一个对大豆花叶病毒具有抗性的基因GmGRX4及其应用

一个对大豆花叶病毒具有抗性的基因gmgrx4及其应用
技术领域
1.本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一个对大豆花叶病毒sc3株系具有抗性的基因gmgrx4及其应用。


背景技术：

2.大豆花叶病毒病是全球大豆产区普遍存在的一种大豆病害，地域分布很广，危害面积大，毁灭性强。一般情况下，smv引起的产量损失在15
‑
35％，某些地区的重要发生年份，引起的产量损失可达70％以上，甚至绝产。sc3株系是我国多个大豆产区普遍存在的流行株系。鉴于目前没有有效杀灭该病毒的药剂，选育和种植抗病品种是控制该病最经济、有效且对环境友好的防治方法。而获得对大豆花叶病毒具有抗性的基因是选育和种植抗病品种的基础。
3.其中大豆花叶病毒危害寄主的一个重要原因是对寄主叶片细胞光合系统造成影响，导致大豆叶片中叶绿素含量下降，影响光合能力，而且叶绿体在受到侵染的过程中会促进ros的产生，过量的ros会诱导大分子损伤并改变正常的信号传导。grxs蛋白家族是一种二硫键氧化还原酶，通过利用谷胱甘肽(gsh)的还原能力催化底物蛋白的二硫键可逆还原，并在清除细胞ros和调节这些细胞器内的氧化还原稳态中发挥作用。近年来，grxs蛋白在植物对生物和非生物胁迫响应调控中的功能越来越多的被研究，grx通过改变靶蛋白的氧化还原状态，参与了许多细胞功能，例如dna合成，信号传导和抗氧化应激的防御也逐渐被人们所认知，但其在植物中调控对病原物的抗性的报道则少见。因此，grx基因的研究对于挖掘新型的抗病基因并进一步探究其抗感病机制具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明提供的是一个对大豆花叶病毒sc3株系具有抗性的基因gmgrx4(glyma.18g240400),所述基因cdna核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.所述的对大豆花叶病毒sc3株系具有抗性的基因gmgrx4编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.本发明旨在提供上述基因在参与抗大豆花叶病毒sc3株系中的应用，具体是指利用vigs技术，沉默gmgrx4基因后，能改变抗病品种科丰1号的抗病性，变为感病。过表达gmgrx4基因后，能使感病品种南农1138
‑
2获得对大豆花叶病毒sc3株系的抗性。
7.本发明的有益效果：
8.利用菜豆荚斑驳病毒为载体的病毒诱导的基因沉默技术，在抗病大豆品种中沉默gmgrx4基因，在感病品种过表达该基因，综合说明所述基因对大豆花叶病毒sc3株系具有抗性。利用转基因技术在感病品种中导入gmgrx4基因，改良受体品种的抗性，从而保证大豆的产量和品质，提高国家对大豆的供给率。且由于所述基因源于大豆，因此，对转基因大豆的安全性有进一步的提高。
附图说明
9.图1 gmgrx4的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。其中marker为takara的dna marker 5kb ladder，gmgrx4为cdna扩增结果，control为空白对照及阴性对照。
10.图2 gmgrx4基因含有的特殊结构域。通过uniprot网站预测所得，并绘制成图。
11.图3南农1138
‑
2接种bpmv沉默载体后的表型。上图为盆栽接种后，从左往右为pbpmv
‑
ia
‑
v2，pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4。下图为对应叶片放大图。
12.图4南农1138
‑
2接种bpmv过表达载体后的表型。上图为盆栽接种后，从左往右为pbpmv
‑
ia
‑
v4，pbpmv
‑
oe
‑
gmgrx4。下图为对应叶片放大图。
13.图5用rt
‑
pcr检测接种沉默载体pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4及过表达载体pbpmv
‑
oe
‑
gmgrx4，10天后，目标基因gmgrx4的沉默效率及过表达效率。其中marker为takara的dna marker 5kb ladder，1，6：接种磷酸缓冲液的空白对照；2，7:空载pbpmv
