一种双端杂交核酸检测基因芯片的制作方法

1.本发明专利涉及分子生物学领域，具体涉及基于dna杂交的核酸检测技术，尤其是双端杂交核酸检测基因芯片技术。


背景技术：

2.核酸杂交技术是分子生物学中常用的核酸检测技术，被广泛应用于微生物病原菌、抗生素抗性基因、与特定性状相关的功能基因等的检测。基于核酸杂交技术设计的基因芯片能够同时分析成千上万条核酸序列，能够短时间内同时实现多种病原菌及抗生素抗性基因的快速检测，在临床医学、畜牧兽医、渔业、农业等领域都有广阔的应用前景。
3.然而，传统的基因芯片通过在引物一端进行荧光标记，与芯片上的寡核苷酸探针进行杂交后采用荧光显微镜或基因芯片扫描仪进行结果检测。引物一端进行荧光标记后不仅会降低引物的扩增效率，而且在同时检测需要不同引物进行扩增的多种核酸序列时，需要设计多条荧光标记的引物，从而增加荧光标记的引物的合成成本。另外，通常仅对正反向引物中的一条引物进行荧光标记，扩增产物在基因芯片上进行杂交后，每条pcr产物只携带一个荧光分子，而通常的检测仪器需要在荧光分子的发射光达到一定的强度才能检测到，因此降低了该技术的检出效率。以上缺陷导致基因芯片检测技术成本高，检出效率低，存在较高的假阳性结果。如何克服以上传统基因芯片技术的缺陷是开发新的核酸检测基因芯片技术的核心问题，也是提高基因芯片技术广泛用于核酸检测的前提。


技术实现要素：

4.本发明专利提供了一种双端杂交核酸检测基因芯片，该基因芯片不仅能够降低了荧光标记探针的合成成本，还通过双杂交技术在pcr产物两端杂交荧光标记，提高了检出效率。该双端杂交核酸检测基因芯片由固定在载玻片上的核酸检测探针、聚合酶链式反应正、反向引物和带有荧光标记的末端杂交探针构成。图1描述了本发明专利所公开的双端杂交核酸检测基因芯片原理图，其中杂交探针簇数量是为了更方便对本发明专利技术进行说明而绘制的，并不是对本发明专利所描述的双端杂交核酸检测基因芯片的技术限制；图1 描述的引物两端与探针互补的序列也是为了方便对本发明专利技术进行说明而引入的，并不是对本发明专利所描述的双端杂交核酸检测基因芯片的技术限制，尽管该序列可以用于本发明专利所描述的双端杂交核酸检测基因芯片，具体应用情况见实施例1。
5.固定在载玻片上的核酸检测探针是根据拟检测的核酸序列设计、与拟检测的核酸序列互补的寡核苷酸探针，并且在3’端采用nh2 c6修饰，以增加探针在玻片上的固定。
6.聚合酶链式反应正、反向引物根据拟检测的核酸序列设计，可以设计特异性引物，也可以设计通用引物。正向引物5’端含有与带有荧光标记的末端杂交探针序列互补的寡核苷酸序列，反向引物5’端含有与有荧光标记的末端杂交探针序列相同的寡核苷酸序列（图1）。
7.带有荧光标记的末端杂交探针为带有荧光标记的寡核苷酸序列，该序列与正向引
物的5’端携带的寡核苷酸序列互补，与反向引物的5’端携带的寡核苷酸序列相同；因此通过该对引物扩增得到的核酸序列两端均携带与荧光标记的末端杂交探针携带的寡核苷酸序列互补的核苷酸序列，这些核苷酸序列在杂交过程中能够与荧光标记的末端杂交探针进行杂交，从而将荧光标记杂交到聚合酶链式反应产物的两端（图1）。
8.另外，在载玻片上设计两种阳性对照探针，其中一种为与带有荧光标记的末端杂交探针上携带的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸探针，用来表征基因芯片的杂交效果；另一种则为聚合酶链式反应阳性扩增对照；用来表征扩增产物在基因芯片上的杂交效果。该芯片每一行都要包含至少一种阳性对照探针，而且每两行必需同时包含两种阳性对照探针；阳性对照探针在每行的数量由每行包含的探针数量决定，一般每五十至一百个检测探针包含一个阳性对照探针，如果每行不足五十个检测探针，则至少应包含一个阳性对照探针。
附图说明
9.图1、本发明专利描述的双端杂交核酸检测基因芯片原理图。
10.图2、本发明专利实施例1中结果图。
具体实施方式
11.以下实施是对本发明专利的进一步说明，而不是对本发明专利技术参数的限制。
12.实施例1采用本发明描述的方法设计了一种检测埃希大肠杆菌（escherichia coli）通用型芯片。而后采用本发明描述的方法设计正向细菌通用引物bact-f和反向细菌通用引物bact-r，以及四环素类抗生素抗性基因特异性正向引物tetf和反向引物tetr。芯片如图2所示，a1位点为与带有荧光标记的末端杂交探针上携带的寡核苷酸序列互补的寡核苷酸探针。a2和b1位点为大肠杆菌培养物提取的dna作为模板进行pcr扩增得到的片段进行杂交后的结果，可认为本发明所描述的第二种阳性对照。b2位点以无菌水替代dna模板进行聚合酶链式反应扩增的阴性对照，b6位为无探针，只有大肠杆菌培养物提取的dna作为模板进行pcr扩增得到的片段和带有荧光分子标记的杂交探针进行杂交得到的结果。b5位点为四环素类抗生素抗性基因阳性扩增产物杂交结果，也可认为本发明所描述的第二种阳性对照。a3、a4和a5位点为三个粪便样品提取的dna采用bact-f和bact-r引物扩增产物进行杂交得到的结果；a6、b3和b4位点为上述三个粪便样品提取的dna采用tetf和tetr引物扩增产物进行杂交得到的结果。以上结果表明利用本发明所描述的双端杂交核酸检测基因芯片能够有效检测三个粪便样品中埃希大肠杆菌和四环素类抗生素抗性基因的含量。


