使用双特异性结合剂降解表面蛋白相关申请的交叉引用1.本技术要求2019年11月1日提交的美国临时申请号62/929,674的权益，将所述临时申请通过引用并且出于所有目的以其整体并入本文。对以ascii文件形式提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的引用2.将文件048536-670001wo_sequencelisting_st25中编写的序列表(创建于2020年10月30日，213,455字节，机器格式ibm-pc，mswindows操作系统)通过引用特此并入。关于联邦政府资助研发的声明3.本发明是在由美国国立卫生研究院(thenationalinstitutesofhealth)授予的资助p41ca196276和r35gm122451下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本发明的一定权利。
技术领域：
：4.本公开文本总体上涉及使用泛素通路用于降解细胞上的表面蛋白的新方法和药剂。本公开文本还提供了可用于产生此类药剂、编码其的核酸、用所述核酸基因修饰的宿主细胞的方法，以及用于调节细胞活性和/或用于治疗多种疾病如癌症的方法。
背景技术：
：：5.恶性赘生性细胞通常表达具有增殖或免疫抑制作用的表面蛋白。例如，一些肿瘤过表达刺激增殖的生长因子受体(如her2或her3)。免疫检查点蛋白(如pd-l1和ctla-4)的过表达可以抑制天然免疫反应。这允许恶性细胞繁殖并且逃避宿主免疫系统，导致肿瘤形成。6.当前的疗法使用这样的抗体和抗体衍生物解决所述问题，所述抗体和抗体衍生物特异性结合这些表面蛋白并且在结合的同时抑制其活性。然而，对于通过增加对抗癌症的反应的作用和/或抵抗具有增殖性或免疫抑制作用的表面蛋白而具有更好的作用(例如，更持久的作用)和/或靶向癌细胞或赘生细胞的疗法存在需要。本文提供的公开文本解决了这些问题，并且也提供了另外的解决方案。7.本文引用的所有参考文献和专利均通过引用以其全文特此并入，就好像在本文中完全阐述一样。技术实现要素：8.本公开文本描述了使用泛素通路促进靶表面蛋白的去除和降解的新治疗方法和药剂。本文描述了结合靶表面蛋白和膜相关泛素e3连接酶二者的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂的结合导致所述靶表面蛋白的泛素化及其随后的降解。本文还描述了具有靶表面蛋白结合结构域的e3连接酶衍生物，当所述e3连接酶衍生物存在于所述靶细胞的质膜中时，所述连接酶衍生物导致靶表面蛋白的泛素化。9.本公开文本的一方面是一种双特异性结合剂，所述结合剂包含与e3连接酶特异性结合的第一结合结构域；和与靶细胞的靶蛋白上的细胞外表位特异性结合的第二结合结构域，其中所述e3连接酶和所述靶蛋白二者均是膜相关的。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂与所述e3连接酶和所述靶蛋白二者的结合导致所述靶蛋白的泛素化。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述靶细胞是赘生性细胞。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述细胞是选自以下的癌细胞：乳腺癌、b细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、间皮瘤、肺癌、非霍奇金b细胞l(b-nhl)、黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、膀胱癌和结直肠癌，一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述靶蛋白是免疫检查点蛋白。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述靶蛋白选自pd-l1、pd-1、ctla-4、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag3、nkg2d、tim-3、vista和siglec7。在一些实施方案中，所述双特异性结合剂的第一结合结构域特异性结合至与附接至e3连接酶的细胞外蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性结合剂的第一结合结构域特异性结合至与e3连接酶相互作用的跨膜蛋白。在双特异性结合剂的某些实施方案中，其中所述靶蛋白的降解降低了所述靶细胞增殖的能力。一些蛋白质(例如，a2ar)会调节免疫系统，即它会增强cd8免疫反应和增殖。在双特异性结合剂的某些实施方案中，其中靶蛋白选自her2、cd19、cd20、pd-l1、egfr、ctla-4、mmp14和cdcp1。10.在其他实施方案中，所述双特异性结合剂的e3连接酶包含跨膜蛋白。例如，在一些实施方案中，所述e3连接酶包括跨膜e3连接酶。在一些示例性实施方案中，所述e3连接酶选自rnf43、rnf128(grail)、znrf3和march11。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域和所述第二结合结构域各自独立地选自半抗体、单结构域抗体、纳米抗体、单特异性fab2、scfv、scfv-fc、微型抗体、ignar、v-nar、hcigg、vhh、骆驼抗体和肽抗体，或者所述第一结合结构域和所述第二结合结构域一起形成双特异性抗体、双特异性双抗体、双特异性fab2、双特异性骆驼抗体或双特异性肽抗体。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂包含双特异性抗体。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂包含双特异性igg。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述双特异性结合剂包含杵臼双特异性igg。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域包含fab，并且所述第二结合结构域包含单链fab。一个实施方案是这样的双特异性结合剂，其中所述第一结合结构域包含fab，并且所述第二结合结构域包含scfv。在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含seqidno.:12或320中所示的重链框架区(fr)序列和seqidno.:11或319中所示的轻链fr序列。在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含seqidno.:12或320中所示的重链fr序列和seqidno.:11或319中所示的轻链fr序列。11.在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含含有分别在表2中示出的序列的轻链可变结构域cdr3(lc-cdr3)序列和重链可变结构域cdr1(hc-cdr1)、hc-cdr2和hc-cdr3序列。在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含含有分别在表3中示出的序列的lc-cdr3序列和hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3序列。12.在一些实施方案中，所述双特异性结合剂的第一结合结构域包含重链可变结构域(vh)，并且其中所述vh包含seqidno.:321中所示的fr序列；并且所述双特异性结合剂的第二结合结构域包含seqidno.:12或320中所示的重链fr序列和seqidno.:11或319中所示的轻链fr序列。13.在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含分别在表4中示出的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3序列，并且所述第二结合结构域包含含有分别在表3中示出的序列的lc-cdr3序列和hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3序列。14.本公开文本的一方面是一种核酸，所述核酸编码任一种双特异性结合剂，所述结合剂包含与e3连接酶特异性结合的第一结合结构域；和与靶细胞的靶蛋白上的细胞外表位特异性结合的第二结合结构域，其中所述e3连接酶和所述靶蛋白二者均是膜相关的。一个实施方案是进一步包含载体的核酸。一个实施方案是进一步包含启动子的核酸，所述启动子与编码双特异性结合剂的序列可操作地连接。15.本公开文本的一方面是一种包含核酸的载体，所述核酸编码上述或本文所示的任一种双特异性结合剂。一个实施方案是进一步包含启动子的载体，所述启动子与编码双特异性结合剂的序列可操作地连接。16.本公开文本的一方面是一种免疫缀合物。在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含本文公开的双特异性结合剂和小分子。在其他实施方案中，所述免疫缀合物进一步包含接头。在某些实施方案中，所述接头选自可切割接头、不可切割接头、亲水性接头和基于二羧酸的接头。在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含dbco-peg4-cgs21680，其中dbco用于缀合，peg4是接头，并且cgs21680是小分子。在一些实施方案中，所述免疫缀合物包含dbco-peg4-胺。在一些实施方案中，所述小分子包含胺、cgs21680、氧杂吖丙啶叠氮化物、zm241385、普乐沙福、马拉韦罗和阿拉韦洛。然而，应当理解，小分子可以是本领域技术人员认为合适的任何小分子。17.本公开文本的一方面是一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和本文阐述的双特异性结合剂、本公开文本的免疫缀合物；或本文阐述的核酸。一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述双特异性结合剂与所述e3连接酶和所述靶蛋白二者的结合导致所述靶蛋白的泛素化。一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述靶细胞是赘生性细胞。一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述细胞是选自以下的癌细胞：乳腺癌、b细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌、间皮瘤、肺癌、非霍奇金b细胞l(b-nhl)、黑色素瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、膀胱癌和结直肠癌，一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述靶蛋白是免疫检查点蛋白。一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述靶蛋白选自pd-l1、pd-1、ctla-4、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag3、nkg2d、tim-3、vista和siglec7。一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述靶蛋白的降解降低了所述靶细胞增殖的能力。一个实施方案是这样的药物组合物，其中所述靶蛋白选自her2、cd19、cd20、pd-l1、egfr、ctla-4、mmp14和cdcp1。18.本公开文本的一方面是一种工程化细胞，所述工程化细胞包含能够蛋白质表达的细胞和编码双特异性结合剂的核酸。一个实施方案是这样的工程化细胞，其中所述细胞是b细胞、b记忆细胞或浆细胞。19.本公开文本的一方面是一种治疗受试者的赘生性疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开文本的双特异性结合剂、本公开文本的核酸、本公开文本的药物组合物或本公开文本的工程化细胞。20.本公开文本的一方面是一种通过以下方式制造本公开文本的双特异性结合剂的方法：提供能够蛋白质合成的细胞(所述细胞包含编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸)并且诱导所述双特异性结合剂的表达。21.本公开文本的一方面是一种工程化跨膜蛋白，所述工程化跨膜蛋白用于治疗其中靶蛋白存在于赘生性细胞或免疫细胞表面的赘生性疾病，所述工程化跨膜蛋白包含与特异于所述靶蛋白的靶蛋白结合结构域连接的膜相关e3连接酶。一个实施方案是这样的工程化跨膜蛋白，其中所述e3连接酶和所述靶蛋白结合结构域共价连接。一个实施方案是这样的工程化跨膜蛋白，其中所述e3连接酶和所述靶蛋白结合结构域以融合蛋白表达。一个实施方案是这样的工程化跨膜蛋白，其中所述e3连接酶和所述靶蛋白结合结构域通过二硫键共价连接。一个实施方案是这样的工程化跨膜蛋白，其中所述靶蛋白结合结构域特异于选自以下的靶蛋白：her2、egfr、mmp14、cdcp1、pd-l1、pd-1、ctla-4、cd19、cd20、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag3、nkg2d、tim-3、vista和siglec7。22.本公开文本的一方面是一种核酸，所述核酸编码本公开文本的工程化跨膜蛋白。一个实施方案是进一步包含载体的核酸。一个实施方案是这样的核酸，所述核酸进一步包含与编码所述工程化跨膜蛋白的序列可操作地连接的启动子。23.本公开文本的一方面是一种组合物，所述组合物用于治疗其中靶蛋白存在于所述赘生性细胞表面的赘生性疾病，所述组合物包含治疗量的本公开文本的工程化跨膜蛋白和促融合载体，其中所述载体能够与所述赘生性细胞质膜融合。一个实施方案是这样的组合物，其中所述载体是促融合脂质体。24.本公开文本的一方面是一种组合物，所述组合物用于治疗其中靶蛋白存在于所述赘生性细胞表面的赘生性疾病，所述组合物包含治疗量的编码本公开文本的工程化跨膜蛋白的核酸和药学上可接受的载体，其中所述载体能够将所述核酸递送至所述赘生性细胞胞质溶胶中。一个实施方案是这样的组合物，其中所述载体包括病毒颗粒、脂质体或外泌体。一个实施方案是这样的组合物，其中所述载体包括病毒颗粒。一个实施方案是这样的组合物，其中所述载体包括脂质体。一个实施方案是这样的组合物，其中所述载体包括外泌体。25.本公开文本的一方面是以下项用于治疗赘生性疾病的用途：本公开文本的双特异性结合剂；编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸；本公开文本的工程化跨膜蛋白；编码本公开文本的工程化跨膜蛋白的核酸；包含本公开文本的双特异性结合剂、编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸、本公开文本的免疫缀合物的药物组合物；本公开文本的工程化跨膜蛋白或编码本公开文本的工程化跨膜蛋白的核酸；编码本公开文本的双特异性结合剂或本公开文本的工程化跨膜蛋白的载体；或包含编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸的工程化细胞。26.本公开文本的一方面是以下项制造用于治疗赘生性疾病的药剂的用途：本公开文本的双特异性结合剂；编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸；本公开文本的免疫缀合物；本公开文本的工程化跨膜蛋白；编码本公开文本的工程化跨膜蛋白的核酸；包含本公开文本的双特异性结合剂、编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸、本公开文本的工程化跨膜蛋白、或编码本公开文本的工程化跨膜蛋白的核酸的药物组合物；编码本公开文本的双特异性结合剂或本公开文本的工程化跨膜蛋白的载体；或包含编码本公开文本的双特异性结合剂的核酸的工程化细胞。27.前述
