FLT3-D835Y突变检测的CRISPR-Cas系统及其应用

flt3
‑
d835y突变检测的crispr
‑
cas系统及其应用
技术领域
1.本发明专利涉及crispr
‑
cas系统，尤其是指flt3
‑
d835y突变检测的crispr
‑
cas系统及其应用。


背景技术：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，aml)是最常见的成人急性白血病，其发生发展与多种基因突变相关，尤其是fms样酪氨酸激酶3(fms
‑
like tyrosine kinase，flt3)基因突变。flt3是iii型受体酪氨酸激酶家族成员，其突变见于约三分之一的aml患者。flt3基因突变主要分为两种形式，内部串联重复(internal tandem duplication，itd)和酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain，tkd)的点突变，后者以第835位的天冬氨酸(d)被酪氨酸(y)取代的类型最为常见，简称为flt3
‑
d835y。7％～10％的aml患者为flt3
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d835y阳性，该突变可造成flt3的过度活化，从而促进白血病的发生发展。此外，flt3
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d835y突变还与flt3
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itd阳性aml患者对索拉非尼的耐药性相关，研究表明在患者缓解到复发的过程中，flt3
‑
d835y突变会逐渐积累，是导致复发的主要原因。因此，针对该突变的检测对于aml患者的分型、治疗方案选择和预后判断尤为重要。
3.目前临床上对flt3
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d835y突变的检测主要依赖于第一代和第二代基因测序技术。一代测序虽然可以同时检测多种突变，但是存在敏感性不高的缺点。而二代测序虽然敏感性较高，却价格昂贵且耗时长，不利于患者的及时治疗。而且，测序需要大型测序仪器和专业技术人员，因此依赖测序的检测技术不适合推广普及。此外，文献报道的相关检测技术还有pcr联合ecorv酶切法、单细胞测序法、高效液相色谱法以及ecorv酶切联合巢式pcr法等。这些方法或需要大型仪器，或用时较长，或需要专业人员操作，不适合在基层社区实验室开展和进行床旁检测。


技术实现要素：

4.近年来，基于crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统开发的基因编辑工具为核酸的快速检测提供了极具潜力的新方向。crispr相关的cas12a蛋白可以在针对靶序列设计的crrna的引导下特异性识别和切割靶序列，同时发挥强大的反式酶切活性切割非特异性单链dna(ssdna)。基于cas12a的上述特性，发明人研究开发了一种精准快速的检测方法，用于临床样本中flt3
‑
d835y基因突变的检测。首先，对临床血液样本进行红细胞裂解和离心处理，得到富集的白细胞，使用核酸释放剂释放基因组dna；然后，利用重组酶聚合酶扩增(rpa)技术对包含flt3
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d835位点的dna片段进行扩增；最后，cas12a
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crrna复合物特异性地结合d835y突变型双链dna(dsdna)，激活其非特异性酶切活性，切割与荧光报告分子偶联的单链dna(ssdna)，释放荧光信号。该方法快速、准确且易于操作，无需大型仪器，有潜力成为新型的肿瘤基因突变筛查和床旁检测技术。
5.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，在本发明的第一方面，本发明提供一种flt3
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d835y突变检测的crispr
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cas系统，所述crispr
‑
cas系统
包括cas12a蛋白、crrna、ssdna和fq
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probe。
6.在本发明的技术方案中，所述crrna序列如seq id no.2所示。所述crrna为从15条针对flt3基因d835y突变位点设计的crrna中筛选所得。
7.在本发明的技术方案中，所述ssdna扩增引物包括如seq id no.20所示的上游引物和如seq id no.23所示的下游引物。
8.在本发明的技术方案中，所述fq
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probe序列如seq id no.28所示，所述fq
