一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法与流程

1.本发明涉及生物发酵以及抗菌肽领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法。


背景技术：

2.由于抗生素的广泛应用，病原微生物对抗生素产生了抗性，致使超级细菌的出现，过去十年中新抗生素的发展步伐变慢，进一步加剧了当前的全球挑战。由于抗菌肽的长度、序列和结构复杂多样造就了它具有新颖独特的两亲性结构性质，加之具有抑菌谱广、低抗药性、热稳定性高和分子量小等功能，被视为抗生素的优良替代品。枯草芽孢杆菌代谢产生肽类抗生素，通常这些抗生素的肽链多呈闭合环状，几乎没有游离的氨基和羧基，不能被蛋白酶分解，活性肽稳定性较强。
3.抗菌肽是微生物细胞次级代谢产物，分子量在2000-7000da左右，这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。与抗生素相比，抗菌肽安全性高，对人和动物正常细胞无害，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类生物防腐剂，在医药工业、食品工业以及饲料工业中有广阔的应用前景。
4.在食品防腐领域，我国与国际上一些发达国家相比技术上和普及方面还有不小的差距。传统的食品保鲜方法主要采用化学防腐剂或腌渍（糖、醋、盐等）、熏制、干燥等物理手段，但是这些会导致食品安全、品质及风味改变等问题。而天然防腐剂具有毒副作用小、可降解、使用安全等优点，渐渐有取代传统化学防腐剂的趋势。天然防腐剂的开发已经得到国内很多研究者的重视。在天然防腐剂中，抗菌肽类防腐剂由于其安全无毒害，甚至对人体有保健作用而受到人们的广泛关注，正在成为食品防腐保鲜领域的新宠。
5.随着经济的发展，人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受到广泛关注，长期以来抗生素作为有害菌生长抑制剂在动物饲料及饲料添加剂中大量使用，久而久之抗生素耐药性及抗生素残留问题不断被暴露出来，目前人们对其使用所产生的副作用——药物残留、耐药性和环境污染等问题日益关注，抗生素在饲料业中已面临着被淘汰或禁用的局面，欧盟在2006年已经全面禁止将抗生素作为饲料添加剂用于饲料中。因此研制具有广谱、无毒、无公害、无残留的新型抗菌剂代替抗生素作饲料添加剂已成为当前国内外饲料科学研究的一项重要的内容。我国是畜禽产品生产的大国，但是，由于各方面的原因，我国目前尚未全面禁止饲用抗生素，而且目前我国生产的多数抗生素饲料添加剂为国外已淘汰或将被禁用的产品，如喳乙醇、阿散酸、杆菌肽锌、泰乐菌素、维吉尼亚霉素等，这严重影响了我国畜禽产品对外出口。据有关部门统计，我国每年因此损失达到上百亿美元，造成了巨大的经济损失，严重影响了我国畜牧业的发展，更为严重的是还损害了我国畜产品在国际上的声誉，面对全球研发环保型高效饲料添加剂的大潮，加快相关方面的研究已势在必行。
6.由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，近年微生物生产抗菌肽的研究开始兴起，但当前研究主要集中在乳酸菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等问题，如何解决这些问题，还有待进一步研究，芽孢杆菌和类芽孢杆菌产
生的抗菌肽普遍抑菌谱广、稳定性高，引起广泛关注，目前对抗菌肽的提取多是从植物或者昆虫体内获取，而对芽抱杆菌发酵产生制备抗菌肽的的报道并不多，同时实现其产业化应用的则更加少之又少。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在问题以及在枯草芽孢杆菌发酵生产抗菌肽中的不足，本发明提供一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法。
8.为了实现上述目的，本发明提供的代谢产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株由公司研发中心进过长期分离纯化实验筛选制备，并命名为qr-kj-092。
9.本发明所述菌株的主要生物学特征为：好氧菌，细胞大小(0.6μm～0.8μm)
×
(1.8μm～2.5μm)，菌体呈杆状，菌体单个存在，无荚膜，周生硬毛、能运动的革兰氏阳性菌；菌落表面粗糙不透明；培养基上的菌落圆或者不规则形，表面色暗，变厚和不透明，有褶皱，菌落呈现奶油色或微黄色，发酵培养能够利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、淀粉、植物蛋白、动物源蛋白，能水解淀粉、色氨酸；生长温度范围35℃～55℃，最适温度为40℃。