发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。附图说明28.图1示意性地描绘了与膜相关e3连接酶rnf43和目的靶表面蛋白(“poi”)结合的本公开文本的双特异性结合剂(在这里，示例性双特异性抗体)，和poi的细胞内泛素化。29.图2示意性地描绘了具有gfp结合结构域和膜相关e3连接酶结构域的工程化跨膜蛋白，以及包含细胞内nanoluc结构域和细胞外gfp结构域的膜结合报告基因构建体。通过工程化跨膜蛋白结合gfp结构域促进了nanoluc结构域的细胞内泛素化，从而导致其降解和信号损失。30.图3示意性地描绘了具有“杵臼”构型的本公开文本的双特异性igg抗体。31.图4a示出了使用本公开文本的双特异性igg从三阴性乳腺癌细胞系(mda-mb-231)中去除并且降解pd-l1的实验的结果，。图4a示出了pd-l1水平不受抗rnf43抗体(r3igg)或抗pd-l1抗体的影响，但是通过使用10nm的本公开文本的双特异性抗rnf43/pd-l1igg持续24小时而被显著降低或消除。图4b示出了使用相同细胞和双特异性igg的剂量反应，表明最大pd-l1降解是用10nm双特异性igg实现的。32.图5a、图5b和图5c比较了在三种不同的癌细胞系上本公开文本的双特异性igg和(阿特珠单抗)的pd-l1降解活性。两种药剂均以10nm应用24小时。图5a示出了双特异性igg显著降解mda-mb-231细胞(三阴性乳腺癌模型)中的pd-l1，而阿特珠单抗未促进pd-l1表达的降解或下调。图5b示出了双特异性igg显著降解hcc827细胞(非小细胞肺癌模型)中的pd-l1，而阿特珠单抗未导致pd-l1表达的降解或下调。图5c示出了双特异性igg显著降解t24细胞(晚期膀胱癌模型)中的pd-l1，然而阿特珠单抗未促进pd-l1表达的显著降解或下调。33.图6是条形图，其示出了本公开文本的双特异性igg对从三阴性乳腺癌细胞系(mda-mb-231)降解pd-l1的作用。34.图7示出了每个ala突变体的合并生物层干涉法(bli)图。35.图8示出了降解百分比与koff之间的相关性。36.图9示出了降解百分比与kd之间的相关性。37.图10示出了降解百分比与kon之间的相关性。38.图11示出了抗rnf43丙氨酸突变体的蛋白质印迹。所述突变体因其kd而被标记为rnf43。12.5nm是wt，40nm是s113a并且125nm是f115a。39.图12示出了与膜相关e3连接酶和目的蛋白(poi)结合的免疫缀合物的示意图。40.图13是产生免疫缀合物的缀合程序的示例性示意图示。41.图14示出了本公开文本中使用的一些示例性小分子。42.图15示出了免疫缀合物降解剂的24h处理后，molt-4ccr5+细胞中腺苷2a受体(a2ar)的剂量依赖性降解。43.图16示出了在molt-4ccr5+细胞中在cgs21680(激动剂)24h处理后的a2ar水平。具体实施方式44.本公开文本总体上涉及结合剂，包括双特异性结合剂和工程化跨膜蛋白、及其免疫缀合物，它们与膜相关泛素e3连接酶和存在于靶细胞表面上的靶表面蛋白二者结合。在一些实施方案中，本公开文本提供了双特异性结合剂，所述双特异性结合剂与膜相关泛素e3连接酶和存在于靶细胞表面上的靶表面蛋白二者结合。在其他实施方案中，本公开文本提供了基于修饰的膜相关e3连接酶的工程化跨膜蛋白，所述工程化跨膜蛋白具有靶表面蛋白结合结构域。45.在一些实施方案中，本公开文本提供了产生某些类型的构建体中的每一种(如双特异性igg、一个臂上具有单链fab的双特异性igg、和fab-scfv融合体)的示例性方法。本公开文本提供了测试双特异性ig、一个臂上具有单链fab的双特异性igg、和fab-scfv融合体的方法。在一些实施方案中，本公开文本表明本公开文本的双特异性结合剂能够在各种临床相关的细胞系中降解其靶标。46.在一些实施方案中，本公开文本提供了降解靶蛋白的工程化跨膜蛋白的合成和测试。在某些实施方案中，本公开文本表明本文提供的工程化跨膜蛋白可能导致靶蛋白的内化和溶酶体聚集。因此，本公开文本表明本文提供的工程化跨膜蛋白可以用于诱导内源性蛋白质的蛋白质降解。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了产生用于将工程化跨膜蛋白插入靶细胞中的aav转染载体的方法。47.在一些实施方案中，本公开文本表明在所提供的结合剂与其靶标之间的强大结合亲和力可能是有利的。本文还提供了包含本公开文本的双特异性结合剂和工程化跨膜蛋白的免疫缀合物。在一些实施方案中，本公开文本表明，包含本公开文本的结合剂的免疫缀合物可以被招募到靶标并且诱导其降解。48.本公开文本还提供了编码所述双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的核酸，和包含所述双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白和/或编码所述双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的核酸的治疗组合物，以及包含所述核酸的细胞。本公开文本还提供了使用双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白、免疫缀合物、编码双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的核酸、或包含所述双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、免疫缀合物和/或编码所述双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的核酸的治疗组合物的治疗方法。本公开文本还提供了可用于产生此类药剂、编码其的核酸、用所述核酸基因修饰的宿主细胞的组合物和方法，以及用于调节细胞活性和/或用于治疗多种疾病如癌症的方法。49.在以下具体实施方式中，参考了附图(其构成本发明的一部分)。在附图中，除非上下文另有规定，否则相同的符号通常指示相同的部件。具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性替代方案并不意味着限制。可以使用其他替代方案，并且可以在不背离这里呈现的主题的精神或范围的情况下进行其他改变。容易理解，如本文通常描述的并且在附图中示出的方面可以以各种不同的配置进行布置、替代、组合和设计，所有这些都是明确地预期的并且构成本技术的一部分。定义50.除非上下文明确指示其他含义，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。本文中使用“a和/或b”来包括所有的以下替代形式：“a”、“b”、“a或b”以及“a和b”。51.如本文可互换使用，术语“施用”(“administration”和“administering”)是指通过包括但不限于以下的施用途径来递送组合物或配制品：静脉内、动脉内、脑内、鞘内、肌肉内、腹膜内、皮下、肌肉内及其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行施用和自我施用。52.术语“宿主细胞”和“重组细胞”在本文中可互换使用。应理解，此类术语以及“细胞培养物”、“细胞系”不仅指特定的主题细胞或细胞系而且还指这种细胞或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑传代次数。应理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍包括在如本文所用的所述术语的范围内，只要所述后代保留与原始细胞或细胞系相同的功能性即可。53.如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以其预期方式操作。54.术语“异源的”是指在核酸构建体或嵌合多肽中彼此可操作地连接或以其他方式连接的核酸序列或氨基酸序列，所述核酸序列或氨基酸序列在自然界中彼此不是可操作地连接的或彼此不是相连的。55.在两个或更多个核酸或蛋白质的上下文中，如本文所用的术语“同一性百分比”是指相同的两个或更多个序列或子序列或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)的两个或更多个序列或子序列，如使用采用如下所述的默认参数的blast或blast2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量。参见例如，在ncbi.nlm.nih.gov/blast的ncbi万维网站。此定义也指或可能应用于测试序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。序列同一性典型地相对于长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域，或相对于长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域，或相对于给定序列的整个长度进行计算。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如gcs程序包(devereux等人,nucleicacidsres(1984)12:387)、blastp、blastn、fasta(atschul等人,jmolbiol(1990)215:403)。可以使用序列分析软件以所述软件的默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如universityofwisconsinbiotechnologycenter(威斯康星州麦迪逊，大学大道1710号，53705)的geneticscomputergroup的序列分析软件包。56.关于疾病或病症所用的术语“治疗”意指至少实现了与折磨个体的病症相关的症状的改善，其中改善在广义上用来指至少减小与正在治疗的病症相关的参数(例如症状)的量级。治疗还包括这样的情况，其中病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制，例如防止发生或完全消除，使得宿主不再遭受病症或至少不再遭受表征病症的症状。因此，治疗包括：(i)预防(即，降低临床症状发展的风险，包括导致临床症状不发展，例如防止疾病进展)，以及(ii)抑制(即阻止临床症状的发展或进一步发展，例如缓解或完全抑制活动性疾病)。57.如本文所用，并且除非另有说明，否则药剂的“治疗有效量”是足以在治疗或管理癌症方面提供治疗益处或者延迟或最小化与癌症相关的一种或多种症状的量。治疗有效量的化合物是指单独或与其他治疗剂组合的一定量的治疗剂，其在治疗或管理癌症方面提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善癌症的整体疗法、减轻或避免癌症的症状或原因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。“有效量”的例子是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以被称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，lieberman,pharmaceuticaldosageforms(第1-3卷,2010)；lloyd,theart,scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding(2016)；pickar,dosagecalculations(2012)；以及remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第22版,2012,gennaro编辑,lippincott,williams&wilkins)。58.如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”可以是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如癌症)和/或疾病的一种或多种症状的人患者或个体。所述受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为具有目的病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠)和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。59.术语“衍生物”、“其功能片段”或“其功能变体”是指与所述片段或衍生物所来源的野生型分子共同具有生物学活性的分子。抗体的功能片段或功能变体是这样的，其保留与衍生所述功能片段或功能变体的抗体基本上相同的结合至相同表位的能力。例如，能够与细胞表面受体的表位结合的抗体可以在n末端和/或c末端处截短，并且使用本领域技术人员已知的测定评估其表位结合活性的保留。抗体衍生物可以进一步包括通常基于抗体的通用结合特性的构建体，而不直接与现有抗体相似。例如，人们可以筛选结合所希望的靶标的适当的基于噬菌体的文库，以获取不基于现有抗体的结合剂(如纳米抗体和scfv药剂)。60.