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probe的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团。
9.在本发明的技术方案中，fq
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probe为被6
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羧基荧光素(6
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fam)和荧光淬灭剂(bhq1)标记的ssdna，标记产物如下：/56fam/tttattt/3bhq1/，命名为ssdna fq reporter/56fam/tttattt/3bhq1/。
10.在本发明的技术方案中，所述crrna的制备方法包括如下步骤：步骤1)：设计并合成序列如seq id no.2所示的crrna；步骤2)：用转录试剂盒对步骤1)获得的crrna进行转录，即得所述crrna。在flt3基因的d835位点附近寻找包含cas12a识别序列(pam)tttn的靶向序列，设计23bp长度的覆盖突变点且与突变型匹配的crrna；完成设计后，制备crrna；
11.所述cas12a蛋白的制备方法包括：对cas12a蛋白核酸序列的原核密码子进行优化获得序列seq id no.16，将其构建到pet28a表达载体上，通过低温诱导可溶蛋白表达，然后经过亲和纯化及分子筛纯化即获得目的蛋白；
12.优选地，所述crrna的制备可通过构建载体puc57
‑
t7
‑
crrna，经体外转录获得目的crrna；或直接合成crrna序列对应的rna。
13.在本发明的技术方案中，所述ssdna的制备方法包括如下步骤：
14.步骤1)：提取待测样本dna；
15.步骤2)：利用如seq id no.20所示的上游引物和如seq id no.23所示的下游引物进行pcr扩增，pcr扩增产物回收，即得到所述ssdna。
16.在本发明的第二方面，本发明还提供一种上述的flt3
‑
d835y突变检测的crispr
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cas系统在制备flt3
‑
d835y突变检测试剂盒或诊断试剂中的应用。
17.在本发明的第三方面，本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括上述的flt3
‑
d835y突变检测的crispr
‑
cas系统。
18.在本发明的技术方案中，所述试剂盒组分在检测体系的含量为cas12a蛋白200ng/μl、crrna1μm、ssdna0.25v/v％和fq
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probe25 pmol/μl。
19.本发明提供的flt3
‑
d835y基因突变快速检测试剂盒的结果判读既可利用酶标仪进行荧光读数，也可在荧光灯下进行肉眼观察。对于本发明中的ssdna fq probe，酶标仪的检测激发光设定为485nm～520nm，肉眼观察使用的荧光灯波长光源为485nm。
20.在荧光检测过程中，若检测样本中含有flt3
‑
d835y突变型dna，则可与cas12a
‑
crrna复合体特异性结合并激活cas12a的核酸内切酶活性，非特异性地切割ssdna fq probe，释放出激活荧光基团，利用酶标仪可检测到上升的荧光读数，而肉眼可观察到荧光灯下的绿色反应。相反地，若检测样本中不存在flt3
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d835y突变，将不会产生上升的荧光读数，肉眼也不会观察到绿色反应。
21.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
22.1、本发明提供了一种灵敏、特异、快速且可视化的基于crispr/cas12a的flt3
‑
d835y突变检测技术。为了保证检测的特异性，所设计的crrna已经过ncbi核酸数据库检索，确定与包括人、动植物和微生物等在内的基因组无高同源性匹配。为了提高crrna对突变型和野生型的区分度，所设计的crrna上被人为引入了一个错配碱基，进一步摒除crrna与野生型结合产生的杂信号。
23.2、本发明涉及的快速检测技术，其检测结果可在荧光灯下进行肉眼直接判读，方便快捷，适合用于床旁检测和推广到基层实验室。
24.3、本发明系首次采用cas12a荧光法检测flt3
‑
d835y基因突变，具有灵敏度较高、特异性强、用时短、操作难度低、不依赖大型实验仪器和昂贵试剂等优势。
附图说明
25.图1为本发明crispr
‑
cas系统对flt3
‑
d835y突变进行检测的流程示意图；
26.图2为不同crrna检测突变体、野生型和水对照的相对荧光值结果示意图；
27.图3为不同rpa引物组合扩增等量质粒所得产物的相对荧光值结果示意图；
28.图4为采用本发明crispr
