一种衍生化试剂及其合成方法以及基于MALDI-MS原位分析单胺类神经递质的方法

一种衍生化试剂及其合成方法以及基于maldi-ms原位分析单胺类神经递质的方法
技术领域
1.本发明属于生物分析化学领域，涉及一种胺类神经递质类化合物的衍生化技术，具体涉及一种单胺类神经递质化合物的衍生化试剂及其合成方法以及基于maldi-ms原位分析单胺类神经递质的方法，利用衍生试剂的基团提高单胺类化合的电离效率，结合质谱技术，分析检测生物样品中的单胺类化合物的方法。


背景技术：

2.小分子神经递质，例如儿茶酚胺多巴胺(da)，5-羟色胺(5-ht)和酪氨酸(tyr)，是神经元之间传递信号的关键化学物质。许多正常神经元过程与它们相关，例如睡眠和衰老，以及许多疾病，包括阿尔茨海默氏病，帕金森氏症疾病(pd)，抑郁，吸毒和注意力缺陷多动症。通过观察这些神经递质在脑中相对丰度和分布，能更好了解复杂的神经系统过程。
3.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-ms)具有分析速度快、信噪比高、信号重现性好、质量范围宽以及适合分析复杂样品的优点，目前已它已经在快速分析生物大分子(核酸，蛋白质，多肽等)和聚合物上取得了巨大的成功。这些优势保证了maldi技术成为生物化学领域不可或缺的分析技术手段，同时，为解决各种复杂生物问题提供了强有力的支持。在药物开发中，它的优点是能够检测化合物如生物标志物，未使用药物及其代谢物放射性同位素或抗体标记，方法的缺点是要依靠可电离的分析物。
4.随着神经递质研究的增加，辅助基质和衍生化试剂正在扩展，允许检测更多种类的分析物。从碱金属离子到小分子药物和代谢产物，脂质和多肽。低丰度和/或难以电离的化合物在组织样品中分析具有挑战性，因为脂质和其他解吸/电离抑制剂的存在，可以大大降低对目标化合物的检测限。以神经递质类化合物为例，ms难以电离儿茶酚胺和单胺类及其代谢产物。目前，已经开发了几种选择性衍生化方法提高解吸/电离效率并改善maldi分析的检出限。吡啶盐容易和伯胺选择性地反应形成吡啶阳离子。这种衍生化方法极大地提高了maldi成像检测神经递质的灵敏度。因此开发一种小分子神经递质衍生化的方法是分析复杂神经系统过程的重要前提，相关研究结果将为神经科学的研究提供重要参考信息。
5.由于单胺类神经递质在maldi中较难解析/电离，需要给目标化合物衍生化提高其电离效率，提高胺类神经递质的检出限。因此，发展一种胺类神经递质的衍生化试剂，便于ms检测并作为帮助其激光诱导解吸的有效基质电离将是一个重大突破。