在提供了一系列值时，应理解的是每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文清晰地另外指示)，所述范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在所述陈述范围内的中间值均被涵盖在本公开文本之内。这些更小范围的上限和下限可独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在本公开文本之内，服从于陈述的范围内的任何明确排除的界限。当陈述的范围包括一个或两个界限时，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开文本中。61.本文公开的所有范围还涵盖任何且所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围均可以识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员将理解的，如“最高”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞都包括所列举的数字并且涉及随后可以分解为如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个制品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等等。62.应了解，为明确起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征还可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。63.尽管本公开文本的特征可以在单个实施方案的上下文中描述，但所述特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，虽然为了清楚起见，本公开文本可以在多个单独的实施方案的情况下在本文中描述，但是本公开文本也可以在单个实施方案中实施。本文引用的任何已公开的专利申请以及任何其他已公开的参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用出于任何目的并入本文。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。此外，材料、方法以及实施例仅是说明性的并且不意在是限制性的。泛素64.真核细胞中蛋白质降解的主要通路涉及靶向细胞蛋白的泛素化用于快速蛋白水解。泛素化是一种高度调节的翻译后过程，它经由将泛素共价转移到靶蛋白的赖氨酸残基上而发生。泛素的附接是通过以下三类酶的合作作用介导的：泛素激活酶(e1)、泛素缀合酶(e2)和泛素蛋白连接酶(e3)。泛素激活酶e1在atp依赖性过程中激活泛素，以在泛素的c末端甘氨酸与e1活性位点处的半胱氨酸残基之间形成硫酯连接。然后将激活的泛素转移到泛素缀合酶e2的半胱氨酸残基。随后泛素蛋白连接酶e3促进了泛素从e2酶转移到蛋白质底物的赖氨酸残基。由于人基因组编码两种e1酶、约40种e2酶和多于800种e3连接酶，因此e3连接酶主要负责在蛋白质降解过程中赋予底物特异性。因此，操纵e3连接酶的底物特异性提供了一种重定向细胞降解机制用于目的蛋白的靶向蛋白质水解的方法。本公开文本的组合物65.如下文更详细描述的，本公开文本提供了可用于降解存在于靶细胞表面上的靶表面蛋白的结合剂，如本文提供的双特异性结合剂和工程化跨膜蛋白。不受任何特定理论束缚，这些药剂被设计为通过结合靶表面蛋白和膜相关e3连接酶二者来发挥作用，使得所述靶表面蛋白被泛素化并且因结合而被降解。还公开了具有膜相关e3连接酶结构域和靶表面蛋白结合结构域的工程化跨膜蛋白。不受任何特定理论束缚，这些药剂被设计为通过结合靶表面蛋白来发挥作用，使得所述靶表面蛋白通过膜相关e3连接酶结构域被泛素化并且因结合而被降解。66.如本文实施例中所述，在肿瘤细胞系中已经测试并且验证了双特异性结合剂和工程化跨膜蛋白。不受任何特定理论束缚，设想这些新的药剂在小鼠模型和其他哺乳动物细胞以及哺乳动物受试者(包括人)中示出了相似的性能。可以将本文公开的药剂引入各种细胞类型中来创建工程化细胞，用于增强的肿瘤辨别和消除。因此，工程化为表达本文公开的药剂的一种或多种的工程化细胞也在本公开文本的范围内。双特异性结合剂结构67.本公开文本的双特异性结合剂含有两个结合结构域：一个特异于膜相关e3连接酶，并且另一个特异于靶表面蛋白。本公开文本的双特异性结合剂包括但不限于这样的药剂：其中e3连接酶结合结构域和靶表面蛋白结合结构域各自独立地选自抗体(或半抗体)、纳米抗体或微型抗体、fab片段、单链可变片段(scfv)和单结构域抗体(sdab)或其功能片段。这两个结合结构域可以是相同或不同类型的分子。例如，本公开文本的双特异性结合剂包括但不限于具有结合e3连接酶的igg和结合靶表面蛋白的scfv结构域的双特异性结合剂。双特异性结合剂的两个结合结构域可以通过共价键、非共价相互作用或其组合连接。68.双特异性结合剂通常可以采用蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白等的形式。本公开文本的一些双特异性结合剂采用双特异性抗体或抗体衍生物的形式。在一些实施方案中，所述靶蛋白结合结构域选自半抗体、纳米抗体或微型抗体、f(ab′)2片段、fab片段、单链可变片段(scfv)和单结构域抗体(sdab)或其功能片段。这两个结合结构域可以一起采用双特异性抗体、双特异性双抗体、双特异性骆驼抗体或双特异性肽抗体等的形式。抗体衍生物不必需源自特定的野生型抗体。例如，人们可以采用已知技术(如噬菌体展示)来产生并且选择具有与抗体互补决定区(cdr)相似的结合结构域的小蛋白质。在一些实施方案中，抗原结合部分包括scfv。结合结构域也可以源自特异性结合靶表面蛋白的天然或合成配体或受体(无论是可溶性的还是膜结合的)，例如但不限于pd-1、egf等。69.抗原结合部分可包含天然存在的氨基酸序列或可被工程化、设计或修饰以提供所需和/或改进的特性，例如结合亲和力。通常，抗原结合部分(例如抗体)对靶抗原(例如cd19抗原)的结合亲和力可以通过frankel等人,molimmunol(1979)16:101-06描述的scatchard方法计算。在一些实施方案中，结合亲和力通过抗原/抗体解离速率测量。在一些实施方案中，结合亲和力通过竞争放射免疫测定测量。在一些实施方案中，结合亲和力通过elisa测量。在一些实施方案中，抗体亲和力通过流式细胞术测量。在一些实施方案中，结合亲和力通过生物层干涉测量法测量。当抗体能够以高亲和力结合抗原(如cd19)而不显著结合其他抗原时，则所述抗体选择性结合该抗原。70.双特异性抗体可以通过已知方法制备。本公开文本的实施方案包括“杵臼”双特异性抗体，其中双特异性结合剂以其他方式对称的二聚化区域被改变，使得其不对称。例如，可以改变特异于抗原a和b的杵臼双特异性igg，使得a结合链的fc部分具有一个或多个突起(“杵”)，并且b结合链的fc部分具有一个或多个空心(“臼”)，其中杵和臼被排列为进行相互作用。这减少了均二聚化(a-a和b-b抗体)，并且促进了双特异性结合剂所希望的异二聚化。参见例如，y.xu等人,mabs(2015)7(1):231-42。在一些实施方案中，所述双特异性结合剂具有杵臼设计。在一些实施方案中，所述“杵”包含ch3结构域的t336w改变，即位置336处的苏氨酸被色氨酸替代。在一些实施方案中，所述“臼”包含t366s、l368a和y407v的一个或其组合。在一些实施方案中，所述“臼”包含t366s、l368a和y407v。例如，图3中提供了图示。在一些实施方案中，所述“杵”恒定区包含seqidno:14。在一些实施方案中，所述重链fc“杵”恒定区具有组氨酸标签。在一些实施方案中，所述重链fc“臼”恒定区包含seqidno:15。在某些实施方案中，具有n297g的杵构建体的示例性ch2-ch3结构域序列提供在seqidno.:335中。在其他实施方案中，具有n297g的臼构建体的示例性ch2-ch3结构域序列提供在seqidno.:336中。在一些实施方案中，示例性野生型ch2-ch3结构域序列提供在seqidno.:337中。在其他实施方案中，所述“杵”和所述“臼”恒定区包含与本文提供的序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的序列。71.在一些实施方案中，所述双特异性结合剂包含具有两个结合结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，所述e3结合结构域包含半抗体、fab、单链fab或scfv。在一些实施方案中，所述e3结合结构域包含半igg。在一些实施方案中，所述靶表面蛋白结合结构域包含半抗体、fab、单链fab或scfv，与e3结合结构域的形式选择无关。在一些实施方案中，所述e3结合结构域包含半抗体，并且所述靶表面蛋白结合结构域包含半抗体。在一些实施方案中，所述半抗体各自是半igg抗体。在一些实施方案中，所述半抗体各自是半杵臼igg抗体。在一些实施方案中，所述e3结合结构域包含半抗体，并且所述靶表面蛋白结合结构域包含scfab。在一些实施方案中，所述e3结合结构域包含半抗体，并且所述靶表面蛋白结合结构域包含scfv。在一些实施方案中，所述e3结合结构域包含scfv，并且所述靶表面蛋白结合结构域包含scfab。72.在一些实施方案中，所述双特异性结合剂包含fcrn受体识别结构域，如果所述双特异性结合剂被内化，则促进所述双特异性结合剂返回到细胞外空间。靶表面蛋白73.本文公开的双特异性结合剂对一种或多种靶表面蛋白以及膜相关e3连接酶具有结合亲和力。基于靶表面蛋白参与免疫抑制或赘生性细胞从免疫监视中的逃逸或靶细胞蛋白参与赘生性细胞增殖或转移来选择靶表面蛋白。可以根据本公开文本的方法靶向的表面蛋白包括这样的蛋白质，如膜类固醇受体、egf受体、tgf受体、转铁蛋白受体、cd19、cd20、cdcp1等。其他合适的靶表面蛋白包括可以抑制免疫细胞(如t细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等)的攻击的蛋白质，如pd-l1、pd-l2、ctla-4、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag3、nkg2d、tim-3、vista和siglec7。在一些实施方案中，所述靶表面蛋白是由靶细胞过表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶表面蛋白是促进靶细胞增殖、转移或逃避免疫系统的能力的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶表面蛋白是免疫检查点蛋白。在一些实施方案中，所述靶表面蛋白是pd-l1、pd-l2、ctla-4、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag3、nkg2d、tim-3、vista或siglec7。在一些实施方案中，所述靶表面蛋白选自膜类固醇受体、egf受体、tgf受体、转铁受体、cdcp1、cd19和cd20。74.在一些实施方案中，所述靶表面蛋白是t细胞受体(tcr)多肽、tcr共刺激表面蛋白、cd4、cd8或car-t。具有此特异性的双特异性结合剂可用于下调或抑制t细胞和car-t细胞。75.在一些实施方案中，所述双特异性结合剂能够结合肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)。taa包括存在于肿瘤细胞上或正常细胞的亚群上或许多正常细胞上(但是比在肿瘤细胞上的浓度低得多)的分子，例如像蛋白质。例子包括但不限于cea、afp、her2、ctag1b和magea1。相比之下，tsa通常包括存在于肿瘤细胞上但不在正常细胞上表达的分子，如蛋白质。例子包括但不限于肿瘤病毒抗原和突变的蛋白质(也称为新抗原)。76.在一些情况下，所述靶表面蛋白结合结构域特异于存在于由恶性赘生性细胞表达的抗原(例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)中的表位。所述肿瘤相关或肿瘤特异性抗原可以是与以下细胞相关的抗原：例如，乳腺癌细胞、b细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞、非霍奇金b细胞淋巴瘤(b-nhl)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞白血病细胞、急性淋巴细胞白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、膀胱癌细胞、结直肠癌细胞等。还应理解，肿瘤相关抗原也可以由非癌细胞表达。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域特异于存在于组织特异性抗原中的表位。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域特异于存在于疾病相关抗原中的表位。e3连接酶77.本公开文本的双特异性结合剂还结合膜相关e3连接酶。可用于本公开文本的e3连接酶包括发现与靶细胞质膜(细胞膜)相关的那些连接酶。这些膜相关e3连接酶包括例如，rnf43、znrf3、rnf128(grail)、march11等。rnf128在t细胞中特征表达；因此，与rnf128结合的双特异性结合剂的活性可以限于t细胞和表达rnf128的任何其他细胞。示例性构建体78.在一些实施方案中，本公开文本的双特异性结合剂包含与e3连接酶的结合臂和与靶表面蛋白的结合臂，如本文提供。在一些实施方案中，与e3连接酶的结合臂与附接至e3连接酶的细胞外蛋白或与e3连接酶相互作用跨膜蛋白结合。79.在某些实施方案中，与e3连接酶的结合臂包含轻链和重链。在一些实施方案中，所述轻链和重链各自包含可变结构域。通常，重链和轻链的可变区域各自由通过互补决定区(cdr)(也称为高变区)连接的四个框架区(fr)组成。每条链中的cdr通过fr被紧密保持在一起并且与来自另一条链的cdr一起有助于形成结合剂的抗原结合位点。存在至少两种用于确定cdr的技术：(1)基于跨物种序列可变性的方法；和(2)基于抗原抗体复合物晶体学研究的方法。此外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定cdr。80.在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含seqidno.:12或320中所示的重链框架区序列和seqidno.:11或319中所示的轻链框架区序列。