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cas系统荧光检测flt3
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d835y突变质粒的酶标仪检测灵敏度结果示意图；
29.图5为采用本发明crispr
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cas系统荧光检测flt3
‑
d835y突变质粒的肉眼观察灵敏度结果示意图；
30.图6为采用本发明crispr
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cas系统荧光检测不同突变率质粒的酶标仪检测特异性结果示意图；
31.图7为采用本发明crispr
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cas系统荧光检测不同突变率质粒的肉眼观察结果示意图；
32.图8为采用本发明crispr
‑
cas系统荧光检测15例aml患者血液样本的肉眼观察结果与患者一代测序峰图对比结果示意图。
具体实施方式
33.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
34.本发明中的rpa扩增试剂盒gendx era kit购自先达基因公司；检测所用crrna和ssdna探针合成由南京金斯瑞公司完成；核酸预处理使用先达基因公司的快速核酸释放剂。
35.附图1为由本发明crispr
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cas系统对flt3
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d835y突变进行检测的流程示意图，由本发明crispr
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cas系统对flt3
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d835y突变进行检测包括以下4部分：待测血液样本预处理、核酸释放、cas12a检测体系构建以及荧光检测。
36.实施例1：筛选针对flt3
‑
d835y突变体的crrna
37.1.1核酸制备
38.本实施例中flt3
‑
d835野生型基因片段是扩增自293t细胞系基因组，将之整合到
pgem
‑
tvector上即得到模拟野生型基因组的质粒，利用携带d835y突变的引物扩增质粒全长，再通过自连即可得到模拟突变型基因组的质粒。
39.1.2flt3
‑
d835y突变体特异性crrna的设计和制备
40.在flt3基因的d835位点附近寻找包含cas12a识别序列(pam)tttn的靶向序列，设计23bp长度的覆盖突变点且与突变型匹配的crrna，为了进一步降低wt的杂信号，在crrna上非突变位点处再设计一处错配碱基，共设计15条供筛选；完成设计后，交由南京金斯瑞公司直接合成crrna；
41.本发明提供的crrna序列如表1所示：
42.表1针对flt3
‑
d835y突变体特异性crrna
[0043][0044]
1.3利用pcr产物筛选crrna
[0045]
利用pcr引物(seq id no.17和18，如表2所示)对所构建的野生型和突变型质粒进行扩增，将经axyprep pcr clean
‑
up kit(axygen,ca,usa)纯化的pcr产物用ddh2o稀释调整为1*e10拷贝/μl，取1μl作为检测样品进行cas12a荧光检测反应。
[0046]
表2 pcr引物序列
[0047][0048]
1.4cas12a荧光检测反应
[0049]
本发明采用20μl检测体系，成分如表3：
[0050]
表3 cas12a荧光检测体系
[0051][0052]
对于每一个crrna，均设计检测样品分别为野生型、突变型和ddh2o的三个反应管，以检测和比较交叉反应、灵敏度及背景信号。将混匀的体系置于37℃下反应20min。
[0053]
1.5全波长酶标仪荧光检测
[0054]
将反应后的产物用全波长酶标仪进行荧光检测。其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，读取检测37℃下反应20min时的荧光值。不同crrna检测突变体、野生型和水对照的相对荧光值检测结果如图2所示，结果表明flt3
‑
d835y
‑
crrna2检测的特异性和灵敏度均较好，因此选择flt3
‑
d835y
‑
crrna2作为检测flt3
‑
d835y突变的crrna。
[0055]
实施例2：筛选扩增flt3
‑
d835区域的rpa引物
[0056]
2.1rpa引物设计与合成
[0057]
本实施例利用等温扩增技术对模拟质粒的flt3
‑
d835区域进行预扩增，用于后续的cas12a检测反应。根据等温扩增引物设计的要求，设计出4条for引物与5条reverse引物，序列为seq id no.17至seq id no.24(如表4所示)，交由南京金斯瑞公司直接合成。将for和reverse引物两两搭配，筛选出最高效的引物组合。