10.同时本发明首先提供一种枯草芽孢杆菌保藏培养基及发酵培养基。
11.所述枯草芽孢杆菌保藏培养基由以下质量百分比成分组成：蔗糖2%、蛋白胨0.5%、牛肉浸膏1.5%、nacl 0.1%、k2hpo
4 0.5%、琼脂2%，ph7.0。
12.所述枯草芽孢杆菌发酵培养基由以下质量百分比成分组成：葡萄糖10%、酵母浸膏0.75%、豆粕5%、玉米浆干粉1%、氯化钠0.15%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸锰0.02%，调节发酵液ph7.0。
13.本发明同时还提供一种抗菌肽发酵生产方法，其发酵生产方法主要包含以下几个步骤：（1）产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株活化；（2）50l一级种子罐及500l二级种子罐制备；（3）5t发酵罐发酵培养，利用以上所述枯草芽孢杆菌发酵培养基培养枯草芽孢杆菌代谢产生抗菌肽。
14.所述步骤（1）所述产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株编号qr-kj-092。
15.所述步骤（2）先用制备好的斜面母种，在无菌条件下接种，用接种环挑取两环于150ml三角瓶母种培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得一级三角瓶种子液；将一级种子液以2.5%的接种量（体积百分比），接种到5l种子液体培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得二级三角瓶种子液；将二级三角瓶种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到50l液体种子罐培养基中，于42℃，罐压0.05mpa，通气量2.5m3/h条件下培养35h；将50l液体种子罐种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到500l液体种子罐中，于42℃，罐压0.05mpa，通气量30m3/h条件下培养35h；所述步骤（3）将500l液体种子罐发酵种子液按照2.5%（体积百分比）的接种量接种到5t发酵罐中，于42℃，罐压0.05mpa，通气量50m3/h条件下培养35h。
16.（4）本发明还提供抗菌肽制备方法：a．发酵液的预处理，将步骤（3）发酵液采用gq105管式离心机，设定转速16000r/min离
心，去除菌泥，收集上清液，即得含抗菌肽上清液；b．将步骤a得到的含抗菌肽上清液加入0.1mol/l的hcl溶液，将溶液ph调节至上清液大量出现沉淀，收集沉淀，去掉上清液；c．利用0.02mol/l的磷酸盐缓冲液溶解步骤b得到的含抗菌肽沉淀物质，得到初步处理的粗抗菌肽溶液；d．浓缩步骤c制备的粗抗菌肽溶液，利用截留分子量1000-2000da的超滤膜浓缩粗抗菌肽溶液，过夜，弃滤液，得到浓缩液；e．25℃下向浓缩液中慢慢加入硫酸铵至10%饱和度，4℃静置2h，然后采用8500r/min离心10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入硫酸铵至60%饱和度，4℃静置4h，12000r/min离心20min，收集沉淀，然后采用0.02mol/l的tris-hcl缓冲液溶解；f．将步骤e制备的抗菌肽溶液进一步采用1000da透析袋透析，每隔4h，更换一次去离子水，得透析完全抗菌肽溶液；g．抗菌肽sephadexg50凝胶柱层析分离纯化，将步骤f透析得到的抗菌肽溶液进行sephadexg50凝胶柱层析，控制流速0.5ml/min，以 0.02mol/l磷酸盐缓冲液作为洗脱液，收集层析液，得到进一步纯化的抗菌肽溶液；h．抗菌肽纯品粉剂制备，将步骤g制备的抗菌肽溶液，在-0.15pa，45℃条件下浓缩至原体积的1/3倍，然后采用真空冷冻干燥法去除抗菌肽溶液中的水分，设定冷冻温度-40℃，真空0.24mpa，按照程序升温，干燥时间44h，即得抗菌肽粉剂产品。
17.所述步骤h，程序升温，其具体过程为，一次升华阶段：（1）程序-40-0℃升温，时长5h；（2）程序0-5℃，时长12h；（3）程序5-10℃升温，时长10h；（4）程序10-20℃升温，时长3h；解析干燥阶段：程序20-30℃升温，时长6h。
18.qr-kj-092产抗菌肽的效价测定采用琼脂打孔扩散法测定发酵液抗菌肽效价，以大肠杆菌为指示菌，制备效价平板。然后用打孔器（直径2.7mm）打孔，每孔分别加入10μl qr-kj-092菌株抗菌肽：抗菌肽效价测定方法：抗菌效价=2
x
×
1000
×
稀释倍数式中x=（抑菌圈直径-2.7）/2.1（梁洁,彭中键,梁淑娃等.转基因酵母菌深层发酵生产抗菌肽的研究[j]．现代食品科技,2009,25(6):639-640）。