在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含seqidno.:12或320中所示的重链框架区序列和seqidno.:11或319中所示的轻链框架区序列。在一些实施方案中，所述重链和轻链框架区序列包含与本文提供的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％相同的序列。81.在一些实施方案中，所述第一结合结构域包含含有分别在表2中示出的序列的轻链可变结构域cdr3(lc-cdr3)序列和重链可变结构域cdr1(hc-cdr1)、hc-cdr2和hc-cdr3序列或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的变体。在一些实施方案中，所述第二结合结构域包含含有分别在表3中示出的序列的lc-cdr3序列和hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3序列或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的变体。82.在其他实施方案中，所述双特异性结合剂的第一结合结构域包含重链可变结构域；并且所述双特异性结合剂的第二结合结构域包含seqidno.:12或320中所示的重链fr序列和seqidno.:11或319中所示的轻链fr序列。如本文所用，这样的双特异性结合剂也称为“vh结合剂”。在一个示例性实施方案中，所述第一结合结构域的重链可变结构域包含seqidno.:321中所示的fr序列。在vh结合剂的一些实施方案中，所述第一结合结构域包含分别在表4中示出的vh-cdr1、vh-cdr2和vh-cdr3序列或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的变体。在vh结合剂的一些实施方案中，所述第二结合结构域包含含有分别在表3中示出的序列的lc-cdr3序列和hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3序列或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的变体。[0083]“保守氨基酸取代”是用具有类似侧链的另一种氨基酸残基替代一种氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方案中，本公开文本的结合剂序列中的保守取代不会消除含有所述氨基酸序列的结合剂与一种或多种抗原(即所述结合剂结合的e3连接酶和/或靶表面蛋白)的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中熟知的。合成[0084]使用重组dna和蛋白质表达的技术合成双特异性结合剂。例如，对于编码本公开文本的双特异性igg的dna的合成，编码重链和轻链的恒定结构域的合适dna序列是广泛可用的。编码所选可变结构域的序列通过标准方法插入，并且编码全长重链和轻链的所得核酸被转导至合适的宿主细胞中并且表达。可替代地，所述核酸可以在无细胞表达系统中表达，所述无细胞系统可以提供对于氧化和还原条件、ph、折叠、糖基化等更多的控制。[0085]双特异性igg蛋白具有两个不同的互补决定区(cdr)，各自特异于所述靶表面蛋白或所述膜相关e3连接酶。因此，需要两个不同的重链和两个不同的轻链。这些可以在同一宿主细胞中表达，并且所得的产物将含有同二聚体和双特异性异二聚体的混合物。可以将同二聚体通过亲和力纯化(例如，首先使用包被有一种抗原的珠，然后使用包被有另一种抗原的珠)与双特异性抗体分离，还原为单体并且重新缔合。可替代地，人们可以采用“杵臼”设计，在所述设计中重链恒定区的二聚化区被改变，使得所述表面相对于表面(与野生型结构相比)突出(“杵”)或形成腔(“孔”)，以这种方式使得两个经修饰的表面仍然能够二聚化。然后，杵重链及其缔合的轻链在一个宿主细胞中表达，并且臼重链和缔合的轻链在不同的宿主细胞中表达，并且将表达的蛋白质合并。二聚化区中的不对称性促进了异二聚体的形成。(参见例如，下文实施例1，和图3，指示与野生型相比进行的改变)。为了获得二聚化，将两个“单体”(各自由重链和轻链组成)在中等碱性ph(例如，约ph8至约ph9)下在还原条件下合并，以促进在适当的重链结构域之间形成二硫键。参见例如，us8216805和ep1870459al，通过引用并入本文。[0086]可以使用其他方法促进双特异性抗体的第一多肽链和第二多肽链的重链异二聚化。例如，在一些实施方案中，如本文公开的工程化抗体的第一多肽链和第二多肽链的重链异二聚化可以如通过f.l.aran等人,procnatlacadsciusa(2013)110(13):5145-50所述的受控fab臂交换方法实现的。[0087]二聚化过程可以导致不同的重链单体之间的轻链交换。用于避免这一结果的一种方法是将抗体的结合区用“单链fab”替代，例如，其中将轻链cdr通过连接多肽与重链cdr融合。igg(或其他抗体)的fab区也可以用scfv、纳米抗体等替代。[0088]本公开文本的工程化抗体的结合活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定。例如，可以通过例如scatchard分析(munsen等人,analytbiochem(1980)107:220-39)确定本公开文本的工程化抗体的结合活性。可以使用本领域已知的技术(包括但不限于竞争性elisa、测定和/或测定)评估特定的结合。与靶抗原或靶表位优先或特异性结合(在本文中可互换使用)的抗体是本领域熟知的术语，并且用于确定这种特异性或优先结合的方法也是本领域已知的。如果相比于抗体与替代抗原或表位反应或缔合的情况，所述抗体与特定抗原或表位更频繁更快速地以更长的持续时间和/或以更大的亲和力反应或缔合，则所述抗体被视为展现出特异性或优先结合。如果相比于抗体与其他物质结合的情况，所述抗体以更大的亲和力、亲合力更容易地和/或以更长的持续时间与靶标结合，则所述抗体与所述靶标特异性或优先结合。此外，如果相比于抗体与样品中存在的其他物质结合的情况，所述抗体以更大亲和力、亲合力更容易地和/或以更长的持续时间与靶标结合，则所述抗体与所述靶标特异性或优先结合。例如，与her2表位特异性或优先结合的抗体是这样的抗体，相比于其与其他her2表位或非her2表位结合的情况，其以更大的亲和力、亲合力更容易地和/或以更长的持续时间结合此表位。通过阅读此定义还应理解，例如，特异性或优先结合第一靶抗原的抗体可以或可以不特异性地或优先结合第二靶抗原。因此，特异性结合以及优先结合并不一定需要(尽管可以包括)专一结合。工程化跨膜蛋白[0089]本文公开的工程化跨膜蛋白对一种或多种靶表面蛋白具有结合亲和力并且掺入具有膜相关e3连接酶泛素连接酶活性的结构域。本文关于双特异性结合剂所述的所有靶表面蛋白也是工程化跨膜蛋白的合适靶标。在一些实施方案中，所述工程化跨膜蛋白对cd19、b7h3(cd276)、bcma、cd123、cd171、cd179a、cd20、cd213a2、cd22、cd24、cd246、cd272、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd46、cd71、cd97、cea、cldn6、clecl1、cs-1、egfr、egfrviii、elf2m、epcam、epha2、ephrinb2、fap、flt3、gd2、gd3、gm3、gprc5d、her2(erbb2/neu)、igll1、il-11ra、kit(cd117)、mmp14、muc1、ncam、pap、pdgfr-β、prss21、psca、psma、ror1、ssea-4、tag72、tem1/cd248、tem7r、tshr、vegfr2、bcma(cd269)、alpi、瓜氨酸波形蛋白、cmet或axl具有结合亲和力。在一些实施方案中，所述工程化跨膜蛋白对pd-l1、pd-l2、ctla-4、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、kir、lag3、nkg2d、tim-3、vista或siglec7具有结合亲和力。在一些实施方案中，所述工程化跨膜蛋白对膜类固醇受体、egf受体、tgf受体、转铁蛋白受体、cd19或cd20具有结合亲和力。在一些实施方案中，所述工程化跨膜蛋白对t细胞受体(tcr)多肽、tcr共刺激表面蛋白、cd4、cd8或car-t具有结合亲和力。[0090]e3连接酶结构域可以选自作为双特异性结合剂的靶标的上文所述的任一种e3连接酶。此外，选定的e3连接酶不需要是靶细胞所天然具有的或由靶细胞表达的，只要所述e3连接酶能够从内源性e2泛素缀合酶转移泛素或缀合的泛素链即可。这允许使用源自不同于靶细胞的物种的哺乳动物物种的e3连接酶，例如，能够在人受试者中使用鼠e3连接酶。这也防止了恶性赘生性细胞通过下调单一e3连接酶的表达而逃避治疗作用；由于本文提供的工程化跨膜蛋白包括e3连接酶活性，因此，恶性赘生性细胞将需要下调或抑制所有内源性e2泛素缀合酶的表达，以避免工程化跨膜蛋白活性。在一些实施方案中，所述e3连接酶结构域包含膜相关e3连接酶或其功能部分。在一些实施方案中，所述膜相关e3连接酶是人膜相关e3连接酶。在一些实施方案中，所述膜相关e3连接酶是rnf43、znrf3、rnf128(grail)或march11。[0091]所述工程化跨膜蛋白包括特异于选定的靶表面蛋白的结合结构域。此结合结构域可以采用本文所述的任一种靶表面蛋白结合结构域的形式，包括例如，抗体、纳米抗体、微型抗体、fab片段、单链可变片段(scfv)和单结构域抗体(sdab)或其功能片段。结合结构域也可以源自特异性结合靶表面蛋白的天然或合成配体或受体(无论是可溶性的还是膜结合的)，例如但不限于pd-1、her2、her3等。[0092]所述结合结构域和e3连接酶结构域可以一起表达为融合蛋白，或以其他方式通过共价键(例如，经由两个半胱氨酸残基之间的二硫键)缔合或通过非共价亲和力缔合。在一些实施方案中，所述工程化跨膜蛋白是融合蛋白。在一些实施方案中，所述工程化跨膜蛋白的e3连接酶结构域和靶表面蛋白结合结构域通过二硫键连接。具有gfp结合结构域和膜相关e3连接酶结构域的示例性工程化跨膜蛋白的图示示出在图2中。[0093]在一个示例性实施方案中，本公开文本的工程化跨膜蛋白包含具有seqidno:2(轻链)和seqidno:4(重链)序列的抗gfpscfab序列，其中连接结构域组提供在seqidno:3中。短接头(seqidno:5)将抗gfpscfab结构域连接到rnf43结构域(seqidno:6)。在此示例性实施方案中，工程化跨膜蛋白的完整序列示于seqidno:1中。[0094]在另一个示例性实施方案中，报告基因构建体是由gfp结构域(seqidno:8)、跨膜/接头结构域(seqidno:9)和纳米萤光素酶结构域(seqidno:10)组装的。在此示例性实施方案中，报告基因构建体的完整序列示于seqidno:7中。免疫缀合物[0095]本公开文本进一步包括含有本文公开的任一种结合剂的免疫缀合物。在一些实施方案中，本公开文本的免疫缀合物包含本文提供的双特异性结合剂。在其他实施方案中，本公开文本的免疫缀合物包含本文公开的工程化跨膜蛋白。如本文所用的术语“免疫缀合物”或“缀合物”是指与结合剂(如本文提供的双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白)连接的化合物或其衍生物。本公开文本的免疫缀合物通常包含结合剂，例如双特异性结合剂或本文提供的工程化跨膜蛋白和小分子。在一些实施方案中，所述免疫缀合物进一步包含接头。[0096]“接头”是能够以稳定和共价的方式将化合物(例如，本文公开的小分子)与结合剂(如本文提供的双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白)连接的任何化学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头可以易感于或基本上抗酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。合适的接头是本领域熟知的，并且包括，例如，二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。接头还包括带电荷接头及其亲水形式，如本文所述和本领域已知的。在某些实施方案中，所述接头选自可切割接头、不可切割接头、亲水性接头和基于二羧酸的接头。在一个示例性实施方案中，所述接头是不可切割接头。在另一个示例性实施方案中，所述接头是间隔子，如peg4。在其他实施方案中，所述小分子不与结合剂解离。[0097]本公开文本涵盖的小分子可以是本领域技术人员认为适合使用的任何小分子，例如，目的蛋白的靶向降解。在其他示例性实施方案中，小分子包含激动剂，诸如但不限于cgs21680。在另外的示例性实施方案中，所述小分子包含拮抗剂，包括但不限于zn241385、普乐沙福、马拉韦罗或阿拉韦洛。小分子可以通过本领域已知的方法与结合剂(如本文提供的双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白)缀合。一些示例性的缀合方法包括但不限于使用基于氧杂吖丙啶的试剂的甲硫氨酸(图13中图示的)、用基于马来酰亚胺的试剂或二硫化物交换试剂标记半胱氨酸、赖氨酸反应性活化酯、利用含有反应手柄的非天然氨基酸的掺入用于缀合、和n末端或c末端缀合。一些方法使用工程化氨基酸(如醛)进行反应性缀合。其他方法包括基于标签的生物缀合方法。本公开文本提供了一些用于缀合的示例性方法。例如，参见实施例6。应理解，本公开文本不受此处列出的几个实施例限制，并且其他通常已知的缀合方法也可以用于制造本文公开的免疫缀合物。核酸分子[0098]在一方面，本文公开的一些实施方案涉及包含编码本公开文本的双特异性结合剂和工程化跨膜蛋白的核苷酸序列的核酸分子，包括含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，所述这些核酸分子与异源核酸序列(例如像指导在宿主细胞中体内表达工程化跨膜蛋白的调节序列)可操作地连接。[0099]本公开文本的核酸分子可以是任何长度的核酸分子，包括通常在约5kb与约50kb之间，例如在约5kb与约40kb之间、在约5kb与约30kb之间、在约5kb与约20kb之间，或在约10kb与约50kb之间，例如在约15kb至30kb之间、在约20kb与约50kb之间、在约20kb与约40kb之间、在约5kb与约25kb之间或在约30kb与约50kb之间的核酸分子。[0100]在一些实施方案中，所述核苷酸序列被掺入表达盒或表达载体中。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，其含有编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。