‑
ia
‑
v对照；3
‑
5，8
‑
10:pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4植株；1
‑
5:大豆内参基因tubulin检测；6
‑
10：gmgrx4表达量检测；上排为过表达载体的检测结果，下排为沉默载体的检测结果。
14.图6用qrt
‑
pcr检测接种沉默载体pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4及过表达载体pbpmv
‑
oe
‑
gmgrx4。10天后，目标基因gmgrx4的沉默效率及过表达效率。误差线为三次生物学重复的标准误差；左图为gmgrx4沉默载体接种后，相较于pbpmv
‑
ia
‑
v2，gmgrx4的表达量显著降低。右图为gmgrx4过表达载体接种后，相较于pbpmv
‑
ia
‑
v4，gmgrx4的表达量显著提高。
15.图7科丰1号沉默gmgrx4后接种大豆花叶病毒sc3株系，三周后沉默植株与对照植株的表型。上排是为盆栽图，下排是对应叶片放大图。与对照相比，沉默植株具有轻微花叶症状。
16.图8南农1138
‑
2过表达gmgrx4后接种大豆花叶病毒sc3株系，三周后过表达植株与对照植株的表型。上排是为盆栽图，下排是对应叶片放大图。与对照对比，过表达植物正常，无明显花叶症状。
17.图9 das
‑
elisa检测沉默植株及过表达植株中的smv
‑
cp蛋白积累。纵坐标为elisa结束后酶标板在波长405nm处的吸光度；误差线为三次生物学重复的标准误差；从吸光度平均值可以看出接种大豆花叶病毒sc3株系后，南农1138
‑
2过表达植株上的smv病毒cp蛋白积累量远低于对照。科丰1号沉默植株上的smv病毒cp蛋白积累量远高于对照。
具体实施方式
18.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
19.实施例1：gmgrx4基因的获得
20.1.rna的提取：
21.(1)将播种出苗后的大豆科丰1号集嫩叶，将上述叶片约0.1g放入离心管中加入液氮迅速研磨，然后加入1ml trizol(英潍捷基公司)混匀后静置5min；
22.(2)加入0.2ml的三氯甲烷摇晃15sec，静置2min；12000rpm离心10min。
23.(3)吸取400μl上清加入到400μl异丙醇中混匀；离心10min。
24.(4)弃上清，加入1ml 70％的乙醇并涡旋1min；离心5min。
25.(5)弃上清，并置于通风橱晾干；加入50μl的ddh2o备用。
26.2.第一链cdna的合成：
27.第一链cdna的合成使用primescript ii rtase(takara公司)进行。
28.(1)吸取上述rna 1μl(≤2μg)加入到pcr管中，配置下列反应体系：
[0029][0030]
(2)轻柔混匀后进行反转录反应，65℃保温5min后，冰上迅速冷却。
[0031]
(3)上述混合液中，加入如下成分条件如下:
[0032][0033]
(4)混匀后于42℃保温60min即可。
‑
20℃保存备用。
[0034]
3.pcr的扩增与基因克隆
[0035]
(1)根据大豆的全基因数据库(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)，利用primer5.0软件设计特异性引物：
[0036]
上游引物f1：5'
‑
atgtcgtggtgttactgcgctaa
‑
3'，
[0037]
下游引物r1：5'
‑
tccatagcttcaggacaacattgcct
‑
3'。
[0038]
以上述cdna为模板进行pcr扩增，所用扩增酶为takara的primerstar
‑
max
‑
dna
‑
polymerase，pcr反应体系如下：
[0039][0040]
pcr扩增产物使用1％的琼脂糖凝胶在200v的电压下电泳10min，然后使用eb染料染色并在紫外灯下观察拍照，结果如图1。将扩增产物使用axyprep dna凝胶回收试剂盒进行纯化备用，纯化过程全部按照说明书进行。
[0041]
(2)纯化后的片段使用takara的加a反应试剂盒加a后连接到takara的t
‑