[0019]
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽的制备方法，本发明提供的菌株为本公司筛选的特异活性菌株，并通过大量实验实现菌株的发酵量产。
[0020]
本发明通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、抗菌肽提取与精制、抗菌肽干粉制备等工艺方法制备高纯抗菌肽粉剂成品，大大提高了纯化效率。
[0021]
本发明利用超滤、盐析、凝胶层析相结合，提高了抗菌肽的制备效率。
附图说明
[0022]
图1 sephadexg50凝胶柱层析分离纯化枯草芽孢杆菌抗菌肽图谱。
[0023]
图2 sephadexg50凝胶柱层析枯草芽孢杆菌抗菌肽鉴定图。
[0024]
图3标准蛋白质的色谱图。注：1：胰岛素，2：酵母核糖核酸，3：杆菌肽，4：还原性谷
胱甘肽。
[0025]
图4枯草芽孢杆菌抗菌肽色谱图。
具体实施方式
[0026]
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数达到满足自身实际设备条件的工艺配方。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，这些都可视为本发明保护内容。
[0027]
本发明一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法将通过具体实施例进行描述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0028]
实施例1本发明代谢产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株保藏培养基：蔗糖2%、蛋白胨0.5%、牛肉浸膏1.5%、nacl 0.1%、k2hpo
4 0.5%、琼脂2%，ph7.0。
[0029]
枯草芽孢杆菌发酵培养基由以下质量百分比成分组成：葡萄糖10%、酵母浸膏0.75%、豆粕5%、玉米浆干粉1%、氯化钠0.15%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸锰0.02%，调节发酵液ph7.0。
[0030]
所述枯草芽孢杆菌培养条件：所述步骤先用制备好的斜面母种，在无菌条件下接种，用接种环挑取两环于150ml三角瓶母种培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得一级三角瓶种子液；将一级种子液以2.5%的接种量（体积百分比），接种到5l种子液体培养基中，在40℃，150r/min培养1.5d，制得二级三角瓶种子液；将二级三角瓶种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到50l液体种子罐培养基中，于42℃，罐压0.05mpa，通气量2.5m3/h条件下培养35h；将50l液体种子罐种子液以2.5%（体积百分比）的接种量接种到500l液体种子罐中，于42℃，罐压0.05mpa，通气量30m3/h条件下培养35h；所述步骤（3）将500l液体种子罐发酵种子液按照2.5%（体积百分比）的接种量接种到5t发酵罐中，于42℃，罐压0.05mpa，通气量50m3/h条件下培养35h。
[0031]
实施例2本发明提供一种枯草芽孢杆菌发酵产抗菌肽工艺及制备方法，含抗菌肽发酵液处理工艺如下：a．发酵液的预处理，将步骤（3）发酵液采用gq105管式离心，去除菌泥，收集上清液，即得含抗菌肽上清液；步骤a所述发酵液离心条件为：转速16000r/min，采用循环水降温方式控制离心温度20℃，流速5l/min。
[0032]
b．将步骤a得到的含抗菌肽上清液加入0.1mol/l的hcl溶液，将溶液ph调节至上清液大量出现沉淀，收集沉淀，去掉上清液；c．利用0.02mol/l的磷酸盐缓冲液溶解步骤b得到的含抗菌肽沉淀物质，得到初步处理的粗抗菌肽溶液。
[0033]
实施例3
本发明提供枯草芽孢杆菌抗菌肽分离纯化工艺，其过程步骤如下：a．浓缩粗抗菌肽溶液，利用截留分子量1000-2000da的超滤膜浓缩粗抗菌肽溶液，过夜，弃滤液，得到浓缩液；b．25℃下向浓缩液中慢慢加入硫酸铵至10%饱和度，4℃静置2h，然后采用8500r/min离心10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入硫酸铵至60%饱和度，4℃静置4h，12000r/min离心20min，收集沉淀，然后才采用0.02mol/l的tris-hcl缓冲液溶解；c．将制备的抗菌肽溶液进一步采用1000da透析袋透析，每隔4h，更换一次去离子水，得透析完全抗菌肽溶液；d．将透析得到的抗菌肽溶液进行sephadexg50凝胶柱层析，控制流速0.5ml/min，以 0.02mol/l磷酸盐缓冲液作为洗脱液，收集层析液，得到进一步纯化的抗菌肽溶液。