技术实现要素：

6.针对上述背景技术中提出的问题，本发明提供了一种单胺类神经递质化合物的衍生化试剂及其合成方法以及基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法，本发明提供了新的单胺类神经递质类化合物的衍生化方法，合成了新的单胺类化合物的衍生化试剂，旨在选择性靶向针对化合物的伯胺基团，以同时衍生胺类神经递质及其前体和代谢物，提高单胺类神经递质化合物的电离效率，提高了生物样品中目标分析物的解吸/电离效率并改善
maldi分析的检出限。
7.本发明提供一种以3-溴硫代苯酚为原料合成的衍生化试剂，对单胺类神经递质化合物进行衍生化，并利用maldi-ms技术检测分析生物样品中的胺类神经递质。具体的，本发明第一个方面提供、一种单胺类神经递质的衍生化试剂，其特征在于，所述衍生化试剂的结构式如下所示：
[0008][0009]
本发明第二个目的是提供单胺类神经递质的衍生化试剂合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0010]
步骤1)、将多聚磷酸，3-溴硫代苯酚和3-(4-甲氧基苯基)-3-氧代丙酸乙酯搅拌均匀，在75-95℃条件下反应得到混合物；
[0011]
步骤2)、待步骤1)的混合物冷却至室温后，加入冰水使反应淬灭；
[0012]
步骤3)用二氯甲烷或者氯仿萃取三次，将萃取液合并得到有机萃取液；
[0013]
步骤4)、将步骤3)的有机萃取液用na2so4干燥，过滤，得到粗产物，粗产物通过闪蒸色谱法纯化得到纯化后产物；
[0014]
步骤5)、将步骤4)纯化后的产物，加入三二亚苄基丙酮二钯，2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯和碳酸铯在密闭条件下，加入无水二恶烷，然后加入二乙胺，在100℃下搅拌反应12-18h，得到反应混合物；
[0015]
步骤6)、将步骤5)中的反应混合物冷却至室温后，过滤，将粗产物通过闪蒸色谱法纯化得到衍生化试剂。
[0016]
在本发明的技术方案中，多聚磷酸，3-溴硫代苯酚和3-(4-甲氧基苯基)-3-氧代丙酸乙酯三者之间的质量比为11：1：1.3；
[0017]
优选的，步骤1)中，搅拌时间为1-2h。
[0018]
在本发明的技术方案中，步骤4)中，所述闪蒸色谱法采用闪蒸柱纯化，闪蒸柱为硅胶柱，溶剂为石油醚和二氯甲烷，体积比0-1:1。
[0019]
在本发明的技术方案中，步骤5)中，纯化后的产物，三二亚苄基丙酮二钯，2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯和碳酸铯之间的摩尔比为1mmol：0.025mmol：0.025mmol：2.5mmol；
[0020]
优选的，步骤5)中，纯化后的产物、无水二恶烷和二乙胺的用量的比例为1：为1mmol：5ml：520μl。
[0021]
在本发明的技术方案中，步骤6)中，所述闪蒸色谱法采用闪蒸柱纯化，闪蒸柱为硅胶柱，第一次闪蒸溶剂为石油醚和二氯甲烷，体积比为0-1:1，第二次闪蒸溶剂为丙烯酸乙酯和二氯甲烷，体积比为1：10。
[0022]
本发明的第三个目的是提供基于maldi-ms的原位分析单胺类神经递质的方法，所述方法为单胺类神经递质与上述制备得到的衍生化试剂发生衍生反应，得到的衍生化产物利用maldi-ms系统进行检测分析。
[0023]
在本发明的技术方案中，所述单胺类神经递质包括多巴胺、5-羟基色胺、酪氨酸；优选的，所述单胺类神经递质的来源包括动物脑组织、脑微渗析液、脑脊液。所述衍生化试剂以甲醇或乙腈为溶剂配置成溶液使用；衍生化试剂溶液浓度为10-20mg/ml；三乙胺调节ph范围为7-9。
[0024]
在本发明的技术方案中，基于maldi-ms的原位分析单胺类神经递质的方法，包括以下步骤：
[0025]
步骤一、将单胺类神经递质待测样品加入甲醇或乙腈得到单胺类神经递质溶液，浓度为0.5-2μg/ml；
[0026]
步骤二、向单胺类神经递质溶液中加入衍生化试剂反应，得到的衍生化产物经滤膜过滤后，然后用maldi-ms系统分析检测；
[0027]
优选的，步骤二中，反应温度为室温，反应ph为8-10。
[0028]
在本发明的技术方案中，所述maldi-ms分析条件为：质谱全扫描范围为m/z 300～700da，激光强度为35％，正离子反射模式；激光激发源是波长355nm和脉冲2khz的nd:yag固态smartbeam激光器。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030]
与已有的神经递质检测方法相比，本发明提供的基于衍生化测定单胺类神经递质的检测方法优点在于：(1)本发明合成的新的单胺类神经递质化合物的衍生化试剂能有效针对单胺类神经递质化合物衍生化，提高单胺类神经递质化合物的在质谱中的电离效率。(2)单胺类神经递质化合物与制备得到的衍生化试剂的衍生反应具有稳定性，效率高，操作简单，制备成本低等优点。(3)衍生反应的衍生条件在室温进行，无需添加其他基质辅助。(4)实现了组织中多种神经递质同时分析，具有高精确性。因此，本发明在代谢组学和疾病预防诊断方面具有潜在应用价值。
附图说明
[0031]
图1是本发明单胺类神经递质化合物的衍生化试剂的合成路线图；
[0032]
图2是本发明实施例2将小鼠脑组织的单胺类胺类神经递质衍生化后的质谱图。
具体实施方式
[0033]
下面结合实施例以及对比例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。具体包括以下实施例：
[0034]
实施例1
[0035]
本发明单胺类神经递质化合物的衍生化试剂的合成路线图如图1所示，具体合成方法，包括以下步骤：
[0036]
步骤1)在95℃下将多聚磷酸(ppa，22g)，3-溴硫代苯酚(2g，10.6mmol)和3-(4-甲氧基苯基)-3-氧代丙酸乙酯(2.6g，11.66mmol)的混合物在烧杯中搅拌2h。
[0037]
步骤2)待步骤1)的混合物冷却至室温后，加入冰水使反应淬灭。
[0038]
步骤3)用100ml二氯甲烷萃取三次，将萃取液合并。
[0039]
步骤4)将步骤3)中的有机萃取液用na2so4干燥，过滤，粗产物通过闪蒸柱进一步纯化。
[0040]
步骤5)将步骤4)纯化后的产物(347mg,1mmol)装入试管，加入三二亚苄基丙酮二钯，(22.3mg，0.025mmol)，2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯(9.8mg，0.025mmol)和cs2co3(815mg，2.5mmol)。
[0041]
步骤6)密闭试管，加入无水二恶烷(5ml)，然后加入二乙胺(520μl，5mmol)，在100℃下搅拌反应18h。
[0042]
步骤7)将步骤6)中反应好混合物冷却至室温后，过滤，将粗产物通过闪蒸色谱法进一步纯化，纯化后的产物用甲醇溶解成浓度为20mg/ml的衍生化试剂溶液。
[0043]
实施例2
[0044]
本实施例选取使用取自小鼠的脑组织进行胺类神经递质的检测，质谱分析仪是ultraflextreme型号的maldi-tof/ms为bruker公司的，衍生化试剂采用实施例1制备得到的浓度为20mg/ml的衍生化试剂溶液，检测包括以下步骤：
[0045]
步骤一、将小鼠的脑加入300ml甲醇，用磁珠打浆机进行匀浆，持续30秒。
[0046]
步骤二、将匀浆物以10000rpm在4℃下离心30分钟，收集上清液并通过0.20mm滤膜。
[0047]
步骤三、向过滤后的上清液加入衍生化试剂溶液，反应温度为室温，用三乙胺用于调节ph为8-10，然后直接用于基质辅助激光解吸电离飞行时间(maldi-tof-ms)分析。
[0048]
其中，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析条件为：质谱全扫描范围为m/z 300～700da，激光强度为35％，正离子反射模式；激光激发源是波长355nm和脉冲2khz的nd:yag固态smartbeam激光器。
[0049]
将小鼠脑组织的单胺类胺类神经递质衍生化后的质谱图如图2所示，从图2中可以看出衍生化试剂能与胺类神经递质反应并其产物能在maldi-ms上出峰。
[0050]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0051]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。