vector pmd19(simple)载体上。将连接产物通过热激法转化大肠杆菌菌株dh5a(康为世纪)中，在含有氨苄青霉素的lb固体培养基上培养过夜。挑取单菌落并使用m13引物检测含有目标插入片段的单菌落送公司(滁州通用)进行测序。测序结果在soybean数据库进行比对，发现序列与目标序列一致。结果显示该gmgrx4基因编码的蛋白质为含有一个glutaredoxin蛋白，见
图2。
[0042]
实施例2：gmgrx4基因抗病功能的证明
[0043]
1.gmgrx4的沉默载体的构建
[0044]
利用primer5.0软件设计特异性的沉默片段(如seq id no.3)引物：上游引f2:5'
‑
gcggaatcctctgcatgaggatccacactgtggaaagtctttagt
‑
3'。下游引物r2:5'
‑
gatctctcgaggcctggagtcgacatgtcgtggtgttactgcgc
‑
3'，以构建好的载体pmd19
‑
t
‑
gmgrx4(实施例1构建)为模板，扩增沉默片段。将扩增产物使用axyprep dna凝胶回收试剂盒进行纯化备用。
[0045]
bpmv沉默载体pbpmv
‑
ia
‑
v2用限制酶bamh i和sal i，37℃酶切3h，纯化回收。利用同源重组的方法将沉默片段连接至酶切后的pbpmv
‑
ia
‑
v2载体上，体系如下：
[0046][0047]
反应条件为37℃，1hour，冰上放置5min。转化大肠杆菌感受态dh5α。挑取单克隆，用pbpmv
‑
ia
‑
v2通用引物pcr检测后送公司测序。通用引物如下：
[0048]
bpmv
‑
r2
‑
c2f：5'
‑
tgacattctcctgggaatttccc
‑
3'
[0049]
bpmv
‑
r2
‑
c2r：5'
‑
cacacttcacacatcattacgac
‑
3'
[0050]
测序结果与目标序列比对正确后，选阳性单克隆的菌液进一步培养提取质粒，提取的质粒即为重组沉默载体，命名为pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4。
[0051]
2.gmgrx4的过表达载体的构建
[0052]
利用primer5.0软件设计扩增gmgrx4基因的cds序列的引物：上游引物f3:5'
‑
tagagacaccaaagggaagcctcgagatgtcgtggtgttactgcg
‑
3'.下游引物r3:5'
‑
agcaattgcttagctggggccccgggggacaacattgccttctccaa
‑
3'，以构建好的载体pmd19
‑
t
‑
gmgrx4(实施例1构建)为模板，扩增gmgrx4基因。将扩增产物使用axyprep dna凝胶回收试剂盒进行纯化备用。
[0053]
bpmv过表达载体pbpmv
‑
ia
‑
v4用限制酶xho i和sma i，37℃酶切3h，纯化回收。利用同源重组的方法将gmgrx4基因的cds序列连接至pbpmv
‑
ia
‑
v4酶切后载体，反应体系同上。
[0054]
反应条件为37℃，1hour，冰上放置5min。转化大肠杆菌感受态dh5α。挑取单克隆，用pbpmv
‑
ia
‑
v4通用引物pcr检测后送公司测序。通用引物如下：
[0055]
bpmv
‑
r2
‑
c1f：5'
‑
ctactaaagcacaatttgttagtgg
‑
3'
[0056]
bpmv
‑
r2
‑
c1r：5'
‑
gcagaatggttcctccaactg
‑
3'
[0057]
测序结果与目标序列比对正确后，选阳性单克隆的菌液进一步培养提取质粒，提取的质粒即为重组过表达载体，命名为pbpmv
‑
oe
‑
gmgrx4。
[0058]
3.利用沉默载体沉默科丰1号中目标基因，利用过表达载体过表达南农1138
‑
2中目标基因
[0059]
将pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4，pbpmv
‑
ia
‑
r1m两种质粒(质粒浓度均需达到1ug/ml)按1：1的比例混合，将pbpmv
‑
oe
‑
gmgrx4，pbpmv
‑
ia
‑
r1m两种质粒(质粒浓度均需达到1ug/ml)按1：1的比例混合，采取体外摩擦接种真叶期的南农1138
‑
2，分别产生该基因的沉默发病叶片和过表达发病叶片。接种约十天后，取发病叶片，由图3，4可见：南农1138
‑
