
结果:利用建立的实时荧光定量pcr方法,以实验室收集保存的7种猪源病毒(分别为:猪传染性肠胃炎病毒(tgev)、伪狂犬病毒(prv)、蓝耳病病毒(prrs)、圆环病毒(pcv2)、细小病毒(ppv)、猪腺病毒(padv)、猪副流感病毒5型(piv5))的dna或者cdna为模板,利用建立的实时荧光定量pcr引物和探针进行荧光定量pcr扩增反应,同时以去离子水为模板设立阴性对照并且以重组质粒为阳性对照,以优化好的实时荧光定量pcr体系和程序进行试验。结果显示只有阳性对照出现荧光报告信号,其他均未出现,表明建立的实时荧光定量pcr检测方法具有较好的特异性(图5)。
[0067]
实施例6采用本发明建立的非洲猪瘟病毒的taqman探针实时荧光定量pcr方法检测临床样品
[0068]
采集11份田间猪肉样品,常规方法提取dna,取2μl作为模板,以建立好的taqman探针实时荧光定量pcr方法进行检测,结果全为阴性。
[0069]
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1