[0058]
2.2rpa等温扩增反应
[0059]
本实施例以flt3
‑
d835y模拟质粒为模板筛选rpa扩增引物。根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e4拷贝flt3
‑
d835y模拟质粒的样品。具体操作步骤为：将2.5μl rpa
‑
f，2.5μl rpa
‑
r，1μl模拟质粒样品和42μl反应缓冲液在反应管中混匀，最后加入2μl激活剂混匀，于37℃下反应20min。产物可直接用于下一步检测。
[0060]
表4 flt3
‑
d835区域的rpa扩增引物序列
[0061][0062]
2.3cas12a荧光检测反应
[0063]
本实施例采用20μl检测体系，成分如表3，其中样品为上述反应产物，取5μl检测。不同rpa引物组合扩增等量质粒所得产物的全波长酶标仪荧光检测结果如图3所示。结果表明rpa
‑
f2与rpa
‑
r1引物组合的扩增效率最好，因此选择rpa
‑
f2与rpa
‑
r1作为后面病人样品扩增所用引物。
[0064]
实施例3：flt3
‑
d835基因片段的检测灵敏度
[0065]
本实施例中，为测定采用本发明crispr
‑
cas系统对flt3
‑
d835y的检测灵敏度，根据质粒大小和分子量计算拷贝数，以10倍梯度对待测质粒样品进行稀释，获得每微升含有1*e7、1*e6、1*e5、1*e4、1*e3、1*e2、1*e1和1*e0拷贝数(copy/μl)的测试样。
[0066]
利用如实施例2中所述的荧光检测方法，分别对上述梯度稀释样品进行检测。操作简述如下：取1μl样品作为模板，分别加入到50μlrpa(rpa
‑
f2与rpa
‑
r1引物组合)等温扩增体系中进行扩增，于37℃下反应20min。分别取5μl产物(即ssdna)，加入到20μl表3中所述的cas12a检测体系中，于37℃下反应20min后进行荧光结果判读。
[0067]
本实施例中，荧光结果采用酶标仪检测，检测结果如图4所示，由图可知，采用本发明crispr
‑
cas系统采用酶标仪检测可实现对1*e1拷贝质粒的高灵敏度检出；肉眼直接判读荧光反应时，将37℃下反应20min后的检测体系置于485nm激发光下，肉眼直接观察荧光反应，检测结果如图5所示，阳性结果为反应产物发出绿色荧光，阴性结果为无色，由图可知，采用本发明crispr
‑
cas系统用肉眼直接观察也可实现对1*e1拷贝质粒的高灵敏度检出。
[0068]
实施例4：flt3
‑
d835基因片段的检测特异性
[0069]
本实施例中，为测定采用本发明crispr
‑
cas系统对flt3
‑
d835y的检测特异性，根据质粒大小和分子量计算拷贝数，分别获得每微升含有1*e4拷贝数(copy/μl)flt3
‑
d835野生型和d835y突变型质粒的样品，将二者以不同比例混合得到突变率为100％、50％、25％、10％、1％、0.1％、0％的测试样品。
[0070]
利用如实施例2中所述的荧光检测方法，分别对上述梯度稀释样品进行检测。操作简述如下：取1μl上述样品作为模板，分别加入到50μlrpa(rpa
‑
f2与rpa
‑
r1引物组合)等温扩增体系中进行扩增，于37℃下反应20min。分别取5μl产物(即ssdna)，加入到表3中所述的20μl cas12a检测体系中，于37℃下反应20min后进行荧光结果判读。
[0071]
本实施例中，当模板的总拷贝数为1*e4时，荧光结果采用酶标仪检测，检测结果如图6所示，由图可知，采用本发明crispr
‑
cas系统采用酶标仪检测可实现对1％突变率样品的检出；采用荧光肉眼检测，检测结果如图7所示，采用本发明crispr
‑
cas系统用肉眼直接观察也可实现对1％突变率样品的检出。
[0072]
实施例5：利用cas12a荧光检测法快速检测病人样本
[0073]
本实施例中所用的aml病人骨髓和外周血样本均为按照相关法律法规合格操作获得。
[0074]
首先将200～500μl骨髓或外周血样本与800μl红细胞裂解液混合，颠倒数次充分裂解红细胞，然后涡旋仪离心1min得到富集的白细胞沉淀。向沉淀中加入150μl核酸快速释放剂，于95℃下孵育3min。
[0075]
取1μl孵育产物用于后续rpa和cas12a荧光检测，步骤同实施例2～4，简述如下：分别取1μl核酸释放剂处理产物加入50μlrpa(rpa
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f2与rpa
‑
r1引物组合)反应体系中，混匀后于37℃下反应20min；分别取5μlrpa(即ssdna)反应产物加入到表3中所述的cas12a荧光检测体系中，使总体积为20μl，混匀后于37℃下反应20min。
[0076]
在本实施例中，试验结果如图8所示，由图可知，15例患者样本在荧光灯下的肉眼判读结果与一代测序和二代测序结果吻合，即14例为野生型，1例为25％突变率的flt3
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d835y突变型。
[0077]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。