技术特征：
1.一种方法，包括：使多核苷酸与模板杂交，以及使与所述多核苷酸互补的多个核苷酸中的5'最末端核苷酸相邻的第一模板核苷酸5'端与聚合酶和带电荷标签的核苷酸接触，其中所述带电荷标签的核苷酸与所述第一模板核苷酸互补，并且包括连接到所述带电荷标签的核苷酸的5'端多磷酸的电荷标签。2.根据权利要求1所述的方法，还包括用所述聚合酶将所述带电荷标签的核苷酸连接到所述多核苷酸，其中所述连接包括将所述电荷标签从所述带电荷标签的核苷酸分离。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述模板结合到基底。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述聚合酶结合到基底。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述模板和所述聚合酶结合到基底。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述聚合酶选自klenow片段和phi29聚合酶。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述模板连接到基底并且包括连接核苷酸，并且其中所述连接核苷酸在所述第一模板核苷酸和所述基底之间。8.根据权利要求7所述的方法，其中存在超过20个连接核苷酸。9.根据权利要求7所述的方法，其中存在1至20个连接核苷酸。10.根据权利要求7所述的方法，其中存在10至20个连接核苷酸。11.根据权利要求7所述的方法，其中存在1至10个连接核苷酸。12.根据权利要求7所述的方法，其中存在1至5个连接核苷酸。13.根据权利要求7所述的方法，其中存在5至10个连接核苷酸。14.根据权利要求7所述的方法，其中存在10至15个连接核苷酸。15.根据权利要求7所述的方法，其中存在15至20个连接核苷酸。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述基底是固体载体传导通道，并且所述传导通道在使所述第一模板核苷酸与所述带电荷标签的核苷酸接触并将所述带电荷标签的核苷酸连接到所述多核苷酸期间检测所述带电荷标签的核苷酸。17.根据权利要求16所述的方法，包括在溶液中连接所述带电荷标签的核苷酸，其中所述电荷标签包括在所述溶液中的德拜长度，并且所述德拜长度介于约0.5nm和约10nm之间。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述带电荷标签的核苷酸为式i的化合物
其中n为3至10的整数，m为1至10的整数，t为0至50的整数，x1为直接键、c1‑
c
10
烷基、c1‑
c
10
氧杂烷基、c1‑
c
10
硫杂烷基或者c1‑
c
10
氮杂烷基，x2为c1‑
c
20
烷基，其中任选地一个或多个ch2残基单独地被肽键或(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
取代，其中a为1至24的整数，x3为直接键或寡核苷酸，a为a为或酰胺键，并且y选自：q为1至100的整数，并且b选自：氨基酸；核苷酸；其中每个r独立地选自y和氢；以及树枝化基元；并且其中当b为树枝化基元时，q等于1，并且所述q个b具有电荷和电荷密度。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
100e和约+100e之间。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
100e/立方纳米和约+100e/立方纳米之间。21.根据权利要求18所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
200e和约+200e之间。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
200e/立方纳米和约+200e/立方纳米之间。23.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中b包括q个核苷酸并且q大于1。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述多核苷酸选自分支多核苷酸和一个或多个发夹环。25.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述q个b包括多肽。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述多肽选自分支多肽、卷曲多肽和卷曲螺旋多肽。27.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中b包括氨基酸，并且所述q个b中的一个或多个b包括甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸或三甲基赖氨酸。28.根据权利要求18至22中任一项所述的方法，其中b为包括一个或多个结构重复单元和多个末端单元的z代树枝化基元，其中z为1至6的整数，所述结构末端单元选自：其中p1为1至3的整数，其中所述p1‑
ch2‑
基团中的任一个或多个基团任选地被1至3个
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
基团取代，p2为1至3的整数，其中所述p2‑
ch2‑
基团中的任一个或多个基团任选地被1至3个
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
基团取代，并且所述端基选自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基基团、氨基基团和季铵基团。29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中a通过包括连接反应的反应形成，并且所述连接反应选自叠氮
‑
炔烃铜辅助的点击反应、四嗪
‑