技术特征：
1.一种双端杂交核酸检测基因芯片，其特征是：由固定在载玻片上的核酸检测探针、聚合酶链式反应正、反向引物和带有荧光标记的末端杂交探针构成。2.权利要求1所描述的聚合酶链式反应正、反向引物，其特征是：该正、反向引物能够扩增拟检测的核酸序列，且正向引物5’端含有与带有荧光标记的末端杂交探针序列互补的寡核苷酸序列，反向引物5’端含有与带有荧光标记的末端杂交探针序列相同的寡核苷酸序列。3.权利要求1所描述的带有荧光标记的末端杂交探针，其特征是：由荧光物质标记的一段与聚合酶链式反应正向引物5
‘
端含有的特定寡核苷酸序列互补的寡核苷酸序列。

技术总结
本发明专利公开了一种双端杂交核酸检测基因芯片，由固定在载玻片上的核酸检测探针、聚合酶链式反应正、反向引物和带有荧光标记的末端杂交探针构成，其中聚合酶链式反应正向引物的5’端含有与带有荧光标记的末端杂交探针序列互补的寡核苷酸序列，反向引物的5’端含有与带有荧光标记的末端杂交探针序列相同的寡核苷酸序列。利用本发明专利所描述的双端杂交核酸检测基因芯片能够有效降低传统芯片因合成带荧光标记的聚合酶链式反应引物的成本、同时能够提高核酸杂交后的检出效率。时能够提高核酸杂交后的检出效率。时能够提高核酸杂交后的检出效率。


技术研发人员：倪加加
受保护的技术使用者：广东美立康生物科技有限公司
技术研发日：2021.05.12
技术公布日：2022/11/15