通常，可以将所述表达盒插入用于靶向所希望的宿主细胞或组织的载体中和/或个体中。因此，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含编码双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列与足以指导所述盒体内表达的表达控制元件可操作地连接。在一些实施方案中，所述表达控制元件包含启动子和/或增强子，以及任选地，能够影响编码序列的转录和/或翻译的其他核酸序列中的任一种或组合。[0101]在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达载体中。载体通常包含这样的重组多核苷酸构建体，其被设计用于在宿主细胞之间转移，可用于转化的目的，即将异源dna引入宿主细胞中。这样，在一些实施方案中，载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以在其中插入另一个dna区段以引起插入区段的复制。表达载体进一步包括与重组多核苷酸可操作地连接的启动子，使得在适当条件下，重组多核苷酸在适当的细胞中表达。在一些实施方案中，表达载体是可以整合到宿主核酸中的整合载体。[0102]在一些实施方案中，表达载体是病毒载体，其进一步包含病毒来源的核酸元件，所述核酸元件典型地促进核酸分子转移或整合到细胞的基因组中或介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒颗粒将典型地包括各种病毒组分，并且有时还包括除了一种或多种核酸以外的宿主细胞组分。术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。逆转录病毒载体含有主要源自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分。慢病毒载体是含有包括主要源自慢病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分(包括ltr)的病毒载体或质粒。[0103]可以针对在目的宿主细胞中的表达优化核酸序列。例如，可以将序列的g-c含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如参照宿主细胞中表达的已知基因所计算的。用于密码子优化的方法是本领域已知的。可以优化本文公开的蛋白质的编码序列内的密码子使用以增强在宿主细胞中的表达，使得编码序列内的密码子的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或多至100％已经针对特定宿主细胞中的表达进行优化。[0104]本文公开的一些实施方案涉及载体或表达盒，所述载体或表达盒包含编码本文公开的蛋白质的重组核酸分子。表达盒通常含有编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。可以将所述表达盒插入用于靶向所希望的宿主细胞的载体中和/或个体中。表达盒可以作为线性或环状的、单链或双链的、dna或rna多核苷酸被插入质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子或细菌噬菌体中，所述表达盒源自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包括其中一个或多个核酸序列已经以功能上可操作的方式连接，即，可操作地连接的核酸分子。[0105]本文还提供了含有编码本文公开的任何双特异性结合剂或工程化蛋白质的核酸分子中的一个或多个的载体、质粒或病毒。所述核酸分子可以含于载体内，所述载体能够引导它们在例如已经被所述载体转化/转导的细胞中的表达。用于真核和原核细胞中的合适的载体是本领域中已知的并且可商业购得，或者由技术人员容易地制备。参见例如，sambrook,j.&russell,d.w.(2012).molecularcloning:alaboratorymanual(第4版).coldspringharbor,纽约:coldspringharborlaboratoryandsambrook,j.,&russel,d.w.(2001).molecularcloning:alaboratorymanual(第3版).coldspringharbor,纽约:coldspringharborlaboratory(本文中合称为“sambrook”)；ausubel,f.m.(1987).currentprotocolsinmolecularbiology.纽约,纽约州:wiley(包括至2014年的增刊)；bollag,d.m.等人(1996).proteinmethods.纽约,纽约州:wiley-liss；huang,l.等人(2005).nonviralvectorsforgenetherapy.圣地亚哥:academicpress；kaplitt,m.g.等人(1995).viralvectors:genetherapyandneuroscienceapplications.圣地亚哥,加利福尼亚州:academicpress；lefkovits,i.(1997).theimmunologymethodsmanual:thecomprehensivesourcebookoftechniques.圣地亚哥,加利福尼亚州:academicpress；doyle,a.等人(1998).cellandtissueculture:laboratoryproceduresinbiotechnology.纽约,纽约州:wiley；mullis,k.b.,ferré,f.&gibbs,r.(1994).pcr:thepolymerasechainreaction.波士顿:birkhauserpublisher；greenfield,e.a.(2014).antibodies:alaboratorymanual(第2版).纽约,纽约州:coldspringharborlaboratorypress；beaucage,s.l.等人(2000).currentprotocolsinnucleicacidchemistry.纽约,纽约州:wiley,(包括至2014年的增刊)；以及makrides,s.c.(2003).genetransferandexpressioninmammaliancells.阿姆斯特丹,荷兰:elseviersciencesb.v.，所述文献的公开内容通过引用并入本文。[0106]可以经由常规转化或转染技术将dna载体引入真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以发现于sambrook等人(2012，同上)和其他标准分子生物学实验室手册中，如磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrapeloading)、弹道引入、核穿孔、流体力学冲击和感染。[0107]可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(sv40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，gluzman(编辑),eukaryoticviralvectors,cshlaboratorypress,coldspringharbor,纽约)。[0108]表达系统的精确组分并不重要。例如，如本文所公开的双特异性结合剂可以在真核宿主如哺乳动物细胞(例如，cos细胞、nih3t3细胞或hela细胞)中产生。这些细胞可以从许多来源获得，包括美国典型菌种保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。在选择表达系统时，重要的仅是组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。此外，如果在选择表达系统时需要指导，技术人员可以咨询p.jones,“vectors:cloningapplications”,johnwileyandsons,纽约,纽约州,2009。[0109]所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或者与天然存在的序列不同但是由于遗传密码简并而编码相同基因产物的序列。这些核酸分子可以由rna或dna(例如，基因组dna、cdna，或合成dna(例如通过基于亚磷酰胺的合成产生的dna))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，核酸分子可以是双链或单链的(例如，包含有义或反义链)。[0110]核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包含位于编码序列(例如，双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组dna或通过聚合酶链式反应(pcr)来产生。在核酸分子是核糖核酸(rna)的情况下，转录物可以例如通过体外转录产生。重组细胞和细胞培养物[0111]本公开文本的核酸可以被引入宿主细胞，如人b淋巴细胞，以产生含有所述核酸分子的重组细胞。因此，本公开文本的一些实施方案涉及用于制造重组细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供能够蛋白质表达的细胞，以及(b)使所提供的细胞与本文所述的任一种重组核酸接触。[0112]将本公开文本的核酸分子引入细胞可以通过以下方式实现：病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(pei)介导的转染、deae葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。[0113]因此，在一些实施方案中，所述核酸分子可以通过本领域中已知的病毒或非病毒递送媒介物来递送至细胞。例如，核酸分子可以稳定地整合到宿主基因组中、或者可以以附加体复制、或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。因此，在本文公开的一些实施方案中，所述核酸分子在重组宿主细胞中作为附加体单元被维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定整合到重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典随机基因组重组技术或更精确的基因组编辑技术完成，如使用指导rna引导的crispr/cas9、或dna指导的核酸内切酶基因组编辑ngago(格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)argonaute)、或talen基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，所述核酸分子作为用于稳定或瞬时表达的微环表达载体存在于重组宿主细胞中。[0114]核酸分子可以被封装在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。例如，可以通过病毒转导实现将核酸引入细胞。在非限制性例子中，腺相关病毒(aav)是可以被工程化以经由病毒转导将核酸递送至靶细胞的无包膜病毒。已经描述了几种aav血清型，并且所有已知的血清型可以感染来自多种不同组织类型的细胞。aav能够在体内转导广泛的物种和组织，没有毒性证据，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。一个实施方案是编码本公开文本的工程化跨膜蛋白的aav载体。[0115]慢病毒系统也适用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)感染分裂细胞和非分裂细胞二者的能力；(iii)具有广泛的组织趋性，包括重要的基因和细胞疗法靶细胞类型；(iv)载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含有内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和生产的系统。[0116]在一些实施方案中，将宿主细胞用例如包含编码如本文所述的工程化跨膜蛋白的核酸序列的载体(病毒来源的表达载体、或进一步包含与宿主细胞基因组的一部分同源的核酸序列的同源重组的载体)基因工程化(例如，转导、转化或转染)。宿主细胞可以是未转化的细胞或已经用一种或多种核酸分子转染的细胞。[0117]在一些实施方案中，所述重组细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体内转化的。在一些实施方案中，所述细胞是离体转化的。在一些实施方案中，所述细胞是体外转化的。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞或干细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是免疫系统细胞，例如淋巴细胞(例如，t细胞或nk细胞)或树突细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是b细胞、单核细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节t细胞、辅助t细胞、细胞毒性t细胞或其他t细胞。在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是t淋巴细胞。[0118]在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在细胞的一些实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是前体t细胞或t调节(treg)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是cd34+、cd8+或cd4+细胞。在一些实施方案中，所述细胞是选自以下的cd8+t细胞毒性淋巴细胞：幼稚cd8+t细胞、中央记忆cd8+t细胞、效应记忆cd8+t细胞和大量cd8+t细胞。在细胞的一些实施方案中，所述细胞是选自以下的cd4+t辅助淋巴细胞：幼稚cd4+t细胞、中央记忆cd4+t细胞、效应记忆cd4+t细胞和大量cd4+t细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以通过对获自人受试者的样品进行白细胞单采术获得。