[0034]
实施例4本发明提供一种枯草芽孢杆菌抗菌肽粉剂生产工艺，具体实施步骤如下：a．将抗菌肽溶液通过低压浓缩设备进行浓缩；所述抗菌肽低压浓缩条件为：开启真空泵将低压浓缩设备真空度调至-0.15pa，微开蒸汽阀门控制管道压力0.15mpa，使得抗菌肽溶液温度维持在45℃，在此条件下将抗菌肽溶液体积浓缩至原体积的1/3倍。
[0035]
b．枯草芽孢杆菌抗菌肽浓缩液采用真空冷冻干燥法去除抗菌肽溶液中的水分；所述真空冷冻干燥工艺条件：冷冻温度-40℃，真空0.24mpa，按照程序升温，干燥时间44h，即得抗菌肽粉剂产品。
[0036]
上述步骤所述程序升温，其具体过程为，一次升华阶段：（1）程序-40-0℃升温，时长5h；（2）程序0-5℃，时长12h；（3）程序5-10℃升温，时长10h；（4）程序10-20℃升温，时长3h；解析干燥阶段：程序20-30℃升温，时长6h。
[0037]
实施例5本发明提供枯草芽孢杆菌抗菌肽液相检测抗菌肽分子量方法，测定条件如下：a．流动相及波长的选择试验分别以甲醇-水，乙腈-水，甲醇-kh2po4为流动相，并用乙酸调节各流动相的ph，使其ph在6.5左右，设定柱温30℃，流速0.6ml/min，进样量10μl，并设定各个流动相的不同洗脱条件进行全波长扫描，测定其出峰效果，以得出准确的出峰效果良好的色谱条件，由实验可知以甲醇-kh2po4为流动相，甲醇:kh2po4=55:45，波长为254nm时出峰效果良好，故本试验选择甲醇:kh2po4=55:45为流动相，波长为254nm的色谱条件。
[0038]
b．流速的选择在波长为254nm，流动相为甲醇:kh2po4=55: 45，柱温为30℃，进样量为10μl的条件下，设定流速分别为1.0ml/min、0.8ml/min、0.6ml/min，当流速为0.6 ml/min时色谱峰峰形和标准物质分离效果良好，故本试验选用流速为0.6 ml/min。
[0039]
c．标准曲线与回归方程经实验测得各标准品胰岛素、杆菌肽、酵母核糖核酸、还原性谷胱甘肽保留时间分别为：2.591min、4.834min、5.653min、7.894min对其进行回归分析得标准蛋白质的回归方程：log(mw) =-0.2548t + 4.3753，r2 = 0.9983。回归方程决定系数0.9983，说明蛋白质的相对分子质量的常用对数与其色谱峰保留时间具有良好的线性关系，因此可作为多肽相对分
子质量测定的标准曲线。
[0040]
d．样品的测定用实验建立的方法对分离得到的枯草芽孢杆菌抗菌肽分子量进行测定。以相同的色谱条件对枯草芽孢杆菌抗菌肽进行液相色谱测定，经测定本发明得到的枯草芽孢杆菌抗菌肽分子量范围为1290-8490da。
[0041]
实施例6，本发明提供枯草芽孢杆菌抗菌肽抗菌效价评价试验。
[0042]
取1g冻干抗菌肽粉剂，用0.2mol/l磷酸盐溶液溶解至溶液浓度0.01g/l，采用琼脂打孔扩散法测定发酵液抗菌肽效价，以大肠杆菌为指示菌，制备效价平板。然后用打孔器（直径2.7mm）打孔，每孔分别加入10μl qr-kj-092菌株抗菌肽，贴在涂金黄色葡萄球菌的胰蛋白胨大豆琼脂培养基、涂大肠杆菌营养琼脂培养基、黄曲霉营养琼脂中，在37℃培养箱中恒温培养20h，观察并用游标卡尺量取抑菌圈的直径。
[0043]
抗菌肽效价测定方法：抗菌效价=2
x
×
1000
×
稀释倍数式中x=（抑菌圈直径-2.7）/2.1。
[0044]
表1.菌株抑菌效果比较（单位：mm） 金黄色葡萄球菌大肠杆菌黄曲霉抑菌圈直径18.16
±
0.2222.09
±
0.257.76
±
1.14实施例7，枯草芽孢杆菌抗菌肽饲喂试验。
[0045]
选取嘉兴附近公司合作的养殖基地作为本发明饲喂试验基地，选用1日龄健康579鸡苗600只(体重差异不显著，p》0. 05)，采用单因子完全随机试验设计，随机分为5个处理组分别编号a、b、c、d、e，每个处理组设6个重复，每个重复20只鸡，试验方案如下表。
[0046]
表2.枯草芽孢杆菌抗菌肽饲喂试验方案试验分组处理方案抗菌肽添加量a基础日粮+5mg/kgafb11g/kgb基础日粮1g/kgc基础日粮+螺旋霉素1g/kgd基础日粮+立克次氏体+5mg/kgafb11g/kge基础日粮0g/kg空白对照组（e）饲喂基础日粮（基础日粮中不含抗生素和抗菌肽），抗生素对照组(ac)在基础日粮中添加5mg/kg的黄霉毒素，试验工在基础日粮中添加抗菌肽1g/kg，经过20d饲喂，实验组b平均日增重最高，较ac组提高4.85%，实验组a、c、d组的平均日采食较b组也有下降趋势，但差异不显著，实验组b组的料重比a、c、d组降低3.16%，较对照组e也降低4.06%。