反式环辛烯连接、叠氮
‑
二苯并环辛炔基团无铜点击反应和硫醇
‑
马来酰亚胺缀合。30.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中x2为(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
，其中a为1至24的整数。31.根据权利要求30所述的方法，其中a为24。32.根据权利要求30所述的方法，其中a为16。33.根据权利要求30所述的方法，其中a为12。34.根据权利要求30所述的方法，其中a为8。35.根据权利要求30所述的方法，其中a为4。36.根据权利要求18至35中任一项所述的方法，其中所述模板连接到基底并且包括连接核苷酸，其中所述连接核苷酸在第二模板核苷酸和所述基底之间，并且x3包括寡核苷酸，其中当所述电荷标签接近所述基底时，所述寡核苷酸与多个所述连接核苷酸杂交。37.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述带电荷标签的核苷酸为式i的化合物
其中n为3至10的整数，m为1至10的整数，t为0至50的整数，x1为直接键、c1‑
c
10
烷基、c1‑
c
10
氧杂烷基、c1‑
c
10
硫杂烷基或者c1‑
c
10
氮杂烷基，x2为c1‑
c
20
烷基，其中任选地一个或多个ch2残基单独地被肽键或(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
取代，其中a为1至24的整数，x3为直接键或寡核苷酸，a为a为或酰胺键，并且y选自y选自q为1至100的整数，b包括氨基酸，并且所述q个b具有电荷和电荷密度。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
100e和约+100e之间。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
100e/立方纳米和约+100e/立方纳米之间。40.根据权利要求37所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
200e和约+200e之间。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
200e/立方纳米和约+200e/立方纳米之间。42.根据权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述q个b包括多肽。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述多肽选自分支多肽、卷曲多肽和卷曲螺旋多肽。44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述q个b中的一个或多个b包括甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸或三甲基赖氨酸。45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其中所述多肽为包括一个或多个叉的分支多肽，所述一个或多个叉中的每个叉包括多个分支，并且所述多个分支中的一个或多个分支各自独立地包括多个氨基酸。46.根据权利要求45所述的方法，其中所述多肽包括三个或更多个叉，并且所述多个分支中的一个或多个分支的氨基酸数目为至少四个。47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述多肽包括七个或更多个叉。48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述多个分支中的一个或多个分支的氨基酸数目为至少六个。49.根据权利要求37至48中任一项所述的方法，其中a通过包括连接反应的反应形成，并且所述连接反应选自叠氮
‑
炔烃铜辅助的点击反应、四嗪
‑
反式环辛烯连接、叠氮
‑
二苯并环辛炔基团无铜点击反应和硫醇
‑
马来酰亚胺缀合。50.根据权利要求37至49中任一项所述的方法，其中x2为(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
，其中a为1至24的整数。51.根据权利要求50所述的方法，其中a为24。52.根据权利要求50所述的方法，其中a为16。53.根据权利要求50所述的方法，其中a为12。54.根据权利要求50所述的方法，其中a为8。55.根据权利要求50所述的方法，其中a为4。56.根据权利要求37至62中任一项所述的方法，其中所述模板连接到基底并且包括连接核苷酸，其中所述连接核苷酸在第二模板核苷酸和所述基底之间，并且x3包括寡核苷酸，其中当所述电荷标签接近所述基底时，所述寡核苷酸与多个所述连接核苷酸杂交。57.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述带电荷标签的核苷酸为式i的化合物其中n为3至10的整数，m为1至10的整数，
t为0至50的整数，x1为直接键、c1‑
c
10
烷基、c1‑
c
10
氧杂烷基、c1‑
c
10
硫杂烷基或者c1‑
c
10
氮杂烷基，x2为c1‑
c
20
烷基，其中任选地一个或多个ch2残基被肽键或(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
取代，其中a为1至24的整数，x3为直接键或寡核苷酸，a为a为或酰胺键，并且y选自选自q为1至100的整数，并且b选自：核苷酸；其中每个r独立地选自y和氢；并且所述q个b具有电荷和电荷密度。58.根据权利要求57所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
100e和约+100e之间。59.根据权利要求58所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