[0119]在另一方面，本文提供包括至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基的各种细胞培养物。通常，培养基可以是用于本文所述的细胞培养物的任何一种合适的培养基。用于转化多种多样的上述宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包括至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本技术的范围内。适用于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。药物组合物[0120]在一些实施方案中，可以将本公开文本的双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、核酸和重组细胞掺入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物典型地包含双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、核酸和/或重组细胞，和药学上可接受的赋形剂，例如载体。[0121]可以使用用于施用抗体和基于抗体的治疗剂或基于其的配制品的配制品来施用本公开文本的双特异性结合剂。使用用于施用寡核苷酸、反义rna药剂和/或基因疗法(如基于crispr/cas9的治疗剂)的配制品来施用本公开文本的核酸。工程化跨膜蛋白作为用于在靶细胞中表达的核酸施用或作为能够与靶细胞膜融合的载体(例如，如下文所述的促融合载体)中的蛋白质施用。[0122]适用于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的)或分散液，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophoreltm.(新泽西州帕西帕尼的basf)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，所述组合物应是无菌的并且应是可以通过注射器施用的程度的流体。其在制造和储存条件下应稳定并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂例如十二烷基硫酸钠。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，通常在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)、或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。[0123]无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，之后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散液，所述无菌媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所需成分的粉末。[0124]在一些实施方案中，使用本领已知的方法，通过用编码本公开文本的双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的核酸转染或感染来施用所述双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白，所述方法包括但不限于描述于mccaffrey等人,nature(2002)418:6893、xia等人,naturebiotechnol(2002)20:1006-10和putnam,amjhealthsystpharm(1996)53:151-60,erratumatamjhealthsystpharm(1996)53:325中的方法。[0125]可以使用包含促融合载体的配制品施用本公开文本的工程化跨膜蛋白。这些是能够与哺乳动物细胞的质膜融合的载体。促融合载体包括但不限于膜封装病毒颗粒和基于其的载体、外泌体和微囊(参见例如，y.yang等人,jextracellularvessicles(2018)7:144131)、促融合脂质体(参见例如，bailey等人,us5552155；martin等人,us5891468；holland等人,us5885613；和leamon,us6379698)。一个实施方案是包含工程化跨膜蛋白和促融合载体的配制品。本公开文本的方法双特异性结合剂的施用[0126]本文所述的任一种或多种治疗组合物(例如，双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、核酸、重组细胞和药物组合物)的施用可以用于治疗患有赘生性疾病如癌症的个体。在一些实施方案中，将所述双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、核酸、重组细胞和药物组合物掺入治疗组合物中用于下调或灭活t细胞如car-t细胞的方法中。[0127]因此，在一方面，本文提供了用于抑制个体的靶细胞活性的方法，所述方法包括向个体施用第一疗法的步骤，所述第一疗法包括本文提供的双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种，其中所述第一疗法通过降解靶表面蛋白来抑制靶细胞的活性。例如，如果靶细胞的增殖减少，如果靶细胞的病理或致病行为减少，如果靶细胞被破坏或杀伤等，则所述靶细胞的活性可以被抑制。抑制包括所测量的量减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞通过双特异性结合剂的表达抑制所述个体的靶细胞。通常，所公开的方法的靶细胞可以是任何细胞，例如像急性骨髓瘤白血病细胞、间变性淋巴瘤细胞、星形胶质细胞瘤细胞、b细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、膀胱癌细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周t细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞、间皮瘤细胞或肉瘤细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是致病细胞。[0128]本公开文本的双特异性结合剂典型地在溶液或悬浮液配制品中通过注射或输注施用。在一个实施方案中，双特异性结合剂通过直接注射到肿瘤块中施用。在另一个实施方案中，双特异性结合剂通过全身输注施用。[0129]本公开文本的一些双特异性结合剂在10nm的浓度下有效。其他双特异性结合剂在较高或较低的浓度下可能是最有效的，这取决于对每种配体的结合亲和力和每种配体的表达程度。然而，使用本文提供的公开文本和实验方案，可以通过本领域普通技术人员确定有效浓度的范围。同样，使用有效浓度可以确定施用所需的有效剂量或剂量范围。[0130]根据待治疗的疾病或障碍、疾病的严重性和程度、受试者的健康以及其他疗法的共施用，可以施用重复剂量。可替代地，可能需要连续施用。然而，预期双特异性结合剂将保持与细胞接近，使得双特异性结合剂的每个分子可以被泛素化并且降解靶表面蛋白的多个分子。因此，与基于抗体竞争性结合的疗法相比，本公开文本的双特异性结合剂可能需要较低的剂量或较不频繁的施用。向个体施用重组细胞[0131]在一些实施方案中，所述方法涉及将重组细胞施用至需要这种方法的个体。此施用步骤可以使用本领域中已知的任何植入方法来完成。例如，可以将重组细胞通过静脉输注直接注射入个体的血流中或以其他方式施用至个体。[0132]术语“施用”、“引入”和“移植”在本文中可互换使用，是指将表达本文提供的双特异性结合剂的重组细胞递送至个体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过导致将所引入细胞至少部分定位于所希望的部位从而产生一种或多种所希望的作用的方法或途径向个体施用重组细胞。可以将重组细胞或其分化的后代通过任何适当的途径施用，所述适当的途径导致递送至个体的所希望的位置，在所述位置至少部分所施用的细胞或细胞组分保持存活。在施用至个体后细胞的活力时间段可以短至数小时，例如二十四小时，至数天，至长至数年，或甚至持续个体的寿命的长期移植。[0133]当预防性提供时，在一些实施方案中，可以将本文所述的重组细胞在待治疗的疾病或病症的任何症状出现之前施用至个体。因此，在一些实施方案中，重组干细胞群的预防性施用用于预防疾病或病症的症状的发生。[0134]当在一些实施方案中以治疗方式提供时，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)，例如在疾病或病症发作时，提供重组干细胞。[0135]为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文公开的重组细胞的有效量可以是至少102个细胞、至少5×102个细胞、至少103个细胞、至少5×103个细胞、至少104个细胞、至少5×104个细胞、至少105个细胞、至少2×105个细胞、至少3×105个细胞、至少4×105个细胞、至少5×105个细胞、至少6×105个细胞、至少7×105个细胞、至少8×105个细胞、至少9×105个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞、至少3×106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少6×106个细胞、至少7×106个细胞、至少8×106个细胞、至少9×106个细胞、或其倍数。所述重组细胞可以源自一个或多个供体或可以从自体来源(即，正在治疗的人受试者)获得。在一些实施方案中，将所述重组细胞在施用至有需要的个体之前在培养物中扩增。[0136]在一些实施方案中，通过方法或途径将包含重组细胞的组合物(即包含本文提供的双特异性结合剂的多个重组细胞的组合物)递送至个体导致细胞组合物至少部分定位于所希望的部位。可以通过任何导致个体的有效治疗的适当途径施用细胞组合物，例如，施用导致递送至个体中所希望的位置，在所述希望的位置处所递送组合物的至少一部分例如至少1×104个细胞被递送至所希望的部位持续一段时间。施用方式包括注射、输注、滴注等。注射方式包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，可以通过注射或输注进行施用。[0137]在一些实施方案中，所述重组细胞是全身性施用的，换句话说，不直接将重组细胞群施用至靶部位、组织或器官，而是使其进入个体的循环系统，并且从而经受代谢和其他类似的过程。[0138]用组合物治疗疾病或病症的治疗功效可以通过熟练的临床医生确定。然而，本领域技术人员应理解，如果疾病的任何一种或全部体征或症状或标记物得到改善或改进，则治疗被认为是有效的治疗。还可以通过如由住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的个体恶化的失败来测量功效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病进展，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；以及(3)预防或减少症状发展的可能性。[0139]如上文所讨论的，治疗有效量包括治疗组合物当施用至个体时足以促进特定作用的量，所述受试者是如患有、怀疑患有或有风险患上疾病的受试者。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的有效量。[0140]包括所公开的组合物的治疗用于治疗疾病的功效可以通过熟练的临床医生确定。然而，如果疾病的至少任何一种或全部体征或症状得到改善或改进，则治疗被认为是有效的。还可以通过如由住院治疗或对医疗干预的需要(例如，疾病进展停止或至少减缓)所评估的个体恶化的失败来测量功效。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减缓症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；或(3)预防或减少症状发展的可能性。[0141]在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述个体患有或怀疑患有与由细胞表面蛋白介导的细胞信号传导相关的疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症或慢性感染。系统和试剂盒[0142]本文还提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包含本文提供和描述的双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、重组核酸、重组细胞或药物组合物以及用于制造和使用它们的书面说明书。例如，在一些实施方案中，本文提供了包含以下中的一种或多种的系统和/或试剂盒：如本文所述的双特异性结合剂、如本文所述的工程化跨膜蛋白、如本文所述的重组核酸、如本文所述的重组细胞或如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本公开文本的系统和/或试剂盒进一步包含用于向个体施用所提供的双特异性结合剂、工程化跨膜蛋白、重组核酸、重组细胞或药物组合物的一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述一种或多种另外的治疗剂可以与其他试剂盒组分同时或依序施用用于所希望的目的，例如用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞、或治疗有需要的受试者的疾病。[0143]任何上述系统和试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照多肽、阳性对照多肽、用于体外产生所述双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的试剂。[0144]在一些实施方案中，系统或试剂盒还可以包含使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，可以将说明书印刷在基材(如纸或塑料等)上。说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，在试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或子包装相关)等。