2接种混合载体后10天出现花叶症状，说明构建的沉默载体和过表达载体具有正常侵染能力。提取rna并pcr检测，pcr产物送至滁州通用公司测序。经测序比对正确的发病叶片于
‑
80℃保存。
[0060]
含重组沉默载体的发病叶片接种科丰1号，含重组过表达载体的发病叶片接种南农1138
‑
2，并分别接种含pbpmv
‑
ia
‑
r1m+pbpmv
‑
ia
‑
v2，pbpmv
‑
ia
‑
r1m+pbpmv
‑
ia
‑
v4的叶片作为相应的对照,同时接种磷酸缓冲液作空白对照。待发病后取样用于检测目标基因的沉默效率和过表达效率。并在生长出的第一对复叶上接种大豆花叶病毒sc3株系的毒样。
[0061]
4.rt
‑
pcr及q rt
‑
pcr检测gmgrx4的表达量
[0062]
将取得的转基因大豆叶片提取rna，反转录成cdna(步骤见例1)。以大豆看家基因tubulin为内参，利用下列引物进行rt
‑
pcr及qpcr。结果见图5，6，科丰1号接种沉默载体pbpmv
‑
v
‑
gmgrx4后10天，gmgrx4的表达量显著低于接种空载pbpmv
‑
ia
‑
v2的表达量，表明目标基因gmgrx4被有效沉默。南农1138
‑
2接种过表达载体pbpmv
‑
oe
‑
gmgrx4后10天，gmgrx4的表达量显著高于接种空载pbpmv
‑
ia
‑
v4的表达量，表明目标基因gmgrx4被有效过量表达。
[0063]
q pcr
‑
gmgrx4
‑
f：5'
‑
gttgaccccaacacggatct
‑
3'
[0064]
q pcr
‑
gmgrx4
‑
r：5'
‑
agagcagcatcatcgttcca
‑
3'
[0065]
tubulin
‑
f：5'
‑
ggagttcacagaggcagag
‑
3'
[0066]
tubulin
‑
r：5'
‑
cacttacgcatcacatagca
‑
3'
[0067]
5.沉默植株科丰1号，过表达植株南农1138
‑
2接种sc3株系后表型鉴定
[0068]
接种大豆花叶病毒sc3株系三周后，分别对沉默植株科丰1号和过表达植株南农1138
‑
2及照进行表型鉴定，结果见图7：没有沉默gm grx的科丰1号对大豆花叶病毒具有抗性，新生叶片健康，无症状；沉默gm grx的科丰1号出现轻微花叶的症状。结果见图8：过表达gm grx的南农1138
‑
2植株对花叶病毒具有抗性，新生叶片健康，无症状；没有过表达gm grx的南农1138
‑
2植株出现典型的花叶症状。
[0069]
6.das
‑
elisa检测沉默植株及过表达植株中的smv
‑
cp蛋白积累
[0070]
为了进一步确认gmgrx4基因在沉默植株及过表达植株对大豆花叶病毒sc3株系的抗性的减弱或增强，实验选取不同植株接种sc3毒样3周后的上位叶进行大豆花叶病毒cp蛋白的elisa检测。每种处理取3个生物学重复。检测步骤如下：
[0071]
(1)将采集的叶片加入液氮磨碎，加入10倍叶片重量的抽提缓冲液混匀；
[0072]
(2)按照1：800稀释比例用包被抗体缓冲液稀释包被抗体，向每个酶标板的孔中加入稀释后的抗体100μl，室温(21～24℃)放置4小时，然后甩掉板内的液体，每孔加满pbst缓冲液，迅速倒掉。重复6次；
[0073]
(3)每孔中加100μl待测样品，放在保湿盒内室温(21～24℃)放置2.5小时，然后甩掉板内的液体，每孔加满pbst缓冲液，迅速倒掉。重复6～8次；
[0074]
(4)按照1：800稀释比例用酶标抗体缓冲液稀释酶标抗体，向每个酶标板的孔中加入稀释后的酶标抗体100μl，室温(21～24℃)放置2.5小时，然后甩掉板内的液体，每孔加满pbst缓冲液，迅速倒掉。重复8次；
[0075]
(5)向每个酶标板的孔中加入100μl的1mg/ml的ρnpp溶液，避光、室温(21～24℃)下显色30min，加50μl 3m naoh终止反应。
[0076]
(6)在酶标仪405nm波长下，测定光密度值(od)，并计算同一处理不同样品的平均值。elisa检测结果见图9。cp蛋白积累量的elisa结果显示，gmgrx4基因沉默后的科丰1号植株中，其cp蛋白的积累量显著高于对照，gmgrx4基因过表达后的南农1138
‑
2植株，其cp蛋白的积累量显著低于对照，说明大豆gmgrx4基因参与对抗大豆花叶病毒的抗病，过量表达后能够有效降低大豆花叶病毒的侵染。