100e/立方纳米和约+100e/立方纳米之间。60.根据权利要求57所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
200e和约+200e之间。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
200e/立方纳米和约+200e/立方纳米之间。62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，其中b包括q个核苷酸并且q大于1。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述多核苷酸选自分支多核苷酸和一个或多个发夹环。64.根据权利要求62所述的方法，其中所述多核苷酸包括介于两个和五个之间的发夹环。65.根据权利要求57至64中任一项所述的方法，其中a通过包括连接反应的反应形成，并且所述连接反应选自叠氮
‑
炔烃铜辅助的点击反应、四嗪
‑
反式环辛烯连接、叠氮
‑
二苯并
环辛炔基团无铜点击反应和硫醇
‑
马来酰亚胺缀合。66.根据权利要求57至65中任一项所述的方法，其中x2为(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
，其中a为1至24的整数。67.根据权利要求66所述的方法，其中a为24。68.根据权利要求66所述的方法，其中a为16。69.根据权利要求66所述的方法，其中a为12。70.根据权利要求66所述的方法，其中a为8。71.根据权利要求66所述的方法，其中a为4。72.根据权利要求57至71中任一项所述的方法，其中所述模板连接到基底并且包括连接核苷酸，其中所述连接核苷酸在第二模板核苷酸和所述基底之间，并且x3包括寡核苷酸，其中当所述电荷标签接近所述基底时，所述寡核苷酸与多个所述连接核苷酸杂交。73.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述带电荷标签的核苷酸为式i的化合物其中n为3至10的整数，m为1至10的整数，t为0至50的整数，x1为直接键、c1‑
c
10
烷基、c1‑
c
10
氧杂烷基、c1‑
c
10
硫杂烷基或者c1‑
c
10
氮杂烷基，x2为c1‑
c
20
烷基，其中任选地一个或多个ch2残基单独地被肽键或(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
取代，其中a为1至24的整数，x3为直接键或寡核苷酸，a为a为或酰胺键，并且
y选自y选自q为1，并且b包括树枝化基元，并且b具有电荷和电荷密度。74.根据权利要求73所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
100e和约+100e之间。75.根据权利要求74所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
100e/立方纳米和约+100e/立方纳米之间。76.根据权利要求73所述的方法，其中所述电荷介于约
‑
200e和约+200e之间。77.根据权利要求76所述的方法，其中所述电荷密度介于约
‑
200e/立方纳米和约+200e/立方纳米之间。78.根据权利要求73至77中任一项所述的方法，其中b为包括一个或多个结构重复单元和多个末端单元的z代树枝化基元，其中z为1至6的整数，所述结构末端单元选自：其中p1为1至3的整数，其中所述p1‑
ch2‑
基团中的任一个或多个基团任选地被1至3个
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
基团取代，p2为1至3的整数，其中所述p2‑
ch2‑
基团中的任一个或多个基团任选地被1至3个
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
基团取代，并且所述端基选自羧酸、磺酸、膦酸、精胺基基团、氨基基团和季铵基团。79.根据权利要求73至78中任一项所述的方法，其中a通过包括连接反应的反应形成，并且所述连接反应选自叠氮
‑
炔烃铜辅助的点击反应、四嗪
‑
反式环辛烯连接、叠氮
‑
二苯并环辛炔基团无铜点击反应和硫醇
‑
马来酰亚胺缀合。80.根据权利要求73至7879中任一项所述的方法，其中x2为(
‑
o
‑
ch2‑
ch2‑
)
a
，其中a为1至24的整数。81.根据权利要求80所述的方法，其中a为24。82.根据权利要求80所述的方法，其中a为16。83.根据权利要求80所述的方法，其中a为12。84.根据权利要求80所述的方法，其中a为8。85.根据权利要求80所述的方法，其中a为4。86.根据权利要求73至85中任一项所述的方法，其中所述模板连接到基底并且包括连
接核苷酸，其中所述连接核苷酸在第二模板核苷酸和所述基底之间，并且x3包括寡核苷酸，其中当所述电荷标签接近所述基底时，所述寡核苷酸与多个所述连接核苷酸杂交。87.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中所述模板还包括与所述第一模板核苷酸相邻的第二模板核苷酸5'端，所述方法还包括：使所述第二模板核苷酸与带荧光标签的核苷酸接触，其中所述带荧光标签的核苷酸与所述第二模板核苷酸互补但不与所述第一模板核苷酸互补，以及用聚合酶将所述带荧光标签的核苷酸连接到所述多核苷酸。88.根据权利要求87所述的方法，还包括通过测量从所述多核苷酸发射的荧光来测量所述带荧光标签的核苷酸与所述多核苷酸的连接。89.根据权利要求88所述的方法，还包括在测量之前从所述模板洗脱所述多核苷酸。
技术总结
本发明提供了一种方法，该方法包括使多核苷酸与模板杂交，以及使与该多核苷酸互补的多个核苷酸中的5'最末端核苷酸相邻的第一模板核苷酸5'端与聚合酶和带电荷标签的核苷酸接触，其中该带电荷标签的核苷酸与该第一模板核苷酸互补，并且包括连接到该带电荷标签的核苷酸的5'端多磷酸的电荷标签。酸的5'端多磷酸的电荷标签。酸的5'端多磷酸的电荷标签。
技术研发人员：赵燕楠 K
受保护的技术使用者：伊鲁米纳新加坡有限公司
技术研发日：2020.08.18
技术公布日：2021/9/9