所述说明书可以以存在于合适的计算机可读存储介质(例如cd-rom、软磁盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件存在。在一些情况下，实际说明书不存在于试剂盒中，而是可以提供从远程源(例如经由互联网)获得说明书的手段。这个实施方案的例子是包含网址的试剂盒，在其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段可以被记录在合适的衬底上。[0145]本公开文本中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同明确且单独地指示每个单独出版物或专利申请通过引用并入一般。[0146]不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。[0147]本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本之后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本技术的精神和范围内。实施例[0148]除非另有说明，否则本公开文本的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术在上述文献中有充分说明。[0149]在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。实施例1双特异性结合剂和工程化跨膜蛋白的合成[0150]此实施例描述了为产生以下构建体类型进行的实验：双特异性igg、在一个臂上具有单链fab的双特异性igg和fab-scfv融合体。双特异性降解剂作用模式的图形表示可以在图1中找到，并且具有与rnf43融合的抗gfp结构域对照的工程化跨膜蛋白的图形表示在图2中提供。半igg表达[0151]对于这些构建体的半igg表达，进行以下6天的过程。在第一天，每次转染，将7.5x107个expi293ftm细胞(thermofisherscientific)在125ml烧瓶中在25.5ml的expi293tm生长培养基中分裂。根据制造商的方案使用expitm转染试剂：将1.5ml的optimemtm添加到15ml管中，并且将30μg质粒dna添加至其中并且混合(重链和轻链质粒各15μg)。在单独的管中，对于每次转染，将1.5ml的optimemtm等分，并且将81μlexpifectaminetm试剂添加到每个管中用于每次转染。将溶液混合并且在室温(rt)下孵育5min。然后，将dna添加到expifectaminetm(最终体积3ml)中并且孵育20分钟。最后，将3ml的dna+expifectaminetm混合物添加到optimemtm中至每个含有expi293ftm细胞的培养瓶中。每次转染的最终培养体积是28.5ml(+3ml的1mm生物素用于fc融合体)。[0152]在第二天，在第一天的最后一步后20小时，将expifectaminetm增强剂添加到每种培养物中，最终培养体积是30ml。然后将expifectaminetm转染增强剂1(150μl)和expifectaminetm转染增强剂2(1.5ml)添加到每个烧瓶中。[0153]在第六天，将培养物在离心机中在4℃下在4137rpm下4xg减速旋转20分钟。然后将半igg使用常用的蛋白a方案纯化，并且将最终的杵或臼构建体通过缓冲液交换到10nmtrisph7.5，100mmnacl中回收。半igg体外组装[0154]对于这些构建体的半igg体外组装以及为了产生双特异性igg，在10nmtris、100mmnacl(ph7.5)中制备半igg杵构建体和半igg臼构建体的一比一混合物(参见下表2和表5)。通过添加20％800mml-argph10将混合物的ph调节至约8.5。将800mml-arg(ph10)中的200倍过量的还原型谷胱甘肽添加到混合物中，并且在37℃下孵育16小时。16小时孵育后，将双特异性igg使用30kda离心浓缩器缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水缓冲液(pbs)中。最后，将双特异性igg经由his标签纯化进行纯化。基于scfab的双特异性igg和双特异性fab-scfv的产生[0155]对于基于scfab的双特异性igg和双特异性fab-scfv的产生，遵循以下6天的过程。[0156]在第一天，每次转染，将7.5x107个expi293ftm细胞在125ml烧瓶中在25.5ml的expi293tm生长培养基中分裂。按照制造商的方案使用expitm转染试剂：将1.5ml的optimemtm添加到15ml管中，并且将30μg质粒dna添加至其中并且混合(重链和轻链质粒各15μg)。在单独的管中，对于每次转染，将1.5ml的optimemtm等分，并且将81μlexpifectaminetm试剂添加到每个管中用于每次转染。将溶液混合并且在室温(rt)下孵育5min。然后，将dna添加到expifectaminetm(最终体积3ml)中并且孵育20分钟。最后，将3ml的dna+expifectaminetm混合物添加到optimemtm中至每个含有expi293ftm细胞的培养瓶中。每次转染的最终培养体积是28.5ml(+3ml的1mm生物素用于fc融合体)。[0157]在第二天，在第一天的最后一步后20小时，将expifectaminetm增强剂添加到每种培养物中，最终培养体积是30ml。此后，将150μl的expifectaminetm转染增强剂1和1.5mlexpifectaminetm转染增强剂2添加到每个烧瓶中。[0158]在第六天，将培养物在离心机中在4000rpm下减速旋转20分钟。将双特异性fab-scfv构建体进行蛋白a纯化，并且将基于scfab的双特异性igg进行his标签纯化。将最终构建体通过缓冲液交换至pbs来回收。产生的构建体[0159]上文所示的程序中产生的构建体包括以下：表1：产生的构建体产生的构建体[0160]使用seqidno:11的轻链框架区、seqidno:12的重链fab框架区、seqidno:13的在一个臂上具有单链fab的双特异性igg、具有his标签的seqidno:14的重链fc“杵”恒定区、和seqidno:16和17的fab-scfv构建体-重链scfv融合体制备来自表1的e3连接酶臂的构建体。将表2中的a5的lc-cdr3、hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3用于所有的rnf43结合臂(也称为rnf43结合剂)。将表2中的a22的lc-cdr3、hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3用于所有的znrf3结合臂。[0161]使用seqidno:11的轻链框架区、seqidno:12的重链fab框架区、seqidno:13的在一个臂上具有单链fab的双特异性igg、seqidno:15的重链fc“臼”恒定区、和seqidno:16和17的fab-scfv构建体-重链scfv融合体制备靶蛋白的构建体。用于靶表面蛋白pd-l1、her2、egfr、ctla-4、mmp14和cdcp1的lc和hc可变结构域示出在下表5中。[0162]用于e3连接酶rnf43、znrf3和grail(rnf128)的另外的lc-cdr3、hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3示出在下表2中。使用seqidno:319的轻链恒定区和seqidno:320的重链fab恒定区制备另外的构建体。[0163]在另一个例子中，将针对rnf43的fab结合臂用vh结合剂替代。vh框架区的序列提供在seqidno:321中。用于rnf43的vhcdr序列提供在表4中。表2：e3连接酶cdr组合表3：用于靶抗原pd-l1的示例性lc-cdr1、hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3序列。表4：用于vh结合剂的另外vhcdr。表5：用于表面靶标的可变结构域实施例2[0164]此实施例描述了为测试以下构建体类型进行的实验：双特异性igg、在一个臂上具有单链fab的双特异性igg和fab-scfv融合体。免疫印迹[0165]按照下文所述的3天过程，通过蛋白质印迹测试细胞系mda-mb-231、hcc827、h460和t24的pd-l1降解。[0166]在第一天，在1ml新鲜生长培养基中，将在6孔板中约60％-70％的汇合度的细胞用不同浓度的双特异性抗体给药。然后将细胞不受干扰地放置一段时间(24小时)。[0167]在第二天以及与双特异性抗体一起孵育后24小时，样品被认为准备好进行蛋白质印迹分析。为此，将细胞培养基吸去，并且将细胞用冷pbs洗涤。随后将细胞用versene溶液提起并且减速旋转。然后，将上清液去除并且将细胞沉淀物单独重悬在140μl的ripa裂解缓冲液+completetm蛋白酶抑制剂混合物(milliporesigma，#11836170001)中并且转移至eppendorf管中。然后将重悬的细胞在4℃下与裂解缓冲液一起孵育30分钟。(裂解缓冲液：5mnacl(3ml)、1mtris-hcl(5ml，ph8.0)、nonidettmp-40(1ml)、10％脱氧胆酸钠(5ml)、10％sds(1ml)、ddh2o(补足至100ml))。然后将细胞裂解液减速旋转(15000g，10分钟，4℃)，取100μl的可溶性级分，并且将蛋白质水平使用二喹啉甲酸测定(bca测定，也称为smith测定)归一化。将稀释的裂解液添加到20μlldl缓冲液+2μlbme中，并且将溶液煮沸10分钟。将裂解液在sdspage凝胶上运行(200v，37分钟)，并且将凝胶用20％乙醇的溶液封闭。将封闭的凝胶使用平台转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜上。将膜使用制造商的封闭缓冲液封闭60分钟。将一抗添加在7.5ml封闭缓冲液20中。对于抗pd-l1的比率是1:1000，并且对于抗微管蛋白的比率是1:2000。最终，将膜在黑盒子中在4℃下轻轻振荡过夜。[0168]在第三天，去除过夜缓冲液，并且将膜用1xtbs-t(20)冲洗，并且然后用1xtbs-t(20)覆盖并且在室温下振荡5分钟。将洗涤溶液倒出，并且将冲洗过程重复另外3次。将二抗在8ml的封闭缓冲液20(160μl)+0.01％sds(8μl)中稀释。使用两种二抗：山羊抗兔(800nm)和山羊抗小鼠(680nm)。将膜在黑暗中与二抗在室温下在轻轻振荡的情况下孵育1小时。此孵育后，将膜用1xtbs-t(20)冲洗，并且用1xtbs-t(20)覆盖并且在室温下振荡5分钟。将洗涤溶液倒出，并且将膜冲洗另外三次。将膜用1xpbs进行最终冲洗，以去除残余的20，并且在成像系统上成像。[0169]在用测试的双特异性igg或阿特珠单抗(二者均为在溶液中10nm)处理24小时后，对mda-mb-231、hcc827或t24细胞系的pd-l1水平的影响的示例性的蛋白质印迹结果分别示出在图5a、图5b和图5c中。简而言之，测试的双特异性igg能够在这三种不同的临床相关细胞系(mda-mb-231、hcc827或t24)中降解pd-l1，而阿特珠单抗导致很少的降解或没有降解。[0170]另外地，图6示出了双特异性rnf43-pd-l1igg对从三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231降解pd-l1的影响。从左到右的每个条都表示：pbs对照、10nm的具有rnf43a5的构建体(seqidno.:332和333)、10nm-rnf43a4的fab构建体(seqidno.:322和323)、和10nm-rnf43a6的fab构建体(seqidno.:324和325)。所有构建体均是双特异性igg的，其中一个臂靶向rnf43，并且另一个用tecentriq作为结合臂与pd-l1结合。pd-l1结合可变结构域在所有构建体中是相同的并且具有seqidno:106和107。以与本公开文本的实施例2中所述的相同方式进行蛋白质印迹。流式细胞术[0171]按照下文所述的2天过程，通过流式细胞术成功测试以下细胞系的pd-l1：mda-mb-231、hcc827、h460和t24。[0172]在第一天，在1ml新鲜生长培养基中，将在6孔板中约60％-70％的汇合度的细胞用不同浓度的双特异性抗体给药。然后将细胞不受干扰地放置一段时间(24小时)。[0173]在第二天以及与双特异性抗体一起孵育后24小时，样品被认为准备好进行蛋白质印迹分析。为此，将细胞培养基吸去，并且将细胞用冷pbs洗涤。随后将细胞用versene溶液提起并且减速旋转。然后，将上清液去除，并且将细胞沉淀物用冷1xpbs单独洗涤。然后，然后将细胞用pbs+3％bsa封闭，并且将生物素化抗体添加到样品中，并且在4℃下在振荡的情况下孵育30分钟。然后将细胞用pbs+3％bsa洗涤三次。然后添加alexa647链霉亲和素(thermofisherscientific)并且将细胞在4℃下在振荡的情况下孵育30分钟。将细胞用pbs+3％bsa洗涤三次。最后，将细胞重悬于200μlpbs中，并且在流式细胞仪上运行。[0174]流式细胞术结果显示，测试的双特异性igg能够在这三种不同的临床相关细胞系(mda-mb-231、hcc827或t24)中降解pd-l1，而阿特珠单抗导致很少的降解或没有降解。实施例3工程化跨膜蛋白[0175]此实施例描述了与rnf43工程化跨膜蛋白的合成和测试所述工程化跨膜蛋白降解报告基因构建体有关的实验。转染和合成[0176]所有dna片段均购自idt，并且使用gibson克隆组装。将具有30bp重叠的dna片段与切割载体pfuse载体和gibson主混合物(gibsonmastermix)在50℃下孵育30分钟。基于rnf43和抗gfpscfab设计工程化跨膜蛋白。抗gfpscfab序列提供在seqidno:2(轻链)和seqidno:4(重链)中，并且连接结构域组提供在seqidno:3中。短接头(seqidno:5)将scfab结构域连接到rnf43结构域(seqidno:6)。完整序列示于seqidno:1中。[0177]报告基因构建体是由gfp结构域(seqidno:8)、跨膜/接头结构域(seqidno:9)和纳米萤光素酶结构域(seqidno:10)组装的。报告基因构建体的完整序列提供在seqidno:7中。[0178]将gibson产物经由热激转化为xl10感受态细胞。允许转化的细胞在37℃下回收1小时。将回收的细胞铺板在lb/羧苄青霉素板上，在37℃下过夜。[0179]在第2天，挑取过夜板上的单个菌落，并且将其添加到5ml低盐lb/羧苄青霉素中，并且在37℃下孵育直至汇合。当细胞处于汇合时，小量制备dna，并且验证序列。[0180]对于rnf43工程化跨膜蛋白的合成，使用-293转染试剂，将hek293或hela细胞用报告基因gfp-nanoluc构建体和rnf43工程化跨膜蛋白二者瞬时转染。允许6孔板中的细胞生长至60％-70％的汇合度。将dna(2.5μg)与7.5μl的transit-293试剂在室温下在opti-mem中孵育20分钟，并且将dna-transit混合物添加到细胞中。[0181]将hek293flp/in细胞用于制造表达gfp-nanoluc构建体的稳定细胞系；对于此细胞系，由于已经存在gfp-nanoluc，通过将rnf43融合体瞬时转换到此细胞系中来进行以下实验(纳米萤光素酶读数)。瞬时转染是在具有约60％汇合度的细胞的6孔板中进行的。纳米萤光素酶读数[0182]对于上文提及的纳米萤光素酶读数，并且在用一种或多种适当的构建体转染后24小时，将转染的细胞分裂到96孔板中，并且不受干扰地放置24小时。将试剂在室温下解冻并且1:50混合。将等体积的试剂添加到细胞(100μl)中，并且将细胞在室温下振荡10分钟。最后，在板读取器上读取化学发光。与阴性对照相比，在添加抗gfp-rnf43融合体后，纳米萤光素酶信号示出了显著降低的报告基因蛋白。共聚焦显微术[0183]对于共聚焦显微术和随后的共聚焦荧光成像，将细胞如上所述转染并且孵育48小时。48小时后，将细胞铺板在玻璃底培养皿上12小时，然后成像。在成像之前，补充细胞培养基，并且将添加到溶液中。使用4％pfa固定细胞，并且使用在pbs中的0.5％tritontm-x透化。将dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)与透化的细胞一起孵育。最后，将细胞用pbs洗涤三次，并且在100x旋转盘共聚焦显微镜上成像。[0184]共聚焦显微术表明，仅可溶性gfpfab对gfp报告基因的定位没有影响，而抗gfp-rnf43工程化跨膜蛋白导致gfp报告基因的内化和溶酶体聚集。这些数据表明rnf43可以用于诱导内源性蛋白质的蛋白质降解。实施例4[0185]此实验设计用于产生aav转染载体用于将工程化跨膜蛋白插入靶细胞中。[0186]通过将表达scfab-e3工程化跨膜蛋白的基因放置在cag、ef1或组织特异性启动子下，构建aav转移质粒。将hek293t细胞以1:1:2的比率用aav辅助质粒(phelper)、rep-cap质粒(paav-rc1或paav-rc9)和aav转移质粒转染。将细胞在37℃下在5％co2下孵育3天。然后将细胞收获在补充有0.001％酸和200mmnacl的pbs缓冲液中并且用超声裂解。将细胞碎片在4℃下在3,200xg下沉淀15分钟，并且然后将上清液转移到另一个管中。将benzonase(50单位/ml)添加到上清液中，将所述上清液在37℃下进一步孵育45分钟。通过在4℃下在2,400g下离心10分钟使上清液澄清。随后将重组aav通过两轮碘克沙醇梯度超速离心(在pbs-mk梯度缓冲液中稀释的15％、25％、40％和60％碘克沙醇)进行纯化，并且收集40％级分并且使用mwco100kda离心浓缩器设备脱盐。然后将脱盐的aav在补充有0.001％酸和200mmnacl的pbs中储存在-80℃。[0187]为了产生与外泌体相关的aav(exoaav)，将通过慢病毒转导构建将过表达cd9-gfp的hek293t的稳定细胞系。将hek293tcd9-gfp细胞以1:1:2的比率用aav辅助质粒(phelper)、rep-cap质粒(paav-rc1或paav-rc9)和aav转移质粒转染。然后将细胞在37℃下在5％co2下在外泌体耗尽的培养基中孵育3天，此后将细胞培养基收集并且在300xg下耗尽5分钟，并且1000g持续10分钟。将上清液在15℃下在20,000g下离心1小时，然后收集并且在15℃下在100,000xg下再次离心1.5小时。然后将最终exoaav产物储存在4℃。aav的体外靶向[0188]经由flp-intm系统重组系统(thermofisherscientific)构建稳定表达gfp纳米萤光素酶(gfp-nluc，seqidno:7)报告基因的hela细胞的细胞系。在转导前24小时，将helagfp-nluc细胞以50,000个细胞/孔接种在96孔板中。在5％co2下在37℃下，将细胞用108个标准aav或exoaav的基因组拷贝转导过夜。将培养基用具有10％fbs的dulbecco/vogt修饰的伊格尔极限必需培养基(dmem)替代，并且将细胞在5％co2下在37℃下进一步孵育。转导后48小时，用与上文相同的程序进行萤光素酶测定和流量分析。实施例5动力学要求[0189]此实施例提供了关于使用双特异性抗体通过招募rnf43降解pd-l1的另外数据。结果与人们预期的略有不同。结论是，对于决定了降解剂的质量如何的双特异性抗体的每个组分均存在亲和力要求。然而，最初假设十分紧密的结合可能不是理想的，并且稍弱的结合剂可能改善降解过程的转化并且因此增加降解水平。出乎意料地是，观察到实际上需要具有缓慢解离速率的紧密结合剂来诱导降解。[0190]在pd-l1结合组分tecentriq上进行涉及与pd-l1结合的重要残基的丙氨酸扫描。突变体被表示为fab以测量其动力学参数(kd，kon，koff)。然后，将它们转变为双特异性抗体，其中另一半为抗rnf43a5构建体。接下来，使用与上文实施例2中所述的相同方案，在mda-mb-231细胞上用10nm双特异性igg进行降解实验，并且用蛋白质印迹定量降解量。使用这些数据，绘制降解水平与不同的动力学参数的关系。数据表明，koff与降解水平之间存在相关性(r2＝0.67)，这意味着解离速率越慢，降解水平越高。[0191]接下来，对rnf43结合剂进行类似实验，由其进行克隆抗rnf43a5的丙氨酸扫描。制造了cdrh3的丙氨酸突变体。除2个克隆外，所有其他克隆都完全消除了结合，但是2个克隆保持了一些结合。维持一些结合的这2个突变体(分别为s113a和f115a)对rnf43具有40和125nm的亲和力。它们是使用wtpd-l1结合剂与seqidno：106和107制造为双特异性igg的，并且重复来自上文的降解实验。这次，仅在wtrnf43结合剂的情况下看到了降解，所述结合剂的亲和力为12.5nm，并且当与rnf43的结合降低至40或125nm时pd-l1水平没有变化。同样，此数据支持了双特异性抗体每一侧都需要紧密结合剂的观点。[0192]图7示出了每个ala突变体的合并生物层干涉法(bli)图。图7中的生物层干涉法(bli)图中每个丙氨酸突变体的动力学参数示出在下表6中。[0193]表6.图7中的生物层干涉法(bli)图中每个丙氨酸突变体的动力学参数。突变体kd(nm)konkoffx^2r^2wt0.3851.48e+055.68e-050.61050.9988s57ahc3.911.52e+045.95e-050.13850.9984d31ahc1.942.78e+055.40e-042.84170.9892s30ahc1.44.36e+046.09e-051.0450.9983w33ahc‑‑‑‑‑w50ahc63.11.38e+058.69e-030.38380.9722w101ahc4581.10e+045.02e-030.11020.989s30alc1.238.48e+041.05e-042.1290.9969y93alc2.592.80e+057.24e-040.24130.9964l92alc2.82.26e+056.32e-041.76960.9888图8示出了降解百分比与koff之间的相关性。解离速率越慢，降解越高。此外，图9示出了降解百分比与kd之间的相关性。如所示，存在略小的相关性，这意味着结合剂越紧密，降解越高。图10示出了降解百分比与kon之间不存在相关性。图11示出了抗rnf43丙氨酸突变体的蛋白质印迹。所述突变体因其kd而被标记为rnf43。12.5nm是wtrnf43a5，40nm是s113a并且125nm是f115a。这表明，在以10nm的双特异性结合剂的24小时处理后，仅是最紧密结合的抗rnf43构建体降解pd-l1。实施例6[0194]本文提供了一种用于与fab构建体小分子缀合的示例性方法。这些数据表明，包含本公开文本的结合剂的免疫缀合物可以被招募到靶标并且诱导所述靶标降解。本文公开的抗体药物缀合物的示例性图示提供在图12中。[0195]细胞系。使细胞系在37℃和5％co2下在t75(thermofisherscientific)烧瓶中生长并且维持。使molt-4ccr5+细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)和2％遗传霉素的rpmi-1640中生长。molt-4ccr5+细胞获自nihaidsreagentprogram。[0196]抗体克隆、表达和纯化。使用gibson组装引入抗rnf43fablcs7m单突变。将fab使用优化的自诱导培养基在大肠杆菌(e.coli)c43(de3)pro+中表达，并且通过蛋白a亲和色谱法纯化。(hornsby，m.等人ahighthrough-putplatformforrecombinantantibodiestofoldedproteins.mol.cell.proteomics14，2833-2847(2015))。通过sds-page和完整的质谱法评估fab的纯度和完整性。用于抗体药物缀合物的抗rnf43fab的轻链和重链序列分别示于seqidno:326和327中。[0197]dbco-cgs21680的合成。将可商购的cgs21680(caymanchemical，17126，5mg，0.01mmol)添加到在2ml的二甲基甲酰胺中的1.5当量的1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(hatu，6mg，0.015mmol)和4当量的4当量n,n-二异丙基乙胺(7μl，0.04mmol)中并且在室温下搅拌10min。然后，将1.5当量dbco-peg4-胺(broadpharm，bp-23958，5mg，0.015mmol)添加到反应烧瓶中并且在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩。将粗产物通过高效液相色谱法(hplc)纯化。将最终产物冻干并且分离为浅黄色粉末(4.8mg，48％产率)。esi-hrms计算为[m+h+]＝1005.48；实测为1005.54。[0198]工程化抗rnf43fab与氧杂吖丙啶和dbco-cgs21680的缀合。缀合过程的示例性图示提供在图13中。对于与氧杂吖丙啶的缀合，将50μmfab与5摩尔当量的氧杂吖丙啶叠氮化物在室温下在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中一起孵育30min。(a.h.christian等人,aphysicalorganicapproachtotuningreagentsforselectiveandstablemethioninebioconjugation.j.am.chem.soc.141,12657-12662(2019))。将反应用10摩尔当量甲硫氨酸淬灭。将抗体缓冲液交换至pbs中，并且使用0.5-mlzeba7-kda脱盐柱(thermofisherscientific)脱盐。然后，添加10摩尔当量的dbco-cgs21680，并且在室温下孵育过夜。将激动剂标记的缀合物使用0.5-mlzeba7-kda脱盐柱脱盐，以去除过量的dbco-cgs21680。使用xevog2-xs质谱仪(waters)通过完整的质谱法监测每个步骤的完全缀合。在缀合中使用的一些示例性小分子提供在图14中。这并不意在是可以用于缀合的小分子的穷尽列表，并且本领域技术人员应了解基于实用性，什么样的可替代小分子可以与本公开文本中提供的抗原结合剂缀合。[0199]降解测定。将以1百万个细胞/ml的细胞用在完全生长培养基中的抗体药物缀合物、激动剂或拮抗剂处理。24h后，将细胞通过离心(300xg，5min，4℃)沉淀。将细胞沉淀物在冰上用含有completetm迷你蛋白酶抑制剂混合物的ripa缓冲液裂解40min。将裂解物在4℃下在16,000xg下旋转10min，并且将蛋白质浓度使用bca测定归一化。将4xnupagelds样品缓冲液和2-巯基乙醇(bme)添加到裂解物中。将等量的裂解物加载到4％-12％bis-tris凝胶上并且在200v下运行37min。将凝胶在20％乙醇中孵育10min并且然后转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜上。在轻轻振荡的情况下在室温下，将膜在具有0.1％tween20+5％牛血清白蛋白(bsa)的pbs中封闭30min。在pbs+0.2％tween20+5％bsa中在4℃下在轻轻振荡的情况下，将膜与兔抗a2ar(abcam，ab3461，1:1000)和小鼠抗微管蛋白(cellsignalingtechnologies，dm1a，1:1600)一起共孵育过夜。将膜用tris缓冲盐水(tbs)+0.1％tween20洗涤四次并且然后在室温下与在pbs+0.2％tween20+5％bsa中的hrp-抗兔igg(cellsignalingtechnologies，7074s，1:2000)和680rd山羊抗小鼠igg(li-cor，926-68070，1:10000)共孵育1h。将膜用tbs+0.1％tween20洗涤四次，然后用pbs洗涤。将膜首先使用odysseyclximager(li-cor)成像。然后添加supersignalwestpicoplus化学发光底物并且使用chemidoc成像仪(biorad)成像。使用imagestudio软件(li-cor)定量条带强度。示例性结果示出在图15和图16中。具体地，图15示出了24h处理后在molt-4ccr5+细胞中的腺苷2a受体(a2ar)的降解，并且图16示出了cgs21680(激动剂)或zm241385(拮抗剂)的24h处理后的a2ar水平。这些数据表明，可以使用免疫缀合物将rnf43招募到a2ar，以在24小时后以1nm的浓度诱导所述a2ar的降解(图15)。图16是对照，其展示了仅用小分子(100nm激动剂)处理而没有将其与抗rnf43fab缀合对a2ar水平没有影响。[0200]其他靶标包括但不限于cxcr4、ccr5、smoothened、ccr2、ccr9、蛋白酶激活的受体1(par1)、par2、mu阿片类受体、δ阿片类受体、κ阿片类受体和神经激肽受体1。[0201]尽管已经公开了本公开文本的特定替代方案，但是应理解，各种修改和组合是可能的并且涵盖于所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。非正式序列表当